Summary
כימות של דלקת הסלולר ב CNS פצועים / פתולוגי על ידי cytometry זרימה מסובך ידי פסולת שומנים / מיאלין כי יכול להיות בגודל פרור דומים לתאים, הפחתת הרגישות / דיוק. יש לנו הכנה מתקדמים תא שיטה להסרת פסולת המיאלין ולשפר זיהוי תאים על ידי זרימת cytometry בחוט השדרה הפגוע.
Abstract
איתור של תאים חיסוניים במערכת נפצעו העצבים המרכזית (CNS) באמצעות טכניקות מורפולוגיים או היסטולוגית לא סיפקה תמיד ניתוח כמותי נכון של דלקת הסלולר. Cytometry זרימה היא שיטה חלופית מהירה לכמת תאים חיסוניים במוח פצוע או רקמת חוט השדרה. מבחינה היסטורית, cytometry זרימה שימש לכמת תאים חיסוניים שנאספו דם או הטחול מנותק או התימוס, ורק מספר מחקרים ניסו לכמת תאים חיסוניים בחוט השדרה נפגע cytometry זרימה באמצעות חוט רקמה טרי ניתק. עם זאת, הרקמה ניתק חוט השדרה מרוכזת בפסולת המיאלין אשר ניתן בטעות תאים ולהפחית אמינות לספור תא מתקבל על ידי cytometer את הזרימה. יש לנו הכנה מתקדמים תא שיטה באמצעות מערכת שיפוע OptiPrep כדי פסולת ביעילות שומנים / המיאלין נפרד מן התאים, מתן quantifications רגיש ואמין של דלקת הסלולר בחוט השדרה נפגע cytometry הזרימה. כפי שתואר מחקר שנערך לאחרונה שלנו (Beck & נגוין ואח', המוח פבואר 2010; 133 (Pt 2):.. 433-47), הכנת תא OptiPrep עלה רגישות לזהות דלקת הסלולר בחוט השדרה נפגעים, עם סעיפים של תא סוגים ספציפיים correlating עם חומרת הפציעה. אנושות, השימוש הרומן של שיטה זו סיפקה את האפיון הראשון של דלקת הסלולר אקוטי וכרוני לאחר SCI לכלול קורס הזמן המלא ל leukocytes polymorphonuclear (PMNs, נויטרופילים), מקרופאגים / microglia, ו-T-תאים על פני תקופה שבין 2 שעות 180 ימים לאחר פציעה (dpi), זיהוי שלב הרומן המפתיע השני של דלקת הסלולר. אפיון יסודי של דלקת הסלולר באמצעות שיטה זו עשויה לספק הבנה טובה יותר של neuroinflammation ב CNS נפצעו, ולחשוף מרכיב חשוב של multiphasic neuroinflammation שעשויה להיות קריטית לעיצוב ויישום אסטרטגיות טיפול רציונלי טיפולית, כולל שני תאים מבוססי תרופתי התערבויות של SCI.
Protocol
1. דיסוציאציה של רקמת חוט השדרה
- קטעי חוט השדרה T8-T10 שאינם פצועים או בחוט השדרה contusion נפצעו (פציעה ב T9) ספראג חולדות Dawley נותחו ו ניתק מכנית במספריים עדינים HBSS בטמפרטורת החדר, כפי שתואר לעיל 1. לפני רקמת הניתוק, כל העמודות בעמוד השדרה נשמרו על קרח יבש במשך 5 דקות לפני החילוץ של מגזרים כבל T8-T10.
- פיסות רקמה נאספו על ידי צנטריפוגה (1 דקה, 1000 סל"ד, בטמפרטורת החדר) ו ניתק enzymatically עם 2.5 מ"ג טריפסין ו 5 collagenase מ"ג 5 מ"ל DME (Media השתנה Dulbecco של הנשר) במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני טחינה דקה (~ 10 פעמים בטמפרטורת החדר) עם פיפטה פסטר זכוכית (9-אינץ').
