Summary
Cellules qui meurent sont extrudés à partir des tissus épithéliaux par la contraction concertée des cellules voisines, sans perturber la fonction de barrière. La clarté optique de développement du poisson zèbre offre un excellent système pour visualiser l'extrusion dans la vie épithéliums. Nous décrivons ici les méthodes d'induire et d'extrusion d'image dans l'épiderme zebrafish larvaire à une résolution cellulaire.
Abstract
L'entretien homéostatique des tissus épithéliaux exige le retrait continu des cellules endommagées, sans perturber la fonction de barrière. Nos études ont montré que les cellules meurent envoyer des signaux à leurs voisins en direct à la forme et le contrat d'un anneau d'actine et la myosine qu'elle éjecte hors de la feuille épithéliales lors de la fermeture des lacunes qui pourraient avoir résulté de sa sortie, un processus appelé extrusion 1 cellule. La clarté optique de développement du poisson zèbre offre un excellent système pour visualiser l'extrusion dans la vie épithéliums. Nous décrivons ici une méthode pour induire et d'extrusion d'image dans l'épiderme zebrafish larvaire. Pour visualiser l'extrusion, nous injectons une sonde protéine fluorescente rouge étiqueté pour la F-actine dans des embryons stade unicellulaire poisson zèbre transgénique exprimant la protéine fluorescente verte dans l'épiderme et induisent l'apoptose par addition de G418 pour les larves. Nous utilisons ensuite imagerie time-lapse sur un microscope confocal à disque rotatif pour observer la dynamique de l'actine et les comportements des cellules épithéliales au cours du processus d'extrusion cellulaire par apoptose. Cette approche nous permet d'étudier le processus d'extrusion en direct épithéliums et fournira une avenue à étudier les états pathologiques causés par le défaut d'éliminer les cellules apoptotiques.
Protocol
Workflow de base pour la visualisation de la dynamique d'actine lors de l'extrusion cellulaire de l'épiderme du poisson zèbre développement
L'épiderme du poisson-zèbre en développement est composé de deux couches distinctes, la couche de surface (ou périderme) et une couche basale de cellules que le contact de la membrane 2 sous-sol. Les cellules de la couche de surface extérieure apoptose et sont éliminés du tissu par extrusion 3 (figure 1). Pour visualiser ce processus en temps réel, nous injectons ARN codant pour une protéine fluorescente rouge fusionnée au domaine d'homologie calponine de l'utrophine, une protéine liant l'actine (DP-UtrCH) 4,5, dans un stade de cellules transgéniques exprimant le poisson-zèbre protéine fluorescente verte (GFP ) sous le stratifié promoteur épithélium cytokératine 8 6 (figure 2A). Bien que DP-UtrCH est exprimée de manière ubiquitaire dans l'animal après l'injection d'ARN, nous nous concentrons sur les cellules superficielles épidermiques qui expriment à la fois DP et GFP de suivre la dynamique d'actine spécifiquement dans l'épiderme (figure 2B). Nous avons ensuite traiter les larves avec G418 pour induire l'extrusion de cellules apoptotiques et l'image des filaments d'actine et de l'épiderme à l'aide d'un microscope confocal à disque rotatif et d'acquérir des bases de données 4D.
Avant de commencer l'expérience
- In vitro, la transcription de l'ARN à partir d'un modèle d'ADN linéarisé en utilisant le kit mMessage mMachine SP6 (Ambion) et de purifier l'ARN coiffé en utilisant le kit RNeasy Mini (Qiagen). Diluer l'ARN à l'aide de ~ 60ng/ul eau stérile, assurez-3-5uL aliquotes et stocker à -80 ° C jusqu'au moment de l'injection. Remarque: éviter le gel répétitif / décongélation pour prévenir la dégradation de l'ARN.
- Faire un moule à tenir les embryons pendant l'injection en versant 40 ml d'agarose à 2% en milieu d'embryon E3 (E3) dans une plaque de 100 x 15mm et la culture de placer un moule microinjection (Adaptive Science Tools, # I-34) dans ce bac. Une fois que l'agarose est solidifié, retirer le moule pour exposer le creux de l'agarose. Magasin de la plaque à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Tirez aiguilles pour l'injection capillaire à l'aide de filaments de verre borosilicaté (OD 1.0mm, ID 0,78, longueur 10cm) et un extracteur Sutter pipette P-97 avec les paramètres suivants (chaleur 485, Pull 50, vitesse 60, Delay / Durée 90, Pression 200 ). Remarque: différents types de verre, il faudra l'optimisation des conditions énumérées.
- Maquillage 1% Low Melt (LM) agarose en E3 et stocker 1ml aliquotes à 42 ° C. Soyez prudent car l'évaporation de l'E3 à partir des stocks peut augmenter la concentration d'agarose.
