Summary
כאן אנו מתארים שיטת הבידוד של stellate בתאי הכבד מהכבד העכבר. עבור טיהור תא stellate, כבדי עכבר מתעכלים
Abstract
Stellate תאים כבדית הם הכבד תושב מורפולוגיה של תאים דמויי כוכב ממוקמים בחלל Disse בין תאים בכבד סינוסי האנדותל 1,2 hepatocytes. תאים Stellate נגזרות מבשרי מח עצם לאחסן עד 80% של ויטמין הגוף הכולל 1, 2. עם ההפעלה, stellate תאים להתמיין myofibroblasts לייצר תאי מטריקס, ובכך לתרום לייפת הכבד 3. בהתבסס על יכולתם החוזה, תאים stellate myofibroblastic יכול לווסת את הטון כלי הדם הקשורים ליתר לחץ דם הפורטל 4. לאחרונה, הראינו כי stellate תאים בכבד הם תאים אנטיגן חזק הצגת ויכול להפעיל תאים NKT וכן לימפוציטים מסוג T קונבנציונאלי 5.
כאן אנו מציגים שיטה להכנת יעילה של תאים בכבד stellate מהכבד העכבר. בשל לוקליזציה perisinusoidal שלהם, בידוד של תאים stellate הכבד הוא תהליך רב שלבי. על מנת להבהיר תאים stellate נגיש במנותק מן החלל של Disse, כבדי העכבר הם perfused באתרו עם אנזימי עיכול Pronase E ו collagenase זלוף פ בעקבות, רקמת הכבד נתונה טיפול אנזימטי נוסף עם Pronase E ו-P ב collagenase במבחנה. כתוצאה מכך, השיטה מנצלת את כמות מסיבית של ויטמין A, אחסון טיפות השומנים בתאי stellate הכבד. תכונה זו מאפשרת הפרדה של תאים stellate של סוגי תאים אחרים הכבד על ידי צנטריפוגה על שיפוע Nycodenz 8%. פרוטוקול המתואר כאן התשואות אוכלוסייה טהור מאוד הומוגני של תאים stellate. טוהר ההכנות ניתן להעריך על ידי מכתים את מולקולת חלבון סמן גליה חומצי fibrillary (GFAP), לפני הניתוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי או cytometry הזרימה. יתר על כן, במיקרוסקופ אור חושף את המראה הייחודי של בצורת כוכב stellate בתאי הכבד כי הנמל כמויות גדולות של טיפות השומנים.
יחדיו, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור בידוד יעיל של stellate בתאי הכבד, כולל תמונות של נציג המראה המורפולוגי שלהם ביטוי GFAP המסייעים להגדיר את הישות תא stellate.
Protocol
C57BL עכברים / 6 יש להשתמש ב ~ 20 שבועות ומעלה. השימוש עכברים זכרים במשקל של 25-30G מומלץ. התשואה של תאים stellate יכולה להיות מוגברת על ידי האכלה לעכברים דיאטה מועשר בויטמין עבור 2 חודשים לפני stellate בידוד התא. כ 2x10 5 stellate תאים בכבד יכולה להיות מטוהרים מהכבד של העכבר C57BL / 6 אחת, בעוד התשואה של תאים stellate מ Balb / c עכברים גבוה במידה ניכרת. פרוטוקול הבאים מותאם 5 עכברים. טיפול בבעלי חיים ניסויים בוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים אישרה מוסדיים ועדת פרוטוקולים שימוש.
1. זלוף באתרו של כבדי עכבר עם אנזימי עיכול
- חם החיץ sc1 ו זלוף פתרונות האנזים אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- הר עירוי מכונף להגדיר על צינור סיליקון של משאבה peristaltic.
- כייל את המשאבה עם PBS להשיג תזרים למינרית של 6.5ml/min, המהווה את קצב הזרימה כי ישמש ב זלוף באתרו של הכבד. לאזן את צינור סיליקון עם פתרון sc1.
