Summary
Новый метод инкапсуляции фолликула яичника в 3D фибрин-альгинат взаимопроникающих сети описывается. Эта система сочетает в себе структурную поддержку с протеолитической деградации, чтобы поддержать развитие незрелых фолликулов для получения зрелых яйцеклеток. Этот метод может быть применен к агрегаты культуры клеток для поддержания межклеточных контактов, не ограничивая экспансию.
Abstract
Яичников фолликул функциональная единица яичников, который выделяет половые гормоны и поддерживает созревания яйцеклетки. В лабораторных методов фолликула предоставить инструмент для моделирования развития фолликула с целью изучения фундаментальной биологии, а далее развивается как метод сохранения фертильности у Клиника 1-4. Наша культура в пробирке система использует гидрогелей для того, чтобы имитировать родную среду яичников путем поддержания 3D архитектуру, фолликулярная, межклеточных взаимодействий и паракринной понять, что прямое развитие фолликула 5. Ранее фолликулы были успешно культивируют в альгинат, инертные водорослей полученных полисахарид, желируется с ионами кальция 6-8. Альгинат гидрогелей образуется при концентрации 0,25% вес / были самыми разрешительной для фолликула культуры, и сохранил высокие развития компетенции 9. Альгинат гидрогели, не разлагаются, таким образом, увеличение диаметра фолликула приводит к сжимающей силы на фолликул, что может повлиять на рост фолликулов 10. Мы впоследствии развилась культура система, основанная на фибрин-альгинат взаимопроникающих сети (FA-IPN), в котором смесь фибрина и альгината геля одновременно. Эта комбинация обеспечивает динамический механический окружающую среду, так как компоненты способствуют матрицы жесткости изначально, однако, протеазы выделяются растущие фолликулы ухудшить фибрина в матрицу, оставляя только альгинат оказать поддержку. С IPN, альгинат содержание может быть меньше 0,25%, что невозможно с альгинат только 5. Таким образом, как фолликула расширяется, он будет испытывать снижение сжимающего усилия в связи с пониженным содержанием твердых веществ. Здесь мы опишем метод инкапсуляции и в пробирке культуру системы фолликулы в FA-IPN. Динамического механического среды имитирует природную среду яичников, в которых небольшие фолликулы находятся в жесткой коре и перейти к более либеральные мозга, как они увеличиваются в размерах 11. Разложению компонент может быть особенно важно для клинической перевод, чтобы поддержать более 10 6-кратное увеличение объема, что человеческая фолликулов обычно проходят в естественных условиях.
Protocol
1. Фолликул Изоляция
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Национальным институтом здоровья Руководство по уходу и использованию лабораторных животных и созданы институциональные Использование животных и уход протокола в Северо-западном университете.
Для получения оптимальных результатов, все вскрытия проводятся в L15 средств массовой информации для контроля рН при комнатной уровней СО 2 на 37 ° С подогревом этапов для регулирования температуры, и на чистом столе, чтобы минимизировать бактериального загрязнения. Рассечение СМИ (DM) готовят с L15 среде с 50 МЕ / мл пенициллина и 50 мкл / мл стрептомицина и 1% FBS. Техническое обслуживание средств массовой информации (ММ) получают со средствами массовой информации αMEM дополнена с 50 МЕ / мл пенициллина и 50 мкл / мл стрептомицина и 1% FBS.
- Передача свежей расчлененный яичники из 16 дневных мышей в новую 35-мм чашки Петри с 1-2 мл мм, содержащий 0,1 Коллагеназа% и 0,1% ДНКазы. Инкубировать 15 минут в термостат при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
- После инкубации выполнять несколько этапов промывки в немецких марках, чтобы удалить коллагеназы, а затем переносить их на 35 мм чашки Петри со свежей DM. Изолировать фолликулов из яичника, аккуратно стряхивая (или резки) фолликулы от целого яичника с помощью двух 28 5 / 8 иглы прилагается к одноразовым шприцам. Удалить столько стромы насколько это возможно без повреждения целостности фолликула. Рассеките из 20-40 вторичных фолликулов в яичниках (130-150мм). Эти фолликулы, как правило, 2-3 слоя в соматических клетках.