- 10 מ"ל של סרום + 10% DME שור העובר נוספה תאים כדי לבלום פעילות אנזימטית ואז היה מסונן דרך מסננת תא 40 מיקרומטר. אחרי סיבוב מהיר, התא גלולה היה resuspended ב 6 מ"ל של HBSS ו overlayed על פתרונות OptiPrep שיפוע המתוארים להלן.
2. יצירת OptiPrep שיפוע פתרונות
- OptiPrep מדולל נבנה על ידי דילול OptiPrep 01:01 עם הצפת מגבים (0.15 M NaCl, מגבים 10 מ"מ, ה-pH 7.4).
- ארבעה OptiPrep פתרונות הדרגתיים נעשו על ידי ערבוב 350, 250, 200, או 150 OptiPrep בדילול μl עם HBSS לנפח סופי של 1 מ"ל (טבלה 1).
- ארבעת הפתרונות הושמו לאט ובזהירות שכבות צינור חרוטי 15 מ"ל עם לפחות לדלל בתחתית ואת לדלל ביותר על החלק העליון (איור 1A).
3. הפרדת השומנים / המיאלין פסולת מתאי
- 6 מ"ל של תאים השדרה ניתק ב HBSS היה בזהירות על גבי שכבות של פתרונות הדרגתיים OptiPrep.
- תאים Tube המכיל פתרונות הדרגתיים היה centrifuged (15 דקות, 1900 סל"ד או 726 RCF, 20 ° C) באמצעות 5810R צנטריפוגה Eppendorf עם הרוטור הנדנדה דלי (A-4-62), להפריד את פתרון התא לתוך שכבות נפרדות עם שומנים / פסולת המיאלין (7 מ"ל העליון של הצינור), ואחריו 3 שכבות של נוירונים, עם תאים דלקתיים, גליה, ותאי דם אדומים בתוך גלולה. למרות תאים דלקתיים ביותר, כולל מונוציטים, מקרופאגים, גרנולוציטים PMN, לימפוציטים ו נמצאו גלולה, חלק גדול בגודל המופעל מקרופאגים ניתן למצוא שכבות מעל גלולה.
- שכבת השומנים / המיאלין פסולת (למעלה 7 מ"ל) היה aspirated בזהירות הוסרו. תאים נשטפו אז resuspended ב 2.5 HBSS מ"ל המשמש immunolabeling להלן.
4. Immunolabeling של תאים חיסוניים ספציפיים עבור cytometry זרימה
- תאים (500 μl) שנאספו ההכנות חוט השדרה היו pelleted ו resuspended ב אמוניום כלוריד 0.85% (מדולל במים מזוקקים) במשך 5 דקות עד lyse כדוריות דם אדומות.
- תאים נשטפו עם 500 HBSS μl וחסמו אז ארנב רגיל או בסרום עכבר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- תאים נשטפו וטופחו בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 עם נוגדן (הארנב נגד PMN FITC, כימי מדויק ומדעי; עכבר אנטי עכברוש ED1 אלקסה 488, Serotec, או עכבר אנטי CD3 עכברוש אלקסה 488) או אלוטיפ פתרון IgG בדילול מלא HBSS (בבת דילול 1:100), כפי שתואר לעיל 1.
- תאים נשטפו פעמיים לאחר כל שלב לעיל ולאחר מכן resuspended ב 300 HBSS μl אחרי לשלב הסופי.
5. תא הערכה כמותית על ידי זרימת cytometry
- דוגמאות נותחו על cytometer Calibur (בקטון דיקינסון-) תזרים FACS באמצעות תוכנה Quest Cell. 5000 אירועים לפי המדגם היו לקרוא כל הדגימות, ניתוח הנתונים הושלם עם Summit (DakoCytomation).
- שערי תזרים cytometric נקבעו באמצעות שליטה IgG תאים אלוטיפ שכותרתו או תאים בחוט השדרה מחיות בקרה וללא כל פגע לקבוע ערכי בסיס לנורמליזציה בכל נקודות זמן כפי שתואר לעיל 1. הערכים הממוצעים של תאים שכותרתו חיובי באו לידי ביטוי כאחוז (± SEM) של המדגם.
