Summary
Здесь мы опишем метод изоляции печени звездчатые клетки печени мышей. Для очистки звездчатые клетки, печень мыши перевариваются
Abstract
Звездчатых клеток печени являются печень-нерезидентов клетки звездчатых морфологии и расположены в пространстве между Диссе печени синусоидальных эндотелиальных клеток и гепатоцитов 1,2. Stellate клетки, полученные из костного мозга предшественников и хранить до 80% от общего витамина тела 1, 2. После активации звездчатых клеток дифференцироваться в миофибробластов производить внеклеточного матрикса, тем самым способствуя фиброза печени 3. Основываясь на их способность к сокращению, myofibroblastic клетки звездчатые может регулировать сосудистый тонус связанные с портальной гипертензией 4. В последнее время мы показали, что клетки печеночной звездчатые являются мощными антиген представляющих клеток и могут активировать NKT клетки, а также обычные Т-лимфоциты 5.
Здесь мы представляем метод для эффективной подготовки печеночных звездчатых клеток печени от мыши. Из-за их perisinusoidal локализации, изоляции звездчатых клеток печени является многоступенчатым процессом. Для того чтобы сделать звездчатых клеток доступны для изоляции от пространства Диссе, мышь печени являются перфузии на месте с пищеварительными ферментами проназы Е и коллагеназы П. После перфузии ткани печени подвергается дополнительной ферментной обработки с проназы Е и Р в Коллагеназа пробирке. Впоследствии метод использует огромное количество витамина А хранения липидных капель в клетках печеночных звездчатых. Эта функция позволяет разделение звездчатых клеток от других видов печеночных клеток путем центрифугирования на 8% градиент Nycodenz. Протокол, описанный здесь дает очень чистое и однородное население звездчатых клеток. Чистоту препаратов можно оценить с помощью окрашивания маркера молекулы глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP), до анализа флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии. Кроме того, световой микроскопии показывает уникальный внешний вид звездообразных печеночных звездчатых клеток, которые укрывают большое количество липидных капель.
Взятые вместе, мы представляем подробный протокол для эффективной изоляции печеночных звездчатых клеток, в том числе представитель изображения их внешний вид и морфологические GFAP выражения, которые помогают определить сущность звездчатые клетки.
Protocol
C57BL / 6 мышей должны быть использованы на ~ 20-недельного возраста и старше. Использование мышей-самцов весом 25-30г рекомендуется. Выход звездчатых клеток может быть увеличено путем подачи мышей витамина обогащенный диета в течение 2 месяцев до звездчатых изолятор. Примерно 2х10 5 клеток печеночных звездчатых может быть очищена от печени одного C57BL / 6, мыши, в то время как выход из звездчатых клеток Balb / с мышей значительно выше. Следующие протокол доводят до 5 мышей. Уход животных и эксперименты были проведены в соответствии с утвержденными Уходу за животными и протоколы Используйте комитета.
1. В месте перфузии печени мышей с пищеварительными ферментами
- Теплый SC1 буфера и решения фермента перфузии в 37 ° С водяной бане.
- Горы крылатых вливания на силиконовые трубки перистальтического насоса.
- Калибровка насоса с PBS получение ламинарного течения 6.5ml/min, что скорость потока, который будет использоваться для на месте перфузии печени. Равновесия силиконовые трубки с SC1 решение.
- Анестезию мыши, внутрибрюшинного введения кетамина (90 мг / кг) и Ксилазин (10 мг / кг) решение и тест на потерю рефлексов для обеспечения глубокой наркотизации.
- Fix мыши в лежачем положении на подходящее основание.
- Используйте ножницы и щипцы для выполнения продольных разрез в брюшной кожу и выставить брюшины.
- Аккуратно откройте брюшины и двигаться кишечника из брюшной полости в левой части животного, чтобы разоблачить воротной вены.
- Вставьте канюлю от вливания в воротной вене. Для этого шага, использование стереомикроскопа рекомендуется.
