Summary
Dying hücreler komşu hücrelerle birlikte daralma bariyer fonksiyonunu bozmadan epitel dokuların ekstrüde. Gelişmekte zebrafish optik netlik epitel yaşam ekstrüzyon görselleştirmek için mükemmel bir sistem sağlar. Burada hücresel çözünürlükte larva zebrafish epidermisin neden ve görüntü ekstrüzyon yöntemleri açıklanmaktadır.
Abstract
Epitel dokuların Homeostatik bakım bariyer fonksiyonunu bozmadan hasarlı hücreleri sürekli çıkarılmasını gerektirir. Çalışmalarımız, ölmekte olan hücrelerin kendi çıkışına neden olabilir herhangi bir boşluk kapanış ise epitel yaprak dışarı çıkar, aktin ve miyozin bir halka oluşturacak ve sözleşme canlı komşuları sinyalleri göndermek bulduk, bir süreç olarak adlandırılan hücre ekstrüzyon 1. Gelişmekte zebrafish optik netlik epitel yaşam ekstrüzyon görselleştirmek için mükemmel bir sistem sağlar. Burada larva zebrafish epidermiste neden ve görüntü ekstrüzyon yöntemi açıklanmaktadır. Ekstrüzyon görselleştirmek için, epidermisin yeşil floresan protein tek hücreli aşamasında ifade transgenik zebrafish embriyolar F-aktin kırmızı floresan proteini etiketli prob enjekte ve larvaları için G418 ek apopitoz indükleyen. Daha sonra apoptotik hücre ekstrüzyon sürecinde aktin dinamikleri ve epitelyal hücre davranışlarını gözlemlemek için dönen bir disk konfokal mikroskop zaman atlamalı görüntüleme kullanın. Bu yaklaşım bize canlı epitel ekstrüzyon işleminin araştırmak için izin verir ve apoptotik hücreleri ortadan kaldırmak için başarısızlık neden olduğu hastalık durumlarını incelemek için bir yol sağlayacak.
Protocol
Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon sırasında Aktin Dinamiği Görselleştirme için temel iş akışı
Gelişmekte olan zebrafish epidermisin iki farklı katmanları, yüzey tabakası (veya periderm) ve bazal membran 2 kontak hücrelerinin bazal tabaka oluşur. Dış yüzey tabakasının hücrelerde apoptozis geçmesi ve ekstrüzyon 3 (Şekil 1) doku ortadan kalkar. Bu sürecin gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için, yeşil flüoresan protein (GFP ifade tek hücreli aşama transgenik zebrafish utrophin, bir aktin bağlayıcı protein (RFP-UtrCH) 4,5, calponin homoloji etki alanı erimiş RNA kodlama kırmızı floresan proteini enjekte ) tabakalı epitel organizatörü sitokeratin 8 6 (Şekil 2A) altında. RFP-UtrCH yayg RNA enjeksiyondan sonra hayvan ifade olmasına rağmen, biz, hem RFP ve GFP özellikle epidermis (Şekil 2B) aktin dinamikleri takip etmek ifade yüzeysel epidermal hücreleri üzerinde odaklanır . Daha sonra apoptotik hücre ekstrüzyon ve görüntü dönen bir disk konfokal mikroskop kullanılarak epidermis ve aktin filamentler neden ve 4D veri setleri elde etmek için G418 ile larva davranın.
Deney başlayarak önce
- In vitro Lineerleştirilmiş DNA şablonu mMessage mMachine SP6 kiti (Ambion) kullanarak bir RNA uyarlamak ve RNeasy Mini kiti (Qiagen) kullanılarak kapaklı RNA arındırmak. -80 3-5μl alikotları ve mağaza ° C, enjeksiyon için hazır olana kadar steril su kullanılarak ~ 60ng/ul RNA sulandırınız olun. Not: RNA bozulmasını önlemek için tekrarlayan donma / çözülme kaçının.