- Добавьте 1 мл мм в центральную лунку 60 мм ЭКО (экстракорпоральное оплодотворение) чашки Петри, и 3 мл мм для внешнего кольца. Передача нетронутыми фолликулов с пипеткой внешнее кольцо блюдо ЭКО кратко промыть, а затем выборочно перенести их в центральной яме (см. 1.4). Хранить ЭКО блюдо в инкубаторе.
- После того как все фолликулы собраны, выбор шаг выполняется под микроскопом рассекает с 5-8-кратным увеличением. Здоровые фолликулы имеют следующие морфологические характеристики:
- 2-3 слоя соматических клеток
- 130-150 мм
- Нет разделения между ооцитов и соматических клеток
- Неповрежденными и круглые ооцитов
Передача здоровых фолликул в центре ЭКО блюда для инкапсуляции.
2. Фолликул инкапсуляции, метод 1 - "The Drop Method"
- Добавьте 1 мл 50 МЕ / мл тромбина в TBS с 40 мМ CaCl 2 в середину ямы ЭКО блюдо. Оттепель и держать акции фибриногена (50 мг / мл в TBS) на льду. Принесите фибриногена до комнатной температуры перед использованием.
- Подготовка фибриногена / альгинат решение путем смешивания 1x PBS, 0,5% альгината в растворе PBS и 50 мг / мл раствор фибриногена в соотношении 2:1:1 в 1,7 мл стерильной пробирке микроцентрифужных. Избегайте введения пузырьков в раствор. Аккуратно вихря и со спином вниз. Решение представляется немного облачно и следует готовить непосредственно перед применением.
- Поставьте две капли фибриногена / альгинат решение внешнего кольца блюдо ЭКО: 90 мкл капли для инкапсуляции и 10 мкл капли для стирки. Чтобы уменьшить испарение, выключите стадии нагрева на вскрытии микроскопом. Передача 10-15 фолликулов в 10 мкл капли с минимальным количеством питательных сред (<5 мкл) с использованием 200 мкм микропипетки наконечник, и быстро перемешать. Передача всех фолликулов в 90 мкл капли с минимальным количеством раствора (<5 мкл) с первой капли, и все перемешать.
- Одновременно аспирата один фолликул и 5 мкл фибриногена / альгинат решения с использованием 10 мкл кончика пипетки, а выпуск в тромбин / Ca 2 + раствор в блюдо ЭКО. Повторите этот шаг, пока все фолликулы инкапсулируются.
- Перекрестная ссылка бисером в течение 5-7 минут в тромбин / Ca 2 + решение. Бисер станет темнее как гели фибрина. Передача бисером в чашку Петри с ММ, начиная с темным бисером в первую очередь. Инкубируйте блюдо в течение 15-30 минут inthe инкубатор, чтобы смыть оставшийся тромбина.
- Передача бусины в 96 ячейках культуры, содержащие 100 мкл среды рост фолликулов, и изображение сразу. Питательной среды (GM) готовится со средствами массовой информации αMEM с добавлением 10 мМЕ / мл рекомбинантного ФСГ, 3 мг / мл БСА, 1 мг / мл бычьего fetuin, 5 мкг / мл инсулина, 5 мкг / мл трансферрина, и 5 нг / мл селена.
3. Фолликул инкапсуляции, метод 2 - "Метод парафильмом"
- Подготовка фибриногена / альгинат решение путем смешивания 0,5% раствор альгината и 50 мг / мл раствор фибриногена в соотношении 1:1 в 1,7 мл стерильной пробирке микроцентрифужных.
- Внесите 7,5 мкл капель фибриногена / альгинат смесь на парафильмом покрытием предметное стекло толщиной 3 мм распорки. Передача 1 фолликула в каждой капле с минимумовл количество средств массовой информации.