- להרדים את העכבר באמצעות זריקה intraperitoneal של קטמין (90 מ"ג / ק"ג) ו Xylazine (10 מ"ג / ק"ג) פתרון מבחן עבור אובדן הרפלקסים, כדי להבטיח הרדמה עמוקה.
- תקן את העכבר בעמדת פרקדן על בסיס מתאים.
- השתמש מספריים מלקחיים לבצע חתך אורכי בעור הבטן ולחשוף את הצפק.
- בזהירות לפתוח את הצפק ולהעביר את המעיים מתוך חלל הבטן בצד שמאל של החיה על מנת לחשוף את וריד השער.
- הכנס את צינורית של אינפוזיה לווריד להגדיר את הפורטל. במשך שלב זה, השימוש stereomicroscope מומלץ.
- הפעל את זלוף של הכבד עם פתרון sc1 30 מ"ל. פתח את הווריד הנבוב נחות מיד לאחר שיזם את הזרימה. שטיפה מוצלחת של הכבד הוא הצביע על ידי הפסד של צבע של רקמת הכבד.
- Perfuse את הכבד עם פתרון Pronase 30 מ"ל E. לאחר עיכול מוצלח, האונות בכבד יהיה להתנפח, האוניות יופיע נפרדות באמצעות הקפסולה.
- Perfuse את הכבד עם פתרון collagenase 30 מ"ל P. הכבד בשלב זה איבד את צורתו נראה טונוס אמורפי.
- בזהירות להפריד את הכבד מן הסרעפת והאיברים המקיפים ולאחסן אותו פתרון 70ml SC2 על הקרח.
- חזור על התהליך עבור עכברים נוספים.
2. בשנת עיכול חוץ גופית של כבדי העכבר
צעדים כל עובד נוסף צריך להתבצע בתנאים סטריליים במנדף זרימה למינרית.
- חותכים את הכבדים לחתיכות של כ 3 2x2x2mm באמצעות מספריים חדים.
- מערבבים את השעיית 70ml SC2 כולל חתיכות כבד עם 50 מ"ל של תמיסת E-collagenase Pronase P ולהוסיף 1ml של תמיסת אני DNase.
- תקציר את הכבדים עבור 20min ב 37 ° C תוך ערבוב.
3. שיפוע צפיפות צנטריפוגה
- סנן את ההשעיה התא דרך מסננות לתוך תא 70μm 6 צינורות פלקון 50 מ"ל ולהוסיף לה עד 50 מ"ל עם חיץ SC2. צנטריפוגה עבור 10min ב 600g ו 4 ° C.
- לשאוב בזהירות 40ml של supernatant, ולאחר מכן להוסיף 150μl פתרון DNase אני לצינור כל resuspend התאים.
- בריכת השעיות התא לתוך 4 מבחנות פלקון 50 מ"ל ולשטוף עם GBSS-B, צנטריפוגה עבור 10min ב 600g ו 4 ° C.
- בזהירות לשאוב כמה שיותר supernatant ככל האפשר מבלי להפריע גלולה ולהוסיף 150μl DNase פתרון אני על צינור אחד. Resuspend את כדורי תא 10ml GBSS-B לכל צינור.
- בריכת התאים לתוך 50 מ"ל 2 צינורות פלקון ולהוסיף GBSS-B כדי בהיקף כולל של 36ml לכל צינור. הוסף פתרון 14ml Nycodenz אל צינור כל ומערבבים היטב.
- העברה של 10 מ"ל ההשעיה תא לאחת צינור 12ml צנטריפוגה שיפוע, וכתוצאה מכך 10 צינורות בסך הכל. בעדינות כיסוי על השעיית התא עם צינור 1.5ml לכל GBSS-B.
- צנטריפוגה הדרגתיים עבור 15min ב 1500g ו - 4 ° C ללא בלם. לאחר מכן, hepatocytes יהיה pelleted בתחתית הצינור ואילו תאים stellate נמצאים שלבי הביניים כמו טבעת לבנה.
- בזהירות הקציר שלבי הביניים המכיל את התאים stellate לשטוף אותם עם GBSS-B; צנטריפוגות עבור 10min ב 600g ו 4 ° C.