- 100 x 15mm kültür plakasına E3 embriyo orta (E3)% 2'lik agaroz 40ml dökme ve bu tepsiyi mikroenjeksiyon kalıp yerleştirerek (Adaptif Bilim Araçlar, # I-34), enjeksiyon sırasında embriyoların tutmak için bir kalıp olun. Agaroz katılaşmış sonra, agaroz olukları maruz kalıp çıkarın. 4 kullanılmak üzere ° C kadar hazır plaka saklayın.
- Filamentler (OD 1.0mm ID 0.78, 10 cm uzunluğunda) ve aşağıdaki ayarları (485 Isı, Pull 50, Hız 60, Delay / Zaman 90, Basınç 200 Sutter P-97-Pipet Çektirme borosilikat cam kullanarak enjeksiyon için kılcal iğneler çekin .) Not: Farklı türlerde cam listelenen koşulların optimizasyonu gerekecektir.
- 1% 42 E3 ve mağaza 1mL alikotları Düşük eritin (LM) agaroz ° C Makyaj Stoklarından E3 buharlaşma agaroz konsantrasyonu artırabilir dikkatli olun.
- Düzenli 14 saat ışık ve karanlığın 7 10 saat ışık / karanlık döngüsü, standart laboratuvar koşullarında yetişkin zebrafish koruyun. Gece önce denemeyi, 3 kadın ve 2 erkek bir bölücü tarafından ayrı bir tank koyarak arkadaşı balık. Ertesi sabah, tanktaki su değişimi ve ışıkları geldiğinizde bölücü çekin.
1. Kodlama floresan Takip edilen Aktin Bağlayıcı Protein RNA Enjeksiyon
- Buz üzerinde RNA çözülme. RNA ~ 30ng/μl son bir RNA konsantrasyonu için 1:1 oranında% 0.5 fenol Kırmızı ekleyin ve tekrar dolum çekti kılcal bir iğne 1μl çözüm yük.
- Toplayın ~ 75 1-hücreli aşamasında 8 CK: E3 GFP embriyolar. Pipetleyin FST Dumont # 5 forseps ile çukur embriyolar 5 ile mikroenjeksiyon kalıp içine embriyolar toplanan ¾ yeniden süspanse edin ve yavaşça şark. Not: enjekte edilen RNA mozaik ifadesinde neden olabilir, çok hücreli aşamadır embriyo, enjekte önlemek için hızlı bir şekilde çalışmak için özen gösterin.
- Standart bir laboratuvar diseksiyon stereomikroskopta altında RNA, basınç kontrollü mikroenjektör (Harvard Apparatus PLI-100 Pico-Enjektör) kullanarak embriyo sarısı içine enjekte edilir. Kırmızı bir nokta (fenol kırmızısı), enjeksiyondan sonra embriyo görünür olmalıdır. Her deneme için en az 50 embriyolar enjekte edilir. (RNA zebrafish embriyolar 9 içine enjeksiyon ayrıntılı bir protokol için önceki vallahi protokol). Not:
- ~ 2nl bir ses, tek hücreli aşamada embriyolara RNA enjeksiyon için kullanılmalıdır. RNA bolus enjekte RNA miktarını belirlemek için, mineral yağ, kalibre edilmiş bir mikrometre slaytta bir damla içine veya göz mercekleri yerleşik bir ölçek çubuğu ile mikroskop altında dağıtmak. RNA damlacık mükemmel bir küre olmalıdır. Cilt (nl) = 4/3πr 3: denklem kullanılarak teslim miktarını hesaplayın. Cihaz üzerinde enjeksiyon basıncı ya da zaman değiştirerek teslim edilen ses seviyesini ayarlayın.
- Bakım RNA gelişmekte olan embriyonun yüksek konsantrasyonlarda toksik olabilir, fluorofor görselleştirme sağlayan RNA düşük miktarda enjekte alınmalıdır. Uygun ifade düzeyini belirlemek için, deney başlamadan önce bir doz eğrisi deney yapılabilir olmalıdır. </ P>
- Herhangi bir gübresiz veya hasarlı yumurta kaldırmak ve 28,5 az kalan tüm embriyolar embriyolar Sırala ° C.