6. נציג תוצאות:
היכולת של שיפוע OptiPrep להסיר פסולת המיאלין ולשיפור יכולת הזיהוי של תא החיסון על ידי זרימת cytometry הוערכה על ידי לכימות PMNs השדרה של 1 dpi (איור 1B), השיא שדווח קודם לכן של חדירת PMN לאחר SCI 1-3. לחלופין, מיתרי השדרה גזור זהה היו ניתק enzymatically ללא הסרת-OptiPrep של פסולת המיאלין ואת הוערכו באופן דומה במקביל עבור חדירת PMN ידי cytometry הזרימה. כפי שכבר דווח בעבר 1, לא היה שינוי במצב של אירועים בדגימות מבודד עם שיפוע OptiPrep שיטת טיהור לעומת דיסוציאציה האנזימטית לבד, הוכחת אחוז PMNs זוהה בדגימות בפסולת המיאלין שלם היה רק חלק קטן (0.5%) של אחוז PMNs זוהה (5.1%) ב OptiPrep purifדגימות ied (איור 1B). נתונים אלה מראים כי שברים המיאלין בהכנות רקמות יכול לטשטש קריאות תזרים cytometric, ולהוכיח כי סילוק פסולת המיאלין משפר את הרגישות של זיהוי תא החיסון ברקמות חוט השדרה נפגע.
לאחר שקבע את הרגישות של מערכת שיפוע OptiPrep לגילוי תאים בחוט השדרה נפגע, אנו מאופיין בשינויים חדירת הסלולר על פני תקופה שבין 2 שעות עד 180 dpi והקים בתגובה multiphasic הרומן של דלקת הסלולר לאחר SCI שכלל PMNs, מקרופאגים / microglia ו-T-תאים. כפי שאושרו על ידי מחקרים קודמים 1-3, PMNs נכנסה לראשונה טבורי 2 שעות שלאחר פציעה הגיע לשיא של 1 dpi (איור 2 ו 4). המקרופאגים / microglia מאידך 1,4,5, לא התגלו חוט השדרה נפגע עד 3 dpi, והגיעה לשיאה בתחילה 7 dpi (איור 3 & 4). באופן מפתיע, אנו מציגים בפעם הראשונה כי מקרופאגים / microglia לשיא עבור השני 60 זמן dpi ונשארו גבוהות דרך 180 dpi (איור 3 & 4). בדומה מקרופאגים / microglia, T-cell חדירה היה צפוי להגיע לשיא 05-07 יולי dpi, אולם זרימת cytometry לא לזהות כל שינוי במספר T-cell במחצית הראשונה 7 dpi, אם כי מספר גבוה של T-תאים זוהה בשעה 9 dpi (1.6%) (איור 4). בעוד T-cell מספר פחתה ב -10 dpi, תגובה מתמשכת T-cell נצפתה דרך 180 dpi, עת 4.4% של תאים תויגו עבור CD3 (איור 4).
יחד, נתונים אלה מדגימים את זמן התגובה תלוי multiphasic של דלקת הסלולר לאחר SCI (איור 4), בשלבים הראשונים של דלקת הסלולר כללו לשיא מוקדם של PMNs 1 dpi ואחריו לשיא של ED1 + מקרופאגים / microglia 7 dpi ו-T תאים 9 dpi, ואילו בשלבים המאוחרים כללו את כל שלושת האוכלוסיות הסלולר עולה לאחר 14 dpi ולהתמיד דרך 180 dpi, עם שיא שנייה בולטת מקרופאגים / microglia ב 60 dpi. מחקר זה timecourse לבין נתונים כמותיים שנוצר על ידי זרימת cytometry אומתו בעבר, מראה תוצאות להשוות נתונים שנאספו stereology כמותי של immunolabeled סעיפים 1 חוט השדרה.