- Добавить 7,5 мкл тромбина / Са 2 + для решения каждой капли. Смешивание нет необходимости, поскольку гель образует почти мгновенно.
- Обложка гели с второй парафильмом покрытием предметное стекло, положить слайды с ног на голову в 100 мм блюдо Петри, и трансфер в инкубаторе в течение 5 минут.
- Передача бисером в чашку Петри с ММ, а затем в культуре также как описано выше. Если бисером слипаются, что связано с сшивок между бисером, они могут быть отделены осторожно щипцами.
4. Фолликул изображениями и медиа изменения
- Каждые 2 дня, культурный фолликулы отображаемого использованием светового микроскопа и фолликул диаметром измеряется с помощью программного обеспечения ImageJ.
- Каждые 2 дня, половина из питательной среды (50 мкл) заменяется свежим, предварительно уравновешенную питательной среды.
5. Фолликул Восстановление после 3D Matrix и в пробирке созревание ооцитов (IVM)
- Через 8 дней культуры, гидрогели выглядят четкими в связи с полной деградации фибрина компонент, и фолликулы расширить до диаметра 300-400 мкм. Остальные альгинат разлагается под альгинат-лиазы, растительного происхождения, фермент, который специально ухудшает альгинат и не влияет на клетки животных.
- Удалить питательной среды из скважин содержащих бисером и добавить 100 мл 10 МЕ / мл лиазы альгината в αMEM. Оставьте пластину в инкубаторе в течение 25-30 минут.
- Удалить фолликулы от растворенных бисер с тупым кончиком конца. Передача первых внешнее кольцо блюдо ЭКО содержащих ДМ, а затем и в центре хорошо, также содержащие ДМ мыть.
- После мытья, передача фолликулов к внешнему, а затем внутреннее кольцо блюдо ЭКО содержащие созревания СМИ. В средствах массовой информации пробирке созревания (IVM) состоит из αMEM, 10% FCS, 1,5 МЕ / мл ХГЧ, и 5 нг / мл эпидермального фактора роста (EGF)
- Трансфер в CO 2 инкубаторе в течение 15-16 часов.
Изучить фолликулов для расширения кучевые клеток. Чтобы удалить клетки кумулюса из яйцеклетки, добавьте растворе гиалуронидазы до конечной концентрации 0,1 мг / мл и инкубируют в термостате в течение 2-3 минут. Используйте 75 мм кончика микропипетки стричь кучевые клеток из яйцеклетки с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Определить период созревания ооцита при свете или рассекает микроскопом. Возможных этапах, от наименее до наиболее зрелых, являются:- Выродились. Ооцит раздроблена на две или более частей.
- Зародышевого пузырька (GV) стадии. Ооцитов не возобновлялся мейоза в ответ на ХГЧ воздействия, о чем свидетельствует продолжающееся присутствие ядра яйцеклетки (GV).
- Жерминаль пробоя пузырек (GVBD). Ядерная мембрана отсутствует яйцеклетки, но нет полярной настоящее тело. Таким образом, яйцеклетка остается в мейозе-I.
- Метафаза-II арестован ооцитов (MII). Ооцитов возобновил мейоз, и в настоящее время арестован в метафазе-II. Полярное тело должны быть видны на светлом или рассекает микроскопом. Яйцеклетки останутся на MII, если оплодотворение в последующих опытах.
6. Представитель Результаты:
Мы описали новый метод инкапсуляции фолликулы в FA-IPN для культуры в пробирке (рис. 1). Яичников фолликул состоит из яйцеклетки в окружении нескольких слоев в соматических клетках. Связь между несколькими сотовой отсеков имеет важное значение для здорового развития фолликула и созревания яйцеклетки. Фолликул инкапсуляции в 3D гидрогеля поддерживает фолликула расширение при сохранении архитектуры фолликула 9,11,12. Как фолликулы развиваются, их объем расширяется экспоненциально и инкапсуляции биоматериала должно позволить это расширение без развития ингибирования сжимающей силы. FA-ВПС является сеть, построенную из двух природных материалов, где фибрин протеолитически разложению по плазмин активируется фолликула и альгината биологически инертен 13 (рис. 2). Во время роста фолликула, фибрин деградация начинается локально вблизи фолликула, и продолжается до фибрина очищается от гидрогеля. Не-разложению альгинат компонент, который остается неизменным во всем культуры периода, поддерживает 3D-структура гидрогеля.
