טרנסלוקציה מקוטב של חלבוני ניאון ב Xenopus האאקטודרם בתגובה איתות Wnt

Summary

האאקטודרם Xenopus עובריים הפך מודל אטרקטיבי עבור מחקרים של הקוטביות בתא. Assay מתואר, שבה חלוקת subcellular של חלבוני ניאון נבחנת בתאים האאקטודרם. פרוטוקול זה יעזור כתובת לשאלות הקשורות שליטה מרחבית של איתות.

Abstract

הקוטביות Cell הוא מאפיין בסיסי של התאים האיקריוטים כי מוסדר באופן דינאמי במהלך ההתפתחות העוברית ^{1, 2} על ידי גורמים פנימיים וחיצוניים כאחד. אחד במעברי האותות המעורבים תקנה זו הוא מסלול ה-Wnt, אשר משמש פעמים רבות במהלך embryogenesis ו קריטי עבור מחלות אנושיות ^{3, 4, 5.} רכיבים מולקולריים מרובות של מסלול זה מתואמת להסדיר איתות בצורה מרחבית מוגבלת, אבל המנגנונים אינם מובנים במלואם. Xenopus תאים עובריים אפיתל היא מערכת מצוינת ללמוד לוקליזציה subcellular של איתות חלבונים שונים. חלבונים היתוך פלורסנט באים לידי ביטוי על ידי עוברי Xenopus microinjection RNA, explants ectodermal מוכנים ולוקליזציה חלבון מוערך על ידי epifluorescence. בפרוטוקול זה ניסיוני אנו מתארים כיצד לוקליזציה subcellular של Diversin, חלבון cytoplasmic כי היה מעורב איתות הקוטביות בתא נחישות ^{6, 7} הוא דמיינו בתאים Xenopus ectodermal ללמוד התמרה האות Wnt ^8. Coexpression של ליגנד Wnt או קולטן מסולסלת משנה את חלוקת Diversin התמזגו עם חלבון פלואורסצנטי אדום, RFP, ומגייסת אותו קרום התא באופן מקוטב ^{8, 9.} זה פרוטוקול לשעבר vivo אמור להיות תוספת מועילה במבחנה של בתאי יונקים בתרבית, שבו השליטה במרחב של איתות שונה מזו של רקמת שלם הרבה יותר קשה לנתח.

Protocol

1. הפריה במבחנה של Xenopus ביצים

1. השג ביצים צפרדעים נקבה כי הוזרקו גונדוטרופין כוריוני אנושי (400 יחידה / צפרדע) 12 שעות לפני הניסוי.
2. מניחים ביצים לתוך כמות קטנה (0.5-1 מ"ל) של פתרון 1 x שונה של מארק Ringer (MMR) ¹⁰ כדי להפרות את הביצים אותם במבחנה עם חתיכה קטנה של testis גזור. אחרי 2-3 דקות, להוסיף 0.1 x MMR כדי לכסות את פני השטח של כל הביצים. ב 20 דקות, מעיל ביצה וריבה יוסר על ידי ציסטאין 3% - HCL (במונחי pH 8 עם סודיום הידרוקסיד). ביצים נשטפים עם 0.1 x MMR שלוש פעמים נשאר חממה קר (13 מעלות צלזיוס) זריקות.
3. ביציות מופרות מותר לפתח לשלב 2-4 תאים. עבור זריקות, העוברים מועברים לתוך פתרון המכיל Ficoll 3%, 0.5 x MMR.

2. RNA Microinjection

1. RNAs מסונתזים מתבניות ה-DNA לינארית באמצעות mMessage mMachine Kit (Ambion) ו מדולל במים RNase ללא בריכוז המניות של 0.1-1 מיקרוגרם / μl. מינון אופטימאלי של RNAs זריקות נקבעים בניסויים הטייס. RNAs עבור Diversin-RFP, סמן קרום GFP-CAAX ו מסולסלת 8 משמשים 0.1-1 ננוגרם לכל זריקה.
2. מחטי הזרקה מוכנים עם חולץ מחט מתוך נימי ולאחר מכן עם מטחנת מחט. לפני זריקה, מחט כל מכויל עם מים כדי להוציא 10 nl של הזרקת נוזל לכל.
3. עבור זריקות, עוברים מונחות על צלחת פלסטיק לתוך אגל גדול של Ficoll 3%, 0.5 x MMR. אחת microliter של פתרון RNA הוא נשאב לתוך מחט מזרק עם Narishige microinjector. 10 nl של רנ"א מוזרק בלסטומרים חיה של 8 תאים העוברים 2-3 פעמים. עוברים מוזרק מועברים לתוך באר של צלחת 12 הבאר.

