Семь шагов к звездчатых клеток

Summary

Здесь мы опишем метод изоляции печени звездчатые клетки печени мышей. Для очистки звездчатые клетки, печень мыши перевариваются На месте И В пробирке По проназы-коллагеназы лечения до центрифугирования в градиенте плотности. Этот метод дает очень чистый звездчатых клеток печени.

Abstract

Звездчатых клеток печени являются печень-нерезидентов клетки звездчатых морфологии и расположены в пространстве между Диссе печени синусоидальных эндотелиальных клеток и гепатоцитов ^1,2. Stellate клетки, полученные из костного мозга предшественников и хранить до 80% от общего витамина тела ^{1, 2.} После активации звездчатых клеток дифференцироваться в миофибробластов производить внеклеточного матрикса, тем самым способствуя фиброза печени ^3. Основываясь на их способность к сокращению, myofibroblastic клетки звездчатые может регулировать сосудистый тонус связанные с портальной гипертензией ^4. В последнее время мы показали, что клетки печеночной звездчатые являются мощными антиген представляющих клеток и могут активировать NKT клетки, а также обычные Т-лимфоциты ^5.

Здесь мы представляем метод для эффективной подготовки печеночных звездчатых клеток печени от мыши. Из-за их perisinusoidal локализации, изоляции звездчатых клеток печени является многоступенчатым процессом. Для того чтобы сделать звездчатых клеток доступны для изоляции от пространства Диссе, мышь печени являются перфузии на месте с пищеварительными ферментами проназы Е и коллагеназы П. После перфузии ткани печени подвергается дополнительной ферментной обработки с проназы Е и Р в Коллагеназа пробирке. Впоследствии метод использует огромное количество витамина А хранения липидных капель в клетках печеночных звездчатых. Эта функция позволяет разделение звездчатых клеток от других видов печеночных клеток путем центрифугирования на 8% градиент Nycodenz. Протокол, описанный здесь дает очень чистое и однородное население звездчатых клеток. Чистоту препаратов можно оценить с помощью окрашивания маркера молекулы глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP), до анализа флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии. Кроме того, световой микроскопии показывает уникальный внешний вид звездообразных печеночных звездчатых клеток, которые укрывают большое количество липидных капель.

Взятые вместе, мы представляем подробный протокол для эффективной изоляции печеночных звездчатых клеток, в том числе представитель изображения их внешний вид и морфологические GFAP выражения, которые помогают определить сущность звездчатые клетки.

Protocol

C57BL / 6 мышей должны быть использованы на ~ 20-недельного возраста и старше. Использование мышей-самцов весом 25-30г рекомендуется. Выход звездчатых клеток может быть увеличено путем подачи мышей витамина обогащенный диета в течение 2 месяцев до звездчатых изолятор. Примерно 2х10 ^{5 клеток} печеночных звездчатых может быть очищена от печени одного C57BL / 6, мыши, в то время как выход из звездчатых клеток Balb / с мышей значительно выше. Следующие протокол доводят до 5 мышей. Уход животных и эксперименты были проведены в соответствии с утвержденными Уходу за животными и протоколы Используйте комитета.

1. В месте перфузии....

Discussion

Звездчатых клеток печени регулируют существенные физиологические и патофизиологические процессы в печени. Более того, звездчатые клетки обладают антигенпрезентирующие свойства, что делает их важной составляющей печеночной иммунного ответа. Хотя звездчатых клеток печени составляет 10-15% от общего числа клеток в печени, выделение этих клеток является сложной задачей из-за их локализации в пространстве perisinusoidal Диссе.

Здесь мы приведем простой метод, чтобы изолировать печеночных звездчат.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Каталог Нет.
70μm сотовый фильтр	BD	352350
CaCl 2 х 2H 2 O	Sigma-Aldrich	C3306
Коллагеназа P	Roche	11249002001
DMEM	Гибко	11960
Я ДНКазы	Roche	10104159001
DPBS	Cellgro	21-031-резюме
EGTA	Fluka	3777
Эмбриональной телячьей сыворотки	Гибко	16000
Глюкоза	Sigma-Aldrich	G7528
Трубы центрифугирования в градиенте	Greiner Bio-One	163160
HEPES	Гибко	15630
KCL	Sigma-Aldrich	P9541
KH 2 PO 4	Sigma-Aldrich	P9791
L-глютамин	Гибко	25030
MgCl 2 х 6H 2 O	Fluka	63068
MgSO 4 х 7H 2 O	Sigma-Aldrich	M2773
Na 2 HPO 4 × 2H 2 O	Fluka	71643
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
NaH 2 PO 4 × H 2 O	Fluka	71507
NaHCO 3	Fluka	71628
Nycodenz	Accudenz AG	AN7050/BLK
Пенициллин / стрептомицин	Гибко	15140
Перистальтический насос	Коул Пармер	HV-7523-70
Фенол красный	Sigma-Aldrich	P4633
Проназы E	Calbiochem	7433-2
Силиконовые трубы	Masterflex	HV-96440-14
Натрий Пируват	Гибко	11360
Культуры ткани колбу (25 см 2)	BD	353108
Крылатые инфузионный набор	Terumo	1SV27EL