Фолликулы были изолированы в средней стадии развития (150-180 мкм в диаметре) и расширен до 400 мкм при антрального этап развития в FA-IPN гели. С ХГЧ стимуляции, культурный фолликулов могут подвергнуться расширению кучевые клетки, и ооцитов может возобновить мейоз и прогресса в метафазе II для оплодотворения. Эти результаты показывают, что метод инкапсуляции и инкапсуляции материал позволил культуры фолликула и успешного созревания в пробирке (рис. 3).
Фибрин деградации вокруг encapsulated фолликулов начинается в первый день культуры и завершается день 6. Апротинин, растворимый ингибитор плазмина, могут быть использованы для изменения фибрина деградации и расширить механических градиент в инкапсуляции материала (рис. 4). Если фолликул культивируются с 0,01 ТИУ / мл апротинина, фибрин разлагается медленнее в течение первых 4 дней. Тем не менее, фолликулы еще может развиться до стадии антрального и ооцитов остаются компетентными для возобновления мейоза на метафазе II после апротинин является removed.A высокой концентрацией апротинина (0,1 ТИУ / мл) достоверно тормозит фибрина деградации, матрица жесткости предотвращает расширение фолликула и соматических клеток вторжение в матрице не наблюдается.
Рисунок 1. Блок-схема фолликула развития. Яичников фолликул состоит из яйцеклетки в центре города, окруженные одним или несколькими слоями соматических клеток, которые поддерживают развитие яйцеклетки. Как фолликулы развиваются из вторичной по отношению к preovulatory антрального этапе соматических клеток, окружающих ооцит размножаться и дифференцироваться, и яйцеклетка увеличивается в размере. Созревания в пробирке (IVM) является заключительным этапом для фолликула культуры, когда соматические клетки, прилегающих к яйцеклетки, называют кучевые клеток, расширению после ХГЧ стимуляции, и ооцит резюме мейоза и прогрессирует до метафазы II (MII) стадии.
На рисунке 2а. Альгината и фибрин-альгината для 3D культуры фолликула в пробирке. () Альгинат является естественным биоматериал, который подходит для экстракорпорального фолликула культуры из-за его нежного геля и биохимические характеристики, такие как размер ячейки, управляемой жесткостью и биологической инертностью. Альгинат является линейной сополимера полисахарид α-L-гулуроновой кислоты (G) и β-D-маннуроновой кислоты (М). Районы с повторяющимися мономеры G, называется "G-блоки", сшиты в форме гидрогеля в присутствии двухвалентных ионов кальция.
На рисунке 2б. (Би) Малый инкапсулированные фолликулов опыт низкой сжатие силой в альгинат в начале культуры. Однако, как фолликула расширяет перемещенным объем в шарик увеличивается, что приводит к большей сжимающей силы в противоположном направлении расширения фолликул (B-II).
Рис 2в. Цепями индивидуальных полимеров, полностью запутавшись в фибрин-альгинат решение до сшивания. Оба компонента FA-IPN начинают перекрестные ссылки сразу же, как они подвергаются смесь тромбина и кальция.
На рис.3. Блок-схема для изоляции фолликула и инкапсуляции в FA-IPN. Вторичные фолликулы выделяют из 16-дневных мышей (Ai). Репродуктивные органы расчлененный (-II), и изолированных фолликулов передаются на блюдо с обслуживанием средств массовой информации (A-III).