3. הכנת Ectodermal Explants

1. כאשר עוברים מוזרק להגיע בשלב מוקדם gastrula, הם מועברים לתוך פתרון MMR 0.6 x בצלחת פלסטיק 3 ס"מ מצופה agarose 1%. קרום Vitelline מוסרת באופן ידני עם זוג מלקחיים. Explants Ectodermal הם נכרת מן העוברים באמצעות מחט טונגסטן hairloop.
2. Explants Ectodermal מועברים לתוך בקבוקון זכוכית קבוע עם פורמלדהיד 3.7% ב פוספט בופר סליין (PBS) במשך 30 דקות. Explants קבוע נשטפים עם PBS שלוש פעמים (10 דקות כל אחד). DAPI נכלל לתוך לשטוף את כתם שלישי גרעינים.
3. Explants הם רכובים על זכוכית שקופית. שתי רצועות של נייר דבק מחוברים לשקופית ואת explants ממוקמים בין שתי רצועות. מאז את המשטח החיצוני של explants הוא פיגמנט, הצד הפנימי של explants צריך להתמודד עם מטרה מיקרוסקופ. הוסף 2-3 טיפות 20 μl של הפתרון הרכבה (70% גליצרול ב PBS כולל 25 מ"ג / מ"ל DABCO, נגד דהייה מגיב) ^11. שים coverslip על העליונה.

4. הדמיה של Explants תחת מיקרוסקופ פלורסנט

1. דוגמאות הן מתחת למיקרוסקופ Axioplan Zeiss ניאון עם מסננים מתאימים.
2. תמונות נלקחים עם הקובץ המצורף Apotome לדמיין מטוס ספציפיים explants עצמאית מספר.

5. Cryosectioning

Cryosectioning היא דרך חלופית כדי להמחיש את ההפצה של חלבוני ניאון בתא רלוונטי יותר עבור immunostaining. בשלב 10, עוברים קבועים עבור 1-2 שעות עם מיצב של דנט (20% DMSO, מתנול 80%), שטפתי עם PBS, ו 15% מוטבע פתרון gelatin/15% סוכרוז דגים ^11. עוברים מוקפאים במהירות מוטבע על קרח יבש cryosections נוצרות על לייקה cryostat. חתכים יכלול תאים ectodermal שיורשים RNAs מוזרק ומוצרי חלבון המתורגם שלהם. סעיפים לשמור הקרינה וניתן immunostained עם נוגדנים ספציפיים ואז שכותרתו עם נוגדנים משני מצומדות עם פלואורסצנטי. גרעינים מגואלות DAPI. התקשורת הרכבה זהים כפי שתואר לעיל. הדמיה יכול להתבצע כפי שתואר לעיל.

6. נציג תוצאות:

באיור 1. קולטן מסולסלת המתגייסים Diversin על קרום התא. תאים האאקטודרם להביע 8 מסולסלת (Xfz8) ו-RFP דיב RNAs לחשוף דיב-RFP על קרום התא, במקום centrosome (כפי שעולה מכתים שיתוף g-טובולין). תכנית הניסוי היא בראש; טיפוסי חתך מוצג.

Discussion

השתמשנו בפרוטוקול לעיל כדי לאפיין את לוקליזציה subcellular של Diversin. ב explants קוטב חיה, Diversin-RFP התגלתה ליד הגרעין colocalized עם טובולין-g, סמן centrosomal, ב cryosections (איור 1). לאחר לוקליזציה subcellular של חלבון מזוהה, בונה המחיקה יכול להיווצר להקים אילו תחומים החלבון הכרחי ומספיק לוקליזציה subcellular. בגישה זו, התחומים לוקליזציה centrosomal של Diversin שמופו לאמצע וב-carboxy מסוף תחומים של החלבון, המכיל גם מוטיב סליל ^{מפותל-8.}

הפרוטוקול זהה ניתן להשתמש במחקרים, בהם לוקליזציה חלבון משתנה בתגובה איתות. מצאנו כי חלבונים המופרשים Wnt לפעול להעביר דיב-RFP למבנים הסמוכים punctate קרום התא, ואילו FZ8 המתגייסים דיב-RFP על קרום התא טלאים (איור 1). אנחנו עוד גילה כי תחום carboxy-מסוף אינו חיוני לגיוס קרום כשלעצמה, אלא נדרש גיוס הממברנה מקוטב.

לסיכום, פרוטוקול הניסוי מעל יעזור במחקרים שונים של חלבונים אינטראקציות לוקליזציה חלבון תאים סלולריים שונים לאחר גירוי התאים עם גורמי גדילה ספציפיים או איתות חלבונים.