- 24 saat sonra, GFP (epidermis) ve TTT (aktin) floresan yüksek düzeyde zebrafish embriyolar seçmek için floresan bir diseksiyon mikroskobu kullanın. 28.5 Seçilen embriyolar yerleştirin ° C apoptozis ikna etmek için ilaç tedavisi ile devam etmek için hazır olana kadar.
2. Zebra balığı Larva kullanarak G418 Hücre Ekstrüzyon indüksiyonu
Aminoglikozid antibiyotik G418 veya Geneticin, maruz kalma, bilinmeyen bir mekanizma ile gelişmekte olan Zebra balığı larvaları 3 apoptoz ve epidermal hücrelerin ekstrüzyon neden olduğunu buldular . Önemlisi, bu tedavinin sadece 4 gün sonra döllenme ve büyük larvaları üzerinde çalışır. Biz ~ 5-25 hücre, herhangi bir zamanda G418 tedavi larva Zebra balığı yüzgeci epitel ekstrüzyon bulundu olabilir bulabilirsiniz. Apoptotik ekstrüzyon hücrelerinin balık balık miktarı değişebilir, görüntüleme için birden fazla balık montaj önerilir.
- Toplayın ve 4 gün sonrası fertilizasyon (dpf) Zebra balığı larvaları E3 3 mililitre (mL) içeren bir 35 x 10mm kültür çanak içine GFP ve RFP floresan sergileyen bir yer. Bir larvaları bu boyutu kültürü çanak 25 davranabilirsiniz.
- Dikkatle 28.5 ° C'de 4 saat süreyle ilaç G418 ve inkübe larvaların E3 içeren 1mg/ml 3mLs medya yerine G418 ışığa karşı hassastır, bu yüzden kültür çanak kapalı ya da karanlıkta tutmaya özen gösterin.
- Medya çıkarın ve% 0.02 Tricaine içeren önceden ısıtılmış 28.5 ° C E3 medya ile değiştirin ve larvaların montaj geçin.
3. Görüntüleme Montaj Zebra balığı Larva
- 1,5 ml Eppendorf tüp 3 larva transferi ve tüp altına balık lavabo sonra E3 en çıkarmak. Biz agaroz katılaşır önce 3 hayvan kadar düzgün bir şekilde monte edilebilir olduğunu bulduk.
- Mattek kültür çanak alt coverglass üzerine bir kesim pipetlemeyin ucu, pipetlemeyin 120ul tüpe% 1 LM-agaroz (42 ° C), mix ve sonra hafifçe pipetlemeyin larvaları ve agaroz karışımı kullanma.
- Mattek çanak coverglass karşı düz ve düz iğne yönlendirmek, böylece hızlı, larvaları bağlı bir ekleme pin veya tungsten bir FST pin tutucu kullanma.
Not: Genellikle örneklerin zarar görmesini önlerken coverglass karşı düz sağlamak için ilk şark larva ve daha sonra bir L-şekilli pin düz bir iğne kullanın. - Agaroz katılaşmış, yavaşça E3 Tricaine% 0.02 içeren çanak doldurun. Not: Alternatif olarak, 1mg/ml G418 uzun süreli maruz kalma larvaları öldürmek rağmen G418, indükleyici ekstrüzyon devam etmek için görüntüleme çanak E3 ilave edilebilir.