- Maintenir le poisson zèbre adulte dans des conditions standard de laboratoire, avec une régulière de la lumière cycle jour / nuit de 14 heures de lumière et 10 heures d'obscurité 7. La nuit avant l'expérience mis en place les poissons à s'accoupler en plaçant 3 femelles et 2 mâles dans un réservoir séparé par une cloison. Le lendemain matin, changer l'eau dans le réservoir et tirez le diviseur lorsque les lumières s'allument.
1. L'injection d'ARN codant pour la protéine actine par fluorescence Tagged reliure
- Décongeler les ARN sur la glace. Ajouter 0,5% rouge de phénol à l'ARN à un ratio de 1:1 pour une concentration finale de l'ARN et de la charge ~ 30ng/μl solution de 1 microlitre dans une aiguille tiré capillaire par remblayage.
- Recueillir ~ 75 1-cellule stade 8 CK: GFP dans des embryons E3. Pipet la pipette recueillies embryons dans le moule avec une microinjection 5 ¾ Pasteur et doucement orienter les embryons dans le creux avec FST Dumont # 5 forceps. Remarque: Prenez soin de travailler rapidement pour éviter d'injecter dans un embryon au stade multi-cellules, ce qui peut entraîner l'expression mosaïque de l'ARN injecté.
- En vertu d'un stéréomicroscope standard de laboratoire de dissection, d'injecter de l'ARN dans le jaune de l'embryon en utilisant un microinjecteur pression contrôlée (Harvard Apparatus PLI-100 Pico-injecteur). Une tache rouge (rouge de phénol) doivent être visibles dans l'embryon après l'injection. Injecter au moins 50 embryons pour chaque expérience. (Voir le protocole JoVE précédent pour un protocole détaillé sur l'injection de l'ARN dans des embryons de poisson zèbre 9). Note:
- Un volume de ~ 2NL devrait être utilisé pour l'injection de l'ARN en une seule cellule embryons au stade. Pour déterminer la quantité d'ARN injecté, dispenser un bolus de l'ARN dans une goutte d'huile minérale sur une lame micrométrique calibrée ou sous un microscope avec une barre d'échelle construite dans les oculaires. La goutte de l'ARN doit être une sphère parfaite. Calculez le montant remis à l'aide de l'équation: Volume (en NL) = 4/3πr 3. Réglez le volume livré en changeant la pression d'injection ou de temps sur l'instrument.
- Des précautions doivent également être prises pour injecter le plus faible quantité d'ARN qui permet la visualisation du fluorophore, comme de fortes concentrations d'ARN peuvent être toxiques pour l'embryon en développement. Pour déterminer le niveau d'expression approprié, une expérience dose-courbe doit être effectué avant l'exécution de l'expérience. </ Li>
- Trier les embryons pour éliminer les œufs non fécondés ou endommagé et placer tous les embryons restants à 28,5 ° C.
- Après 24 heures, utiliser un microscope à fluorescence dissection de sélectionner les embryons de poisson zèbre qui ont un niveau élevé de la GFP (épiderme) et DP (actine) à fluorescence. Placer les embryons sélectionnés à 28,5 ° C jusqu'au moment de procéder à la désintoxication à induire l'apoptose.
2. L'induction de cellules dans Extrusion larves de poisson zèbre en utilisant G418
Nous avons constaté que l'exposition à l'antibiotique aminoglycoside G418 ou généticine, provoque l'apoptose et l'extrusion des cellules épidermiques dans le développement de larves de poisson zèbre 3 par un mécanisme inconnu. Surtout, ce traitement ne fonctionne que sur les larves qui sont quatre jours après la fécondation et plus. Nous constatons que ~ 5-25 cellules peuvent être trouvées extrusion à un moment donné de la nageoire épithéliales de G418 zebrafish larvaires traitées. Comme la quantité de cellules apoptotiques extrusion peut varier de poissons à pêcher, nous recommandons de monter les poissons multiples pour l'imagerie.
- Recueillir et placer 4 jours après la fécondation (DPF) des larves de poisson zèbre présentant à la fois la GFP et DP de fluorescence dans un plat de 35 x 10mm culture contenant 3 millilitres (ml) de l'E3. On peut traiter jusqu'à 25 larves dans cette boîte de culture de taille.
- Replacez soigneusement le support avec des 3mLs 1mg/mL contenant des larves de l'E3 G418 et incuber dans le médicament pendant 4 heures à 28,5 ° C. Notez que le G418 est sensible à la lumière, afin de prendre soin de garder la boîte de culture couverte ou dans l'obscurité.
- Retirez le support et le remplacer par pré-chauffé à 28,5 ° C E3 Media contenant 0,02% de tricaïne et de procéder à de fixation des larves.