- לשאוב supernatant ו resuspend התאים DMEM 20ml בתוספת חום מומת 10% FBS, HEPES 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 2mm L-גלוטמין, pyruvate 1mm נתרן 10mm. העברת התאים לתוך צלוחיות תרבות רקמות עם ריכוז של 2x10 4 תאים / 2 ס"מ. דגירה התאים ב 37 ° C ו 5% CO 2.
- שנה את התקשורת ברגע stellate תאים בכבד הם חסיד (כ 2h לאחר ההכנה) כדי לשטוף תאים מתים ופסולת תאית.
- למחרת, התא stellateזה צריך לפתח בצורת כוכב המורפולוגיה האופיינית שלהם עם perinuclear ויטמין A-אחסון שלפוחית השומנים.
- בניסויים עוקבים, stellate תאים בכבד יכול בקלות להיות מנותקת מן הלא מצופה משטחי הפלסטיק באמצעות פתרונות אנזימטי מתון כגון Accutase, למשל
4. נציג תוצאות:
בעקבות הכנת stellate תאים בכבד באמצעות פרוטוקול בתנאי, טוהר האוכלוסייה מבודדים ניתן לבדוק בהתחשב שלושת המאפיינים העיקריים של סוג זה התא, כגון צורת כוכב דמוי טיפות השומנים perinuclear, וביטוי של החלבון גליה חומצי fibrillary (GFAP ). התמונות נציג להופעת אופייני stellate 2h הכבד תאים לאחר בידוד התא, כמו גם ביום 1 ו -3 בתרבות במבחנה מתוארים באיור 1. איור 2 מראה מכתים immunofluorescence נציג GFAP ב stellate תאים בכבד, אשר היו בתרבית במשך 3 ימים לאחר בידוד התא. Stellate התאים להתמיין לתאי הכבד myofibroblastic במהלך בתרבות חוץ גופית. סימן ההיכר האופייני של תאים אלה מופעלים stellate היא הביטוי של אלפא חלקה השריר אקטין (αSMA). איור 3 מראה מכתים immunofluorescence עבור אסמא ו שרירן IIA בתאי stellate מופעל על יום של 7 בתרבות חוץ גופית.
באיור 1. מורפולוגיה אופיינית של תאים stellate הכבד. תאים Stellate נותקו מן הכבדים העכבר באמצעות פרוטוקול סיפק. התמונות מתארות stellate תאים 2h לאחר בידוד תא (a, b), כמו גם ביום 1 (ג) ו - יום 3 (ד) בתרבות חוץ גופית. Stellate תאים כבדית התערוכה כמויות גבוהות של שומנים בדם שלפוחית באתרים perinuclear ולרכוש האסטרלי כמו מורפולוגיה ייחודית שלהם בימים הראשונים של תרבות חוץ גופית (הגדלה 200x).
איור 2. Stellate תאים כבדית במיוחד להביע GFAP בכבד. תאים Stellate בודדו ומוכתמת immunofluorescently עבור GFAP (אדום) ביום 3 של תרבות חוץ גופית. גרעין התא מתוארים כחול (Hoechst כתם).
איור 3. Stellate בתאי הכבד להתמיין myofibroblasts. Stellate כבדית תאים מבודדים מעכברים C57BL / 6 היו בתרבית למשך 7 ימים. לאחר מכן, הם הועברו שקופיות קאמרית מוכתם עבור אסמא (באדום) ו שרירן IIA (המתואר ירוק). גרעין התא היו counterstained עם Hoechst (כחול).