- Начало перфузии печени с 30 мл решение SC1. Откройте нижнюю полую вену сразу же после начала потока. Успешное промывки печени свидетельствует потеря цвета ткани печени.
- Заливать печени с 30 мл раствор E проназы. После успешного пищеварения, печени долях будет раздуваться, и дольки появится через различные капсулы.
- Заливать печени с 30 мл раствор P коллагеназы. Печень в этот момент потерял свою форму и выглядит атонических и аморфным.
- Аккуратно отделите печени от диафрагмы и окружающие органы и хранить его в 70 мл SC2 решение на льду.
- Повторите процедуру для дополнительных мышей.
2. В пробирке переваривания мыши печени
При дополнительном размещении всех рабочих этапов должны проводиться в стерильных условиях в ламинарном боксе.
- Разрежьте печень на куски примерно 2x2x2mm 3 с помощью острых ножниц.
- Смешайте 70 мл суспензии SC2 в том числе печень куски с 50 мл проназы E-коллагеназы решение Р и добавьте 1 мл раствора ДНКазы я.
- Дайджест печени для 20 минут при 37 ° С при перемешивании.
3. Центрифугирования в градиенте плотности
- Фильтры клеточной суспензии через 70μm фильтры клетки в 6 50 мл пробирки Сокол и добавить до 50 мл с SC2 буфера. Центрифуга в течение 10 минут на 600 г и 4 ° C.
- Тщательно аспирата 40 мл надосадочной, затем добавить 150 мкл ДНКазы Я раствора в каждую трубку и ресуспендирования клеток.
- Бассейн клеточные суспензии в 4 50 мл пробирки Сокол и промыть GBSS-B, центрифуги в течение 10 минут на 600 г и 4 ° C.
- Тщательно аспирата, поскольку значительная часть надосадочной возможно, не нарушая гранулы и добавить 150 мкл ДНКазы я решение в каждую пробирку. Ресуспендируют ячейки гранул в 10 мл GBSS-B в трубке.
- Бассейн клеток в 50 мл пробирки 2 Сокол и добавить GBSS-B, чтобы общий объем 36ml в трубке. Добавить 14 мл Nycodenz решение в каждую пробирку и хорошо перемешать.
- Передача 10 мл клеточной суспензии в одну трубку 12мл центрифугирования в градиенте, в результате чего 10 труб в общей сложности. Аккуратно наложения клеточной суспензии с 1,5 мл GBSS-B в трубке.
- Центрифуга градиентов для 15 минут в 1500 г и 4 ° C, без тормозов. Впоследствии, гепатоциты будет гранулированный на дне пробирки в то время как звездчатые клетки находятся в интерфазе в виде белого кольца.
- Тщательно урожая межфазной содержащие звездчатых клеток и мыть их с GBSS-Б; центрифуге в течение 10 минут на 600 г и 4 ° C.
- Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 20 мл DMEM с добавлением 10% тепла инактивированной ФБС, 1% пенициллина / стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 10 мМ HEPES. Передача клеток в колбах культуры тканей с концентрацией 2х10 4 клеток / см 2. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% СО 2.
- Изменение средств массовой информации, как только звездчатых клеток печени являются приверженцем (примерно 2 часа после подготовки), чтобы смыть мертвые клетки и клеточных обломков.
- На следующий день, звездчатые ячейкиы должны развивать свои характерные звездных морфологии с перинуклеарные витамин-хранения пузырьки липидов.