На рисунке 3б падение метод инкапсуляции фолликула в фибриногена решение альгинат (B: I-IV).. Две капли фибриногена-альгинат решение, полоскание каплю (10 мкл) и инкапсуляции падение (90 мкл) пипетируются в блюдо (Bi). Следующая 3-5 фолликулов передаются полоскания падения (B-II). После промывки и СМИ удаление, фолликулы передаются инкапсуляции падения (B-III). Каждый фолликул отсасывают с 5 мкл фибриногена-альгинат решение с 10 мкл кончика пипетки, а затем выбрасываются в тромбин / раствор кальция (B-IV).
3, в. Бусинка сшивки в течение 5 минут. Метод парафильмом для фолликула инкапсуляции в фибриногена решение альгинат (C: I-III). Фибриноген-альгинат решение (7,5 мкл) пипеткой на парафильмом покрытием предметное стекло и фолликулы передаются индивидуально для каждой капли после промывки (Ci, II). Тромбин решение (7,5 мкл) добавляется к каждой капле (C-III).
Рис 3 - е. капли покрыты второй парафильмом покрытием предметное стекло и FA-IPN сшивается в инкубаторе в течение 5 минут. (D) инкапсулированные фолликулов передаются рост средств массовой информации в 96-луночного планшета. (Е) образ инкапсулированные фолликула в FA-IPN (белая стрелка).
Рисунок 4. Фибрин деградации растущей Folliубор. Фолликулы ухудшить фибрина компонент FA-ВПС в течение периода культуры, о чем свидетельствует ясно круг вокруг фолликула. 3D архитектура фолликула при поддержке оставшихся альгината. В день 0 (D0) фибрина не тронута, а матрица вокруг фолликула облачно, через 1 день в культуре (D1) ясно кольцо вокруг фолликула появляется (белая стрелка) и передней фибрина деградации продолжает радиально расширить свое присутствие на день 2 (D2) и 4-й день (D4) культуры.
Рисунок 5. Изображения рост фолликулов. Представителю изображения ofsecondary роста фолликула в FA-ВПС в день 0 (), 4 (В), 6 (C) и 8 (D) культуры. Через 8 дней, антральных фолликулов созревает в пробирке, и в результате ооцитов MII стадии показаны (Е, полярных тело с черными стрелками).
Рисунок 6. Фибрин деградации ингибируется апротинин. Растущие фолликулы на 2 дня, 4, 10 и 12 показаны в первом ряду. Апротинин в концентрации 0,01 ТИУ / мл (второй ряд) и 0,1 ТИУ / мл был добавлен в культуре средств массовой информации на 0, 2 и 4. Только фолликула культур с 0,01 ТИУ / мл апротинина деградированных фибрина после удаления апротинин и достиг антрального стадии. Фолликулы культивировали в 0,1 ТИУ / мл апротинина не растут в FA-IPN.
| Аббревиатура | Полное имя |
| CO 2 инкубаторе | 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 |
| COC | Cumulus яйцеклетки комплекс |
| 3D | 3 мерных |
| DM | Препарирование СМИ |
| ЭФР | Эпидермального фактора роста |
| FA-IPN | Фибрин-альгинат взаимопроникающих сети |
| FBS | Эмбриональной телячьей сыворотки |
| GM | Рост средств массовой информации |
| Г. В. | Зародышевого пузырька |
| ХГЧ | Человеческий хорионический гонадотропин |
| ЕЕ | Инсулин трансферрина Селен дополнения |
| ЭКО блюдо | Центр также 60 мм блюдо экстракорпорального оплодотворения |
| ММ | Обслуживание средств массовой информации |
| MII стадии ооцита | Метафаза II стадии ооцита |
| rFSH | Рекомбинантный гормон Фолликулярная |
| TBS | Трис солевой буфер |
| ТИУ | Трипсин тормозных единиц |
Таблица 1. Сокращения
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представлены фолликула яичника метод инкапсуляции в FA-IPN позволяет фолликула культуры в 3D-среде в пробирке. FA-ВПС является динамическим, сотовых проблематику матрицу, в которой начальная механические свойства которых определяются комбинацией обоих фибрина и альгината. В культуре, инкапсулированные фолликула активирует протеазы, которые разрушают лишь одним из компонентов IPN, фибрина, в результате чего постепенно снижается жесткость геля, который способствовал исключительно за счет оставшихся альгината в конце культуры. Механических свойств при динамическом, полученные с FA-ВПС были предложены в соответствие с природной среде развивающихся фолликулов и способствуют улучшению скорости созревания ооцитов мейоза по сравнению с альгинат в одиночку.