3. Les larves de poisson zèbre de montage pour l'imagerie
- Transfert 3 larves d'un tube eppendorf de 1,5 ml et de retirer la plupart de l'E3, après l'évier de poisson à fond du tube. Nous avons constaté que jusqu'à 3 animaux peuvent être correctement monté avant l'agarose se solidifie.
- En utilisant une pipette couper, 120ul pipette de 1% LM-agarose (42 ° C) dans le tube, mélanger, puis délicatement la pipette, les larves et le mélange d'agarose sur la lamelle dans le fond d'une boîte de culture de MatTek.
- L'utilisation d'un support TSF broches avec une broche d'insertion ou de tungstène aiguille, rapidement orienter les larves de sorte qu'elles sont droites et à plat contre la lamelle du plat MatTek.
Note: Nous utilisons généralement une épingle droite pour orienter le premier larves, puis une broche en forme de L pour s'assurer qu'ils sont bien à plat contre la lamelle tout en prévenant les dommages aux spécimens. - Une fois que l'agarose est solidifié, délicatement remplir la cuve avec l'E3 contenant 0,02% de tricaïne. Note: Alternativement, le G418 peut être ajouté à l'E3 dans le plat d'imagerie à continuer d'extrusion induisant, bien que l'exposition prolongée aux 1mg/mL G418 va tuer les larves.
4. En direct sur la dynamique d'imagerie actine et les comportements individuels des cellules épithéliales lors de l'extrusion cellulaire en utilisant un microscope confocal à disque rotatif
Nous avons constaté que l'ensemble du processus d'extrusion cellulaire par apoptose de l'épiderme du développement des larves de poisson zèbre prend environ 20 minutes 3. Ici nous démontrons comment configurer une expérience d'imagerie time-lapse de collecter une série de plans z grâce à une seule couche de l'épiderme zèbre de visualiser le processus d'extrusion. Nous avons constaté que les microscopes à champ large typiquement fluorescents cause importante photoblanchiment des filaments d'actine et ne permettent pas pour l'imagerie timelapse. Par conséquent, afin de maximiser notre résolution et de prévenir photoblanchiment, nous utilisons un microscope confocal à disque rotatif. Ci-dessous nous décrivons comment configurer l'expérience en utilisant le logiciel IQ Andor avec un microscope Nikon, bien que les principes exposés peuvent être appliqués au microscope similaires set-ups.
- D'abord, allumer l'Argon (pour l'excitation de la GFP à 488nm) et HeNe (pour l'excitation de la DP à 561nm) lasers, un microscope, une caméra et la lampe à fluorescence.
- Dans le logiciel Andor QI (version 1.10.1), créer un protocole de séries chronologiques contenant les longueurs d'onde que vous voulez à l'image, la fréquence de l'intervalle entre les captures d'image et le nombre de fois la capture doit être répété.
- Placez délicatement le plat contenant MatTek votre spécimen sur la platine du microscope et de l'utilisation d'un objectif 20x avec la lumière transmise à se concentrer sur les larves.
- Déplacer l'objectif de l'eau d'immersion 40X (NA 0,8) dans la position correcte. L'utilisation de cet objectif, nous pouvons films environ 20-25 cellules par champ, ce qui nous permet de suivre les comportements cellulaires lors de l'extrusion tout résoudre dynamique de l'actine sous-cellulaires. Remarque: Le montage mêmes et les stratégies d'imagerie peuvent être appliquées aux microscopes droits, même si un objectif 40X d'eau d'immersion avec une longue distance de travail doit être utilisé.
- Placez délicatement une goutte d'eau sur le dessus de l'objectif 40x et placer rapidement le plat de MatTek sur le dessus. None: la solution d'immersion Zeiss Immersol peut également être utilisé si l'évaporation de l'eau est un problème.
- Identifier l'échantillon en utilisant la phase d'illumination ou de DIC et ensuite utiliser épifluorescence 488nm de se concentrer spécifiquement sur l'épiderme, la GFP positives.
- Passer en mode confocal à balayage. Ajuster l'intensité du laser et le temps d'exposition pour chacun des canaux (488nm et 561nm) en conséquence. Prenez soin d'équilibrer la puissance du laser et le temps d'exposition pour une détection optimale de votre signal et d'empêcher toute photoblanchiment ou de toxicité.
- Pour identifier les cellules extrusion, utilisez épifluorescence pour visualiser la GFP étiqueté épiderme et d'identifier un groupe de cellules dans un modèle de rosette classique, composé d'une collection de cellules entourant une petite cellule ronde au milieu. Utilisation du mode confocal à balayage, il devrait également y avoir une accumulation de l'actine DP-étiquetés visible comme un anneau autour de la petite cellule ronde au milieu, une caractéristique de l'extrusion cellulaire. Une fois que vous avez identifié une cellule d'extrusion, rapidement mis en place le microscope pour acquérir 4D (XYZ-temps) des ensembles de données confocale.
