Summary
在这里，我们描述了一个程序，允许标签
Abstract
虽然爱德华ictaluri是斑点叉尾鮰毛虫的主要病原体，并已发现了近三十年前 1,2，到目前为止，这些作者的知识，没有方法已发展到允许在原位可视化细菌在组织学切片。
虽然细菌的本地化已在以前的研究使用 3，辐射标记 4平板计数，或发光细菌体内确定，这些研究大多只进行总值器官水平，但有一个例外 6 。此限制的特别关注，是因为大肠杆菌ictaluri有一个复杂的感染周期1,7，和它具有的各种致病因素8,9。 E.复杂的相互作用与它的主机ictaluri是在许多方面类似伤寒沙门氏菌10，这是在同一分类家庭。
在这里，我们描述的一种技术，允许检测细菌用间接免疫组织化学，使用单克隆Ed9抗体安斯沃思等11。
简单地说，一个封闭血清应用于石蜡包埋组织切片，以防止非特定招标。然后，部分孵育与初级抗体：E. ictaluri特异性单克隆抗体Ed9。多余的抗体冲洗，加入FITC标记的抗体。冲洗后，部分安装带有荧光的具体安装介质。
这使得对大肠杆菌的检测ictaluri鮰组织的组织切片原位。
Protocol
1。细菌的挑战
- 细菌在一夜之间成长为30 ° C摇脑心浸液肉汤。
- 停止在鱼缸水的循环和添加肉汤100 1浓度（每升10毫升，例如）。
- 一小时后孵化，在坦克重新启动的循环水，其余的细菌冲洗出来。
2。采样
- 采样时间和器官取决于研究的目的，但在我们的研究中，我们使用以下采样点：1，6，16，24，36，48，60，72，96，110，125和175小时后感染。
- 在每一个时间点，安乐死六个鱼浸泡在水含MS222和样品（采样机关的选择是对什么是已知的感染过程中的）以下机关：鳃，沿侧线，肠，脾后的肌肉，肝，胃，心，头肾和躯干肾。
- 采样后，立即组织学磁带加载机关和两个小时在1％福尔马林浸泡。
- 固定两个小时后，从福尔马林50％的乙醇，在那里，直到嵌入保持磁带转移。
- 石蜡嵌入机关通宵使用纸巾- Tek的贵宾3000组织的处理器（樱花TEK，托兰斯，加利福尼亚州）和部分在5μm的，使用了Leica RM2255 microtone（徕卡显微系统，班诺克本，伊利诺斯州）。
3。切片脱蜡
- 沉浸在明确的仪式，让所有的蜡溶解约5分钟，一个充满染色槽部分。电梯机架和排出多余的蜡溶剂。
- 沉浸在一个明确的仪式5分钟，第二个容器的部分。经过几次的使用，取代溶剂之间的第一和第二的容器中的第一个容器和备用。
- 沉浸在100％的酒精部分，除去蜡溶剂。
- 沉浸在第二个100％的酒精槽部分。
- 浸入70％的酒精槽部分。
- 沉浸在运行的自来水，消除酒精的所有痕迹的章节。
4。缓冲液的制备
- 准备磷酸盐缓冲生理盐水溶解到1公升的蒸馏水和pH值8.0 g氯化钠，氯化钾0.2克，1.15克钠2 HPO 4和0.2克的KH 2 PO 4至7.4 。
- PBS稀释到0.9倍，加入900毫升的PBS到100毫升的蒸馏水。
- 准备阻止加入2毫升小鼠血清的血清200μLTRITON - X 100和500μLBSA的50毫升的0.9倍PBS。
- 准备50 mM的碳酸氢盐缓冲液是由溶解在500毫升蒸馏水H 2 O 2.1克碳酸氢钠3和4 g氯化钠和滴定，pH值8.2准备。
5。 Immunhistochemistry
- 补充水分在0.9倍PBS浸泡的部分。
- 孵育30分钟，在阻断血清的幻灯片。
- 孵育Ed9（100阻断血清稀释1）在一个不透明的湿盒内室温两小时的部分。
- 冲洗部分PBS中4次，每次10分钟。
- 在一个不透明的湿盒内室温孵育50μL二次抗体（羊抗鼠FITC标记的抗体，阻止血清稀释500倍）在两小时的部分。
- 冲洗部分缓冲液中的碳酸氢盐的3倍。
- 在去离子水冲洗部分简要。
6。安装
- 离开幻灯片，在黑暗中干燥几分钟。
- 安装使用permafluor。
- 安装介质来过夜，在黑暗阴凉的环境中，干燥，优先许可。
7。显微镜
- 组织切片观察，荧光显微镜下。在我们的实验中，我们使用奥林巴斯BX51显微镜配备了三重（FITC; MCA得克萨斯红）过滤器。相框软件（MicroFire，Goleta，加利福尼亚州）。
8。代表性的成果：
由于鱼组织的自体荧光是如此之高，这些组织会出现下脐橙的三滤，方便地提供了一个细菌的背景。
在此背景下，个体FITC染色细菌会出现明亮的绿色圆点，在200X棒状将识别（图1）。
坏的部分，可以构成假阳性（由于在冲洗阶段的问题），在这种情况下，会出现大量的细菌统一目前在幻灯片上。
图1一块肌肉的显微照片显示两个五部分。 ictaluri（箭头A和B）（200X）。
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图2实验的总体方案 。
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Discussion
该协议的细节在组织切片中的鲶鱼病原体爱德华ictaluri原位可视化技术。据我们所知，这是描述的第一个此类协议。
最关键的一步，在我们的经验，是在作为本议定书不足洗涤步骤4.4中所述的抗体冲洗，可能会导致假阳性。
这项技术的结果与解释的主要问题是组织的自体荧光。然而，人们发现，使用三滤，主要是解决问题的非特异性荧光绝大多数发生以外的绿色荧光光谱。此外，虽然这项技术是相当敏感，它可能会失败，检测细菌负荷低。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者希望认识到，发展援助和进行免疫组化米歇尔巴内斯的技术援助以及佩特里 - 汉森博士，博士鳗鱼和Timothy Brown评论。该项目是由美国农业部（USDA）CRIS项目＃MISV - 0801310和密西西比州立大学兽医学院。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Infusion broth | BD Biosciences | 237200 | |
| MS222 | Argent Labs | ||
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 | |
| Goat anti-mouse FitC | SouthernBiotech | 1010-04 | |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S-9390 |
References
- Plumb, J. A. Fish Diseases and Disorders. Woo, P. T. K., Bruno, D. W. , CABI Publishing. New York. Vol. 3 479-479 (1998).
- Roberts, R. J. Fish Pathology. , third ed, WB Saunders. (2001).
- Lawrence, M. L. Louisiana State University. , (1997).
- Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
- Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
- Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
- Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
- Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
- Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
- Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
- Hook, E. W. Principles and Practices of Infectious Diseases. Mandell, G. L., Douglas, G. Jr, Bennett, J. E. , Vol 1 1700-1700 (1990).
- Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).