- Для последующих экспериментах, звездчатых клеток печени может быть легко отделена от не-покрытием пластмассовые поверхности с использованием мягкого ферментативных решения, такие как Accutase, например,
4. Представитель Результаты:
После подготовки печеночных звездчатых клеток, используя протокол при условии, чистота изолированной популяции могут быть проверены рассматривает три основные характеристики этого типа клеток, например, звезда-образную форму, перинуклеарные капли липидов, и экспрессия белка глиальных фибриллярного кислого (GFAP ). Представитель фотографии характерный внешний вид печеночных звездчатых клеток 2 часа после того, изолятор, а также в день 1 и 3 в культуре пробирке изображены на рисунке 1. На рисунке 2 показан представителю иммунофлуоресцентного метода для GFAP печени звездчатые клетки, которые были культивировали в течение 3 дней после изолятор. Звездчатых клеток печени дифференцироваться в клетки во время myofibroblastic в культуре пробирке. Характерной отличительной чертой этих активированных клеток звездчатого является выражением альфа-актин гладких мышц (αSMA). На рисунке 3 показана иммунофлуоресцентного метода для ОУРА и миозин IIA в активированных звездчатых клеток на 7-й день в культуре пробирке.
Рисунок 1. Характеристика морфологии клеток печени звездчатые. Звездчатые клетки были выделены из печени мышей с использованием протокола предусмотрено. Образах звездчатых клеток после 2h изолятор (а, б), а также в день 1 (с) день и 3 (г) в культуре пробирке. Звездчатых клеток печени выставку большое количество липидных везикул на перинуклеарные сайтов и приобретают свои отличительные астрального морфологией во время первых дней в культуре пробирке (увеличение 200х).
Рисунок 2. Звездчатые клетки печеночной специально выразить GFAP в печени. Звездчатых клеток были выделены и immunofluorescently окрашивают в течение GFAP (красный) на 3-й день в культуре пробирке. Клеточных ядер приведены на синий (Hoechst пятно).
Рисунок 3. Звездчатые клетки печени дифференцироваться в миофибробластов. Печеночные звездчатые клетки, выделенные из C57BL / 6 мышей культивировали в течение 7 дней. Впоследствии они были переведены в камеру слайды и окрашивают в течение ОУРА (показаны красным) и миозина IIA (изображены зеленым цветом). Клеточных ядер были контрастно с Hoechst (синий).
| SC1 буфера | |
| EGTA | 190mg |
| Глюкоза | 900mg |
| HEPES | 10 мл 1М раствора акции |
| KCl | 400 мг |
| Na 2 HPO 4 х 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH 2 PO 4 × H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| Фенол красный | 6 мг |
| дН 2 O | заполнить до 1 л |
| SC2 буфера | |
| CaCl 2 х 2H 2 O | 560mg |
| HEPES | 10 мл 1М раствора акции |
| KCl | 400 мг |
| Na 2 HPO 4 х 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH 2 PO 4 × H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| Фенол красный | 6 мг |
| дН 2 O | заполнить до 1 л |
| GBSS-буфера | |
| KCl | 370mg |
| CaCl 2 х 2H 2 O | 225mg |
| Глюкоза | 991mg |
| KH 2 PO 4 | 30 мг |
| MgCl 2 х 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 х 7 H 2 O | 70мг |
| Na 2 HPO 4 х 2 H 2 O | 75 мг |
| NaHCO 3 | 227mg |
| Фенол красный | 6 мг |
| дН 2 O | заполнить до 1 л |
| GBSS-B буфера | |
| CaCl 2 х 2H 2 O | 225mg |
| Глюкоза | 991mg |
| KCl | 370mg |
| KH 2 PO 4 | 30 мг |
| MgCl 2 х 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 х 7 H 2 O | 70мг |
| Na 2 HPO 4 х 2 H 2 O | 75 мг |
| NaCl | 8g |
| NaHCO 3 | 227mg |
| Фенол красный | 6 мг |
| дН 2 O | заполнить до 1 л |
| Проназы E перфузии решения | |
| Проназы E | 100 мг (4000 PU / мг мин) |
| SC2 буфера | 200мл |
| Коллагеназа P перфузии решения | |
| Коллагеназа P | 85mg (1,78 ед / мг Лио) |
| SC2 буфера | 200мл |
| Проназы E-коллагеназы P Решение | |
| Проназы E | 50 мг (4000 PU / мг мин) |
| Коллагеназа P | 85mg (1,78 ед / мг Лио) |
| SC2 буфера | 50мл |
| ДНКазы я Решение | |
| Я ДНКазы | 6 мг (около 2000U/mg) |
| GBSS-B | 3 мл |
| Решение Nycodenz | |
| Nycodenz | 8g |
| GBSS- | 28 мл |
Таблица 1. Буферы и фермента решений, необходимых для выделения клеток печени звездчатые. РН все буферы должны быть приспособлены для 7.3-7.4. Кроме того, стерильной фильтрации все буферы рекомендуется. Важно адаптировать количество фермента, используются в соответствии с данной ферментативной активностью.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Звездчатых клеток печени регулируют существенные физиологические и патофизиологические процессы в печени. Более того, звездчатые клетки обладают антигенпрезентирующие свойства, что делает их важной составляющей печеночной иммунного ответа. Хотя звездчатых клеток печени составляет 10-15% от общего числа клеток в печени, выделение этих клеток является сложной задачей из-за их локализации в пространстве perisinusoidal Диссе.