FA-IPN демонстрирует мягкий и быстрый геля, при этом каждый компонент системы сшивания независимым механизмом. Мы описали в другом месте 5 видно, что скорость образования геля можно управлять с помощью фибриногена и тромбина концентрациях. Степень деградации, можно регулировать апротинин ингибирование протеолиза фибрина. Вторичных фолликулов мышей, как правило, культивируют в течение 8-12 дней и фолликулы от других видов требуют более длительных периодов культуры. Таким образом, задержка деградации фибрина на апротинин потенциально могут предоставить расширенный динамический среды дольше культур.
Описаны методы инкапсуляции может быть применена к другим системам, таким как инкапсуляция и культуры микро-ткани или эмбриоидных органов, в которых межклеточного контакта можно сохранить еще совокупности может частично деградировать матрицу и создать пространство для расширения. В заключение FA-IPN метод инкапсуляции представляет стерильной системе культуры гидрогеля с динамическими, сотовых проблематику механических свойств и контролируемый уровень деградации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась NIH (U54HD41857 и PL1EB008542, P30 биоматериалов Основные течение Oncofertility Консорциум Дорожная карта гранта).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetuin | Sigma-Aldrich | F3385 | |
| FBS | Invitrogen | 10082-139 | |
| Aprotinin | Roche Group | 10236624001 | |
| CaCl2 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 039-00475 | 40 mM |
| EGF | Sigma-Aldrich | A412 | |
| rFSH | National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases | ||
| hCG | Sigma-Aldrich | CG-5 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | A1603 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I1884-1VL | |
| L-15 | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| αMEM+Gluta MAX | GIBCO, by Life Technologies | 32561 | |
| Pen-Strep | Cellgro | 30-002-CI | |
| TBS | Pierce, Thermo Scientific | 28379 | |
| Tisseel Fibrin kit | Baxter Internationl Inc. | 921030 | |
| Sodium Alginate | FMC BioPolymers | LF200DL | Mw 418kDa |
References
- Cortvrindt, R., Smitz, J., VanSteirteghem, A. C. In-vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system. Human Reproduction. 11, 2656-2666 (1996).
- Smitz, J., Cortvrindt, R., Hu, Y. X. Epidermal growth factor combined with recombinant human chorionic gonadotrophin improves meiotic progression in mouse follicle-enclosed oocyte culture. Human Reproduction. 13, 664-669 (1998).
- Xu, M., Banc, A., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Secondary Follicle Growth and Oocyte Maturation by Culture in Alginate Hydrogel Following Cryopreservation of the Ovary or Individual Follicles. Biotechnology and Bioengineering. 103, 378-386 (2009).
- Smitz, J. Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation. Human Reproduction Update. 16, 395-414 (2010).
- Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development. Biomaterials. 30, 5476-5485 (2009).
- West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).
- Kreeger, P. K., Fernandes, N. N., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Regulation of mouse follicle development by follicle-stimulating hormone in a three-dimensional in vitro culture system is dependent on follicle stage and dose. Biology of Reproduction. 73, 942-950 (2005).
- Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9, 1013-1021 (2003).
- Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biology of Reproduction. 75, 916-923 (2006).
- Xu, M. Encapsulated Three-Dimensional Culture Supports Development of Nonhuman Primate Secondary Follicles. Biology of Reproduction. 81, 587-594 (2009).
- West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K.
- Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Engineering. 12, 2739-2746 (2006).
- Ebisch, I. M. W. Review of the role of the plasminogen activator system and vascular endothelial growth factor in subfertility. Fertility and Sterility. 90, 2340-2350 (2008).