טבלה 1. הכנת שיפוע OptiPrep לסילוק פסולת המיאלין. ארבעה פתרונות OptiPrep שיפוע מבוצעים באמצעות HBSS ו OptiPrep מדולל (1:1 דילול OptiPrep, מגבים).
באיור 1. צפיפויות OptiPrep שיפוע להפריד ביותר המיאלין / פסולת נפצעו ברקמות / תאים חוט השדרה ולשפר את ההערכה תא החיסון על ידי cytometry הזרימה. (א) המיאלין / פסולת הופרד תאים (נוירונים, גליה ותאי החיסון) לאחר צנטריפוגה של רקמת ניתק את חוט השדרה דרך שיפוע OptiPrep ואחריו השאיפה של שכבת המיאלין / פסולת. (ב) PMN מספר בחוט השדרה נפגע, מראה רגישות מוגברת בזיהוי PMNs לאחר הסרת פסולת (של סטודנטים מבחן t, p = 0.0001). כל השערים תזרים cytometric נקבעו באמצעות תאים מבעלי חיים שכותרתו וללא כל פגע, n = 5 לכל קבוצה, ממוצע ± SEM. 5000 אירועים לפי המדגם היו לקרוא עבור כל המדגמים ואת הערכים הממוצעים של תאים שכותרתו חיובי באו לידי ביטוי כאחוז (± SEM) של המדגם.
איור 2. גילוי חדירה PMN בחוט השדרה נפגע cytometry הזרימה. לאחר פציעה (200 KD) מתון contusion ב T9, PMNs במהירות נכנס חוט השדרה מתחיל 2 שעות (ב) לאחר פציעה peaking 1 dpi (C). כל השערים תזרים cytometric נקבעו באמצעות תאים מבעלי חיים שכותרתו ללא פגע (A).
איור 3. איתור של מקרופאגים / חדירה microglia בחוט השדרה נפגע cytometry הזרימה. לאחר פציעה (200 KD) מתון contusion ב T9, ED1 + macrophage / microglial מספר גדל בחוט השדרה נפגעים החל מהשעה 3 dpi (ד), הגיעה לשיאה בחריפות ב 7 dpi (E), ירד לרמות נמוכות ב 14 dpi (F) לפני עולה לשיא השני 60 dpi (G), ונשאר חוט השדרה נפגע עד 180 dpi (H). IgG תיוג אלוטיפ השליטה 7 תאים השדרה dpi (ב) הראו רקע מינימלי נוגדנים תיוג לא משנה התאים נוגדנים שכותרתו מ - 2 שעות לאחר נפצעו (C) או ללא פגע (א) בעלי חיים. כל השערים תזרים cytometric נקבעו באמצעות תאים מבעלי חיים שכותרתו וללא כל פגע.
טבלה 2. דגימות בעלי חיים בניסויים timecourse. עבור כל נקודת זמן (0 שעות עד 180 dpi), חמש החיות קיבל פציעה בינונית (200 KD) contusion ב T9,ורקמות חוט השדרה הוערכו על ידי cytometry זרימה עבור מספרי PMNs, ED1 + מקרופאגים / microglia, ואת CD3 + T-תאים. עם זאת, לא כל הדגימות בעלי חיים שנמצאו בהצלחה PMN (4-5), ED1 (3-5), ואת CD3 (4-5) לזרום מנתח cytometric.
איור 4. Timecourse של דלקת הסלולר בחוט השדרה בעקבות פציעה (200 KD) מתון contusion ב T9. כפי שהוערכו על ידי cytometry זרימה, מספרי PMNs, ED1 + מקרופאגים / microglia, ואת CD3 + T-תאים לשיא בחריפות (1,7, ו 9 dpi, בהתאמה) התעקש כרונית בחוט השדרה הפגוע. N = 3 ל -5 הקבוצה, ממוצע ± SEM.