4. İplik Disk Konfokal Mikroskop kullanarak Hücre Ekstrüzyon sırasında Aktin Dinamiği ve Bireysel Epitel Hücre Davranışları Canlı Görüntüleme
Biz Zebra balığı larva geliştirme epidermis apoptotik hücre ekstrüzyon tüm süreç, yaklaşık 20 dakika 3 sürdüğünü buldular . Burada ekstrüzyon işlemini görselleştirmek için, zebrafish epidermisin tek bir katman aracılığıyla bir dizi z uçaklar toplamak için bir zaman atlamalı görüntüleme deneyi nasıl kurulum göstermektedir. Biz tipik widefield floresan mikroskoplar önemli aktin filamentler photobleaching ve timelapse görüntüleme için izin vermez neden olduğunu buldular. Bu nedenle, bizim çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak ve photobleaching önlemek için, dönen bir disk konfokal mikroskop kullanın. Aşağıda ele alınan ilkeler benzer mikroskop set-up uygulanabilir olmasına rağmen, Nikon mikroskop ile Andor IQ yazılımı kullanarak deney nasıl ayarlanacağı açıklanmaktadır.
- Birincisi, Argon (488nm GFP eksitasyon) ve HeNe (561nm RFP eksitasyon) lazerler, mikroskop, kamera ve epifluorescent lamba açmak.
- Andor IQ yazılımı (sürüm 1.10.1) içinde, görüntü istediğiniz dalga boylarını içeren bir zaman serisi protokolü oluşturmak, görüntü yakalar ve sayısı kat arasında aralıklarla frekans yakalama tekrar edilmelidir.
- Mikroskop sahnede örnek içeren Mattek çanak yavaşça yerleştirin ve larvaları odaklanmak için iletilen ışık 20x objektif kullanın.
- Doğru konuma 40X suya daldırma hedefi (NA 0.8) taşıyın. Bu hedefe kullanarak, alt hücresel aktin dinamikleri sorununu çözerken, ekstrüzyon sırasında hücresel davranışları takip sağlar alan başına yaklaşık 20-25 hücreleri filmi. Not: Aynı montaj ve uzun bir çalışma mesafesi ile 40X bir suya daldırma hedefi olmalıdır rağmen görüntüleme stratejileri, dik mikroskoplar uygulanabilir.
- 40x objektif üstüne bir damla su dikkatlice yerleştirin ve hızlı bir şekilde üst Mattek çanak yerleştirin. Değile: suyun buharlaşma bir sorun olup olmadığını Zeiss Immersol daldırma çözümü de kullanılabilir.
- Faz ya da DIC aydınlatma kullanarak örnek tanımlamak ve sonra GFP pozitif epidermisin özellikle odak 488nm Epifloresans kullanın.
- Konfokal tarama modunu açın. Lazer yoğunluğu ve buna göre kanalların her biri için pozlama süresi (488nm ve 561nm) ayarlayın. Maruz kalma sinyali optimum tespiti için lazer güç ve zaman denge ve herhangi bir photobleaching veya toksisite önlemek için özen gösterin.
- Ekstrüzyon hücreleri tanımlamak için, GFP etiketli epidermisin görselleştirmek ve ortasında bir küçük yuvarlak hücreli çevreleyen hücrelerden oluşan bir koleksiyon oluşan klasik bir rozet desen, bir hücre grubu tanımlamak için Epifloresans kullanın. Konfokal tarama modunu kullanarak, RFP etiketli aktin ortasında küçük yuvarlak hücre, hücre ekstrüzyon bir işaretidir etrafında bir halka olarak görünür bir birikimi de olması gerekir. Bir kere hızlı bir şekilde 4D (XYZ-Time) konfokal veri setleri elde etmek için mikroskop kurmak, ekstrüzyon hücre belirledik.
- Ekstrüzyon hücre de dahil olmak üzere epidermisin bir tek katman, görselleştirmek, ve adım boyutu seçmek için z düzlemi içinde alt ve üst noktaları ayarlayın. Time-lapse görüntüleme, görüntü yakalama ve tekrarlama sayısı aralıklarında ayarlayabilirsiniz. Örneğin, tipik olarak 1 mikron bir adım boyu, 30 dakika boyunca her 1-2 dakikada bir, 5-10μm kapsayan bir z-serisi kazanır.