Здесь мы приведем простой метод, чтобы изолировать печеночных звездчатых клеток печени от мыши на на месте пищеварения и последующего центрифугирования в градиенте. Этот протокол позволяет изоляции высокочистых звездчатых клеток подходит для иммунологических анализов.
Субъекта изолированных клеток можно управлять рассматривает три основные характеристики печени звездчатые клетки, в том числе звезды-образную форму, перинуклеарные витамин-хранения пузырьки липидов, и выражение GFAP. Согласно этим критериям, звездчатые клетки, полученные с использованием описанных протокол обычно ~ 99% чистой по оценке иммунофлуоресцентного окрашивания и проточной цитометрии. Потенциальные загрязнителей звездчатые выделения ячейки Купфера клетки печени и дендритные клетки (ДК). Таким образом, мы проанализировали звездчатые культурах клеток с помощью проточной цитометрии для окрашивания поверхности молекул F4/80 (клетки Купфера) и CD11c (DC). Соответственно, отсутствие F4/80 + и CD11c + клеток исключено загрязнение звездчатые подготовка ячейки Купфера клетки или DC. Таким образом, никаких дополнительных методов обогащения и сортировки требуется, что делает описанный протокол для печеночных звездчатых изолятор удобной и быстрой процедурой.
Что касается субъекта звездчатых клеток печени, важно иметь в виду, что в лабораторных культурах клеток активируются и дифференцируются в миофибробластов, которые принципиально отличаются от покоящихся клеток звездчатого. Во время этой метаморфозы, клеток печени звездчатые свободные выражения GFAP и upregulate αSMA, которые могут быть легко обнаружены на 7-й день в культуре пробирке. Примечательно, что активацию звездчатых клеток в пробирке сильно напоминает их активации шаблон в естественных условиях 6. Это находит отражение в их участии в фиброз печени, например, хотя и другие продуцирующие коллаген населения myofibroblast способствовать развитию болезни 7. В заключение, печени звездчатые клетки, полученные по описанным протоколом служить моделью для покоящихся клеток звездчатого, а также для активированного печени миофибробластов в зависимости от их стадии дифференцировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась премии Смита семьи за выдающиеся достижения в области биомедицинских исследований и NIH RO1 AI083426-01 (FW). Патрик Maschmeyer и Мелани Flach поддерживаются стипендии кандидат от Boehringer Ingelheim Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Collagenase P | Roche Group | 11249002001 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960 | |
| DNase I | Roche Group | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Peristaltic Pump | Cole-Parmer | HV-7523-70 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 | |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 | |
| Silicone Tube | Masterflex (Cole Palmer) | HV-96440-14 | |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD Biosciences | 353108 | |
| Winged Infusion Set | Terumo Medical Corp. | 1SV27EL |
References
- Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
- Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
- Gressner, A. M. &, Weiskirchen, R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).
- Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut. 50, 571-581 (2002).
- Winau, F. Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses. Immunity. 26, 117-129 (2007).
- Minicis, S. D. e Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo. Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).
- Knittel, T. Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair. Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).