- Définissez les points supérieur et inférieur dans le plan z pour visualiser une seule couche de l'épiderme, y compris la cellule d'extrusion, et sélectionnez la taille du pas. Pour imagerie time-lapse, réglez la fréquence de la capture d'image et le nombre de répétitions. Par exemple, nous avons généralement l'acquisition d'une série Z couvrant 5 10 microns, avec une taille de 1 um étape, toutes les 1-2 minutes pendant 30 minutes.
- Pour afficher les données, nous font généralement en 3-D des projections de la série Z et enregistrer l'ensemble des données comme un fichier vidéo qui est compatible avec Quick Time (Apple). De cette manière, nous pouvons visualiser la contraction de l'anneau d'actine et de comportements épithéliales qui se produisent autour de la cellule meurt au cours du temps.
5. Les résultats représentatifs
Figure 1. Schéma de l'extrusion cellulaire par apoptose. Les filaments d'actine sont indiquées en rouge, la GFP positives cellules épidermiques sont de couleur verte.
Figure 2. Workflow expérimentale. Schéma A. du workflow pour l'expérience. B. Expression de la DP-UtrCH dans l'épiderme d'un CK 4dpf: GFP poisson zèbre.
Figure 3. Images fixes (z-projections) à partir d'un film accéléré qui suit en direct dynamique de l'actine au cours du processus d'extrusion des cellules épithéliales. Les flèches indiquent l'anneau d'actine formés par les cellules voisines qui se contracte et se ferme au cours des 2 minutes.
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Discussion
Le protocole décrit ici montre une méthode simple et facile à visualiser le processus d'extrusion dans un tissu vivant épithéliales. Ce type d'expérience nous permet d'examiner les subtilités de la dynamique de l'actine pas auparavant appréciés dans les analyses de tissus fixés, et par conséquent, des compléments en commun des méthodes d'immunofluorescence. Nous pouvons utiliser ce protocole en combinaison avec des inhibiteurs chimiques ou mutants génétiques pour mieux analyser le processus d'extrusion et d'états pathologiques associés à l'étude du défaut d'enlèvement et clair cellules apoptotiques, qui nous l'espérons, conduire à des réactions inflammatoires ou l'accumulation de cellules endommagées, comme vu dans le cancer. Par exemple, notre laboratoire a précédemment montré que les inhibiteurs chimiques peuvent être utilisés en combinaison avec le G418 de modifier le ciblage des filaments d'actine le long de la surface basolatérale de la cellule, dont les effets le sens d'une cellule extrude 3. Une limitation de la méthode actuelle est qu'en raison de la nature stochastique et imprévisible de la mort cellulaire, nos ensembles de données ont tendance à se concentrer sur les étapes ultérieures de l'extrusion. Pour étudier la formation de l'anneau d'actine multicellulaires et l'initiation de la contraction, les expériences futures appliquer des techniques pour induire l'apoptose dans un sous-ensemble de marqués à la fluorescence des cellules épithéliales qui sont génétiquement ciblées pour 10 mort cellulaire. En combinant cette stratégie avec notre méthode à l'image dynamique de l'actine dans l'épiderme devrait faciliter les études des premières étapes menant à l'extrusion cellulaire par apoptose. Ensemble, les informations tirées de ces expériences va ajouter de manière significative à notre compréhension de l'extrusion des cellules épithéliales et sa signification médicale.
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Disclosures
Assurance protection des animaux
Toutes les procédures effectuées dans ce protocole en utilisant le poisson zèbre, Danio rerio, ont été approuvés par l'Institutional Animal Care et utilisation comité (IACUC) à l'Université de l'Utah (Assurance Animal Welfare # 10-07017).
Acknowledgments
Nous remercions les membres du laboratoire Rosenblatt pour des discussions scientifiques, des suggestions et commentaires. Nous tenons également à remercier Mary Halloran qui a gentiment fourni le plasmide codant pour DP-UtrCH et David Grunwald qui a fourni les CK: GFP transgéniques poisson zèbre. Merci également à Gretchen King et le personnel de la ressource centralisée au poisson-zèbre à l'Université de l'Utah pour l'entretien et les soins excellents du poisson-zèbre. Ce travail a été soutenu par le NIH Prix NIGMS directeur du NIH est une Innovateur Nouveau DP2 OD002056-01 à JR. GTE a été soutenu par le NIH multidisciplinaire du cancer du Programme de subventions de formation 5T32 CA03247-8.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR international | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Co. | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments, Inc. | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus Corporation | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
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