- Verileri görüntülemek için, biz genellikle z serisi 3-D projeksiyonları yapmak ve Quick Time (Apple) ile uyumlu bir film dosyası olarak ayarlanmış verileri kaydetmek. Bu şekilde, kasılma aktin halka ve zamanla ölüyor hücre etrafında oluşan epitel davranışlar görselleştirmek.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 apoptotik hücre ekstrüzyon şematik. Aktin filamentleri kırmızı ile gösterilen, GFP pozitif epidermal hücreler yeşil.
Şekil 2. Deneysel İş Akışı. A. deney için iş akışının şematik. B. 4dpf CK: GFP zebrafish epidermis RFP-UtrCH ifade.
Şekil 3 Hala epitel hücre ekstrüzyon işlemi sırasında canlı aktin dinamiklerini yakından takip eden bir time-lapse kare (z-projeksiyonları). Oklar, 2 dakika boyunca sözleşmeler ve kapatır komşu hücreleri tarafından oluşturulan aktin halka göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol canlı bir epitel doku ekstrüzyon işlemini görselleştirmek için basit ve kolay bir yöntem gösteriyor. Bu tür deney bize sabit doku analizleri önceden takdir aktin dinamiklerinin inceliklerini incelemek için izin verir ve bu nedenle, ortak immunofluorescent yöntemleri tamamlar. Biz, inflamatuar yanıtlar ya da hasar gören hücrelerin birikimine yol açacaktır beklediğimiz apoptotik hücreleri, uzaklaştırmak ve temizlemek için yetmezliği ile ilişkili ekstrüzyon süreci ve çalışma hastalık durumlarında daha iyi analiz etmek, kimyasal inhibitörleri ya da genetik mutantlar ile birlikte bu protokolü kullanabilirsiniz kanser görülebilir. Örneğin, bizim daha önce laboratuarımızda kimyasal inhibitörler yönde bir hücre extrudes 3 etkileri, hücre bazolateral yüzeyi boyunca aktin filamentler hedefleme değiştirmek için G418 ile birlikte kullanılabileceğini göstermiştir . Bir sınırlama geçerli yöntemi, hücre ölümü stokastik ve öngörülemeyen doğası nedeniyle, veri setleri ekstrüzyon sonraki aşamalarında odaklanma eğilimindedir. Çok hücreli aktin halka ve daralma başlatılması oluşumunu incelemek için, gelecekteki deneyler, genetik, hücre ölümü 10 için hedeflenen floresan etiketli epitel hücrelerinin bir alt kümesi apoptozisi indükleyen teknikleri uygulanacaktır. Epidermisin görüntü aktin dinamikleri yöntemi ile bu stratejiyi birleştiren apoptotik hücre ekstrüzyon giden ilk adımlar çalışmaları kolaylaştırmak gerekir. Birlikte, Bu deneylerde elde edilen bilgi epitel hücre ekstrüzyon ve tıbbi önemi anlayışımızın önemli katacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hayvan Refahı Güvencesi
Zebra balığı, Danio rerio kullanarak bu protokolde yapılan tüm işlemler, Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve Utah Üniversitesi (Hayvan Refahı Güvence # 10-07.017) Komitesi (IACUC) kullanın.
Acknowledgments
Biz bilimsel tartışma, öneri ve görüşleriniz için Rosenblatt laboratuvar üyeleri teşekkür ederim. GFP transgenik zebrafish: Biz de nazik CK plazmid kodlama RFP-UtrCH ve David Grunwald veren Mary Halloran teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, Gretchen Kral ve Zebra balığı mükemmel bir bakım ve özen Utah Üniversitesi'nde Merkezi Zebra balığı Kaynak personeli. Bu çalışma, JR için OD002056-01 DP2 NIH-NIGMS NIH Direktörü Yeni Yenilikçisi Ödülü 1 tarafından desteklenmiştir. GTE NIH Multidisipliner Kanser Eğitim Programı Hibe 5T32 CA03247-8 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR international | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Co. | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments, Inc. | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus Corporation | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
- Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium. J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).
- Burkel, B. M., Dassow, G. von, Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
- Gong, Z. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , 4th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