Discussion
השימוש cytometry זרימה לכמת תאים חיסוניים CNS מורכבת לפי תוכן שומנים / המיאלין ופסולת. בנוסף להפריע מחייב נוגדנים וספציפיות, פסולת המיאלין יכולה להיות בגודל דומה ומאפיינים פרור לתאי מערכת החיסון, הפחתת רגישות המדידה דיוק 8. התא הרומן הכנה השיטה המתוארת כאן הוא יעיל בהסרת פסולת המיאלין ובכך משפרת את הרגישות של זרימת cytometry לזהות שינויים דלקת הסלולר בחוט השדרה הפגוע. למשל, פינוי פסולת המיאלין על ידי זיהוי בשיטה זו משופר של תאים חיסוניים לעומת דיסוציאציה האנזימטית alone.Critically, השימוש הרומן של שיטה זו אפשרה את האפיון הראשון של דלקת הסלולר אקוטי וכרוני לאחר SCI לכלול קורס הזמן המלא ל PMNs, מקרופאגים / microglia, ו-T-תאים עד 180 dpi, וזיהה השלב השני של הרומן דלקת הסלולר. ממצאים אלה חשובים של רכיב multiphasic של neuroinflammation עשוי להיות קריטי עבור התכנון והיישום של רציונלי אסטרטגיות טיפול רפואי, כולל התערבויות שני תאים מבוססי תרופתי עבור SCI.
המערכת שיפוע OptiPrep נעשה שימוש כדי להפריד פסולת מתאי דם 9, או נוירונים לטהר מהמוח לתרבות למטרות תא 10, אך יש לנו שונה ומתקדמת מערכת זו שיטה להפרדת פסולת מתאי המיאלין ניתק את חוט השדרה, ואיפשר כימות מהיר ומדויק יותר של דלקת הסלולר על ידי cytometry הזרימה. שיטה זו יחד עם cytometry זרימת צפוי לספק התקדמות משמעותית בחקר דלקת לאחר פציעות CNS או במצבים פתולוגיים, כמו רוב המחקרים הגדירו רק דלקת הסלולר של מערכת העצבים המרכזית באמצעות טכניקות מורפולוגיים היסטולוגית שאינם תאים מסוג מסוים או לא תמיד יכולים לספק נכון הערכה כמותית. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה כמה ניסו לכמת תאים חיסוניים בחוט השדרה נפגע cytometry זרימה באמצעות חוט רקמה טרי ניתק 11,12 או תאים המופרדים באמצעות השיפוע Percoll מערכת 13, אולם מחקרים אלו הראו גם התשואות התא נמוכה או רגישות זיהוי של תאים חיסוניים.
לעומת זאת, תא שיפוע OptiPrep שיטת הכנה סיפקה לראשונה, הערכה כמותית רגיש ואמין על ידי זרימת cytometry שינויים של דלקת הסלולר בתגובה חומרת הפגיעה מדורגת מעל timecourse מורחבת עד 180 dpi. הרגישות והאמינות של ניתוח תזרים cytometric תלוי גם הספציפיות של נוגדנים לשמש כדי לזהות סוגי תאים חיסוניים ספציפיים, כמו cytometry הזרימה אינה מתירה קריטריונים מורפולוגיים נוספת להבחין בין סוגי תאים. הספציפיות של נוגדנים PMNs, מקרופאגים / microglia או T-אומר נבדק ביסודיות על PMNs הצפק ומקרופגים מכתשיים בתרבות תאים 1,2 רקמת חוט השדרה נפגע ב cytometry הזרימה. יחד עם מערכת שיפוע OptiPrep, נוגדנים אלה המשמשים cytometry זרימה תרמו הדור ניתוח כמותי הזמני של דלקת הסלולר סיפקה תובנה חדשה על הדינמיקה של microenvironment SCI, וזיהו לראשונה מענה multiphasic המורחבת דלקת הסלולר. זו התגובה של תאים multiphasic לאחר SCI עשוי להיות חשוב לחקור את תפקידם של סוגי תאים מסוימים נוכח בזמנים מסוימים לאחר פציעה או ליצור התערבויות טיפוליות נגד סוגי תאים ספציפיים שיכולים להחמיר פציעות. יתר על כן, ממצאים אלה עשויים לסייע בפיתוח של הרציונל מתאים התערבויות סמים או מבוססי תאים אופטימלי SCI.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים רבקה נישי, MS, טכנאים המתקן & כריסטופר ודנה ריב קרן בעלי חיים Core באוניברסיטת קליפורניה על עזרתם בניתוח של בעלי חיים. אנו מודים גם גבריאלה פינס, אושה Nekanti ו Denisse מורנו להכנות, סיוע כתב היד ווידאו טכנית לירות ואנימציה. מחקר זה נתמך על ידי NINDS (RO1 NS43428-01 ל AJA), פרויקט שיתוק של אמריקה (PPA-32574 כדי HXN), ו קליפורניה המכון לרפואה הרגנרציה (CIRM) לתאי גזע הדרכה פרס T1-00008 כדי HXN. KDB נתמך על ידי תוכנית אימונים מולקולרית תאית המוח באוניברסיטת קליפורניה (T32 NS007444).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OptiPrep | Fisher Scientific | NC9182490 | |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H1387 | |