| Sc1 הצפת | |
| EGTA | 190mg |
| גלוקוז | 900mg |
| HEPES | 10 מ"ל של תמיסת מניות 1M |
| KCl | 400mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8G |
| לאא 2 PO 4 x H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| פנול אדום | 6mg |
| DH 2 O | ממלאים עד 1 ליטר |
| SC2 הצפת | |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 560mg |
| HEPES | 10 מ"ל של תמיסת מניות 1M |
| KCl | 400mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8G |
| לאא 2 PO 4 x H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| פנול אדום | 6mg |
| DH 2 O | ממלאים עד 1 ליטר |
| GBSS-Buffer | |
| KCl | 370mg |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 225mg |
| גלוקוז | 991mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| MgCl 2 x 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 70mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 75 מ"ג |
| NaHCO 3 | 227mg |
| פנול אדום | 6mg |
| DH 2 O | ממלאים עד 1 ליטר |
| GBSS B-Buffer | |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 225mg |
| גלוקוז | 991mg |
| KCl | 370mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| MgCl 2 x 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 70mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 75 מ"ג |
| NaCl | 8G |
| NaHCO 3 | 227mg |
| פנול אדום | 6mg |
| DH 2 O | ממלאים עד 1 ליטר |
| זלוף Pronase E פתרון | |
| Pronase E | 100 מ"ג (4,000 PU / מ"ג דקות) |
| SC2 הצפת | 200 מ"ל |
| Collagenase P פתרון זלוף | |
| Collagenase P | 85mg (1.78 U / מ"ג איו) |
| SC2 הצפת | 200 מ"ל |
| Pronase E-collagenase P פתרון | |
| Pronase E | 50 מ"ג (4,000 PU / מ"ג דקות) |
| Collagenase P | 85mg (1.78 U / מ"ג איו) |
| SC2 הצפת | 50 מ"ל |
| DNase פתרון אני | |
| אני DNase | 6mg (2000U/mg בקירוב) |
| GBSS-B | 3ml |
| Nycodenz פתרון | |
| Nycodenz | 8G |
| GBSS-A | 28ml |
טבלה 1. Buffers ופתרונות האנזים הדרוש בידוד של תאים stellate הכבד. ה-pH של חוצצי כל צריך להיות מותאם 7.3-7.4. יתר על כן, סינון סטרילי של חוצצי כל מומלץ. חשוב להתאים את כמות אנזים המשמש על פי הפעילות האנזימטית נתון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stellate תאים כבדית לווסת תהליכים פיזיולוגיים חיוניים pathophysiological בכבד. יתר על כן, תאים בעלי תכונות stellate הצגת אנטיגן, טיוח אותם מרכיב חשוב של התגובה החיסונית בכבד. למרות stellate תאים בכבד מהווים 10-15% ממספר תאים הכולל בכבד, בידוד של תאים אלה הוא מאתגר בשל לוקליזציה שלהן בחלל perisinusoidal של Disse.
כאן אנו מציגים שיטה פשוטה לבודד stellate הכבד תאים כבדי העכבר על ידי לעיכול באתרו צנטריפוגה הדרגתי לאחר מכן. פרוטוקול זה מאפשר בידוד של תאים stellate טהור מאוד מתאים מבחני אימונולוגית.
הישות של תאים בודדים ניתן לשלוט בהתחשב שלושת המאפיינים העיקריים של stellate תאים בכבד, כולל צורת כוכב דמוי perinuclear ויטמין A-אחסון שלפוחית שומנים, והבעה של GFAP. על פי קריטריונים אלה, תאים stellate שהושגו באמצעות פרוטוקול המתוארים הם שגרתי ~ 99% טהור כפי שהוערכו על ידי מכתים immunofluorescent ו cytometry הזרימה. מזהמים אפשריים של isolations תא stellate הם תאים דנדריטים Kupffer ואת הכבד תאים (DCS). לכן, ניתחנו בתרביות תאים stellate ידי מכתים תזרים cytometry עבור מולקולות פני השטח F4/80 (תאים Kupffer) ו CD11c (DCS). לפיכך, העדר F4/80 + + ו CD11c תאים נשלל זיהום ההכנות תא stellate ידי תאים Kupffer או DCs. לפיכך, אין עוד שיטות העשרה או מיון נדרשים, עיבוד של פרוטוקול המתואר לבידוד stellate תא הכבד הליך נוחה ומהירה.
לגבי הישות של תאים stellate הכבד, חשוב לזכור כי בתאים בתרבית מבחנה