Summary
在这里,我们描述了一个程序,允许标签
Abstract
虽然爱德华ictaluri是斑点叉尾鮰毛虫的主要病原体,并已发现了近三十年前 1,2,到目前为止,这些作者的知识,没有方法已发展到允许在原位可视化细菌在组织学切片。
虽然细菌的本地化已在以前的研究使用 3,辐射标记 4平板计数,或发光细菌体内确定,这些研究大多只进行总值器官水平,但有一个例外 6 。此限制的特别关注,是因为大肠杆菌ictaluri有一个复杂的感染周期1,7,和它具有的各种致病因素8,9。 E.复杂的相互作用与它的主机ictaluri是在许多方面类似伤寒沙门氏菌10,这是在同一分类家庭。
在这里,我们描述的一种技术,允许检测细菌用间接免疫组织化学,使用单克隆Ed9抗体安斯沃思等11。
简单地说,一个封闭血清应用于石蜡包埋组织切片,以防止非特定招标。然后,部分孵育与初级抗体:E. ictaluri特异性单克隆抗体Ed9。多余的抗体冲洗,加入FITC标记的抗体。冲洗后,部分安装带有荧光的具体安装介质。
这使得对大肠杆菌的检测ictaluri鮰组织的组织切片原位。
Protocol
1。细菌的挑战
- 细菌在一夜之间成长为30 ° C摇脑心浸液肉汤。
- 停止在鱼缸水的循环和添加肉汤100 1浓度(每升10毫升,例如)。
- 一小时后孵化,在坦克重新启动的循环水,其余的细菌冲洗出来。
2。采样
- 采样时间和器官取决于研究的目的,但在我们的研究中,我们使用以下采样点:1,6,16,24,36,48,60,72,96,110,125和175小时后感染。
- 在每一个时间点,安乐死六个鱼浸泡在水含MS222和样品(采样机关的选择是对什么是已知的感染过程中的)以下机关:鳃,沿侧线,肠,脾后的肌肉,肝,胃,心,头肾和躯干肾。
- 采样后,立即组织学磁带加载机关和两个小时在1%福尔马林浸泡。
- 固定两个小时后,从福尔马林50%的乙醇,在那里,直到嵌入保持磁带转移。
- 石蜡嵌入机关通宵使用纸巾- Tek的贵宾3000组织的处理器(樱花TEK,托兰斯,加利福尼亚州)和部分在5μm的,使用了Leica RM2255 microtone(徕卡显微系统,班诺克本,伊利诺斯州)。
3。切片脱蜡
- 沉浸在明确的仪式,让所有的蜡溶解约5分钟,一个充满染色槽部分。电梯机架和排出多余的蜡溶剂。
- 沉浸在一个明确的仪式5分钟,第二个容器的部分。经过几次的使用,取代溶剂之间的第一和第二的容器中的第一个容器和备用。
- 沉浸在100%的酒精部分,除去蜡溶剂。
- 沉浸在第二个100%的酒精槽部分。
- 浸入70%的酒精槽部分。
- 沉浸在运行的自来水,消除酒精的所有痕迹的章节。
4。缓冲液的制备
- 准备磷酸盐缓冲生理盐水溶解到1公升的蒸馏水和pH值8.0 g氯化钠,氯化钾0.2克,1.15克钠2 HPO 4和0.2克的KH 2 PO 4至7.4 。
- PBS稀释到0.9倍,加入900毫升的PBS到100毫升的蒸馏水。
- 准备阻止加入2毫升小鼠血清的血清200μLTRITON - X 100和500μLBSA的50毫升的0.9倍PBS。
- 准备50 mM的碳酸氢盐缓冲液是由溶解在500毫升蒸馏水H 2 O 2.1克碳酸氢钠3和4 g氯化钠和滴定,pH值8.2准备。
5。 Immunhistochemistry
- 补充水分在0.9倍PBS浸泡的部分。
- 孵育30分钟,在阻断血清的幻灯片。
- 孵育Ed9(100阻断血清稀释1)在一个不透明的湿盒内室温两小时的部分。
- 冲洗部分PBS中4次,每次10分钟。
- 在一个不透明的湿盒内室温孵育50μL二次抗体(羊抗鼠FITC标记的抗体,阻止血清稀释500倍)在两小时的部分。
- 冲洗部分缓冲液中的碳酸氢盐的3倍。
- 在去离子水冲洗部分简要。
6。安装
- 离开幻灯片,在黑暗中干燥几分钟。
- 安装使用permafluor。
- 安装介质来过夜,在黑暗阴凉的环境中,干燥,优先许可。
7。显微镜
- 组织切片观察,荧光显微镜下。在我们的实验中,我们使用奥林巴斯BX51显微镜配备了三重(FITC; MCA得克萨斯红)过滤器。相框软件(MicroFire,Goleta,加利福尼亚州)。
8。代表性的成果:
由于鱼组织的自体荧光是如此之高,这些组织会出现下脐橙的三滤,方便地提供了一个细菌的背景。
在此背景下,个体FITC染色细菌会出现明亮的绿色圆点,在200X棒状将识别(图1)。
坏的部分,可以构成假阳性(由于在冲洗阶段的问题),在这种情况下,会出现大量的细菌统一目前在幻灯片上。
图1一块肌肉的显微照片显示两个五部分。 ictaluri(箭头A和B)(200X)。
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图2实验的总体方案 。
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Discussion
该协议的细节在组织切片中的鲶鱼病原体爱德华ictaluri原位可视化技术。据我们所知,这是描述的第一个此类协议。
最关键的一步,在我们的经验,是在作为本议定书不足洗涤步骤4.4中所述的抗体冲洗,可能会导致假阳性。
这项技术的结果与解释的主要问题是组织的自体荧光。然而,人们发现,使用三滤,主要是解决问题的非特异性荧光绝大多数发生以外的绿色荧光光谱。此外,虽然这项技术是相当敏感,它可能会失败,检测细菌负荷低。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者希望认识到,发展援助和进行免疫组化米歇尔巴内斯的技术援助以及佩特里 - 汉森博士,博士鳗鱼和Timothy Brown评论。该项目是由美国农业部(USDA)CRIS项目#MISV - 0801310和密西西比州立大学兽医学院。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Brain Infusion broth | BD Biosciences | 237200 | |
MS222 | Argent Labs | ||
Whole mouse Serum | Cappel | 55989 | |
Goat anti-mouse FitC | SouthernBiotech | 1010-04 | |
Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 85040C | |
Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
Sodium chloride (NaCal) | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S-9390 |
References
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