| Rabbit anti-rat PMN (FITC) | Accurate Chemical & Scientific Corporation | AIFAD51140 | |
| Mouse anti-rat ED1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA341A488 | |
| Mouse anti-rat CD3 (FITC) | AbD Serotec | MCA772F | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DME | Sigma-Aldrich | D1152 | |
| MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA1209A488 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | |
| Rabbit serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000-120011-000-120 | |
| Mouse serum | Jackson ImmunoResearch | 015-000-120 | |
| Cell Strainer | BD Biosciences | 352340 |
References
- Beck, K. D. Quantitative analysis of cellular inflammation after traumatic spinal cord injury: evidence for a multiphasic inflammatory response in the acute to chronic environment. Brain. 133, 433-447 (2010).
- Nguyen, H. X., Galvan, M. D., Anderson, A. J. Characterization of early and terminal complement proteins associated with polymorphonuclear leukocytes in vitro and in vivo after spinal cord injury. J Neuroinflammation. 5, 26-26 (2008).
- Saville, L. R. A monoclonal antibody to CD11d reduces the inflammatory infiltrate into the injured spinal cord: a potential neuroprotective treatment. J Neuroimmunol. 156, 42-57 (2004).
- Popovich, P. G., Wei, P., Stokes, B. T. Cellular inflammatory response after spinal cord injury in Sprague-Dawley and Lewis rats. J Comp Neurol. 377, 443-464 (1997).
- Popovich, P. G. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158, 351-365 (1999).
- Jones, T. B., Hart, R. P., Popovich, P. G. Molecular control of physiological and pathological T-cell recruitment after mouse spinal cord injury. J Neurosci. 25, 6576-6583 (2005).
- Kigerl, K. A., McGaughy, V. M., Popovich, P. G. Comparative analysis of lesion development and intraspinal inflammation in four strains of mice following spinal contusion injury. J Comp Neurol. 494, 578-594 (2006).
- Lipton, H. L., Kallio, P., Jelachich, M. L. Simplified quantitative analysis of spinal cord cells from Theiler's virus-infected mice without the requirement for myelin debris removal. J Immunol Methods. 299, 107-115 (2005).
- Bagamery, K., Kvell, K., Landau, R., Graham, J. Flow cytometric analysis of CD41-labeled platelets isolated by the rapid, one-step OptiPrep method from human blood. Cytometry A. 65, 84-87 (2005).
- Majd, S., Zarifkar, A., Rastegar, K., Takhshid, M. A. Culturing adult rat hippocampal neurons with long-interval changing media. Iran Biomed J. 12, 101-107 (2008).
- Tjoa, T. The use of flow cytometry to assess neutrophil infiltration in the injured murine spinal cord. J Neurosci Methods. 129, 49-59 (2003).
- Gonzalez, R., Glaser, J., Liu, M. T., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Reducing inflammation decreases secondary degeneration and functional deficit after spinal cord injury. Exp Neurol. 184, 456-463 (2003).
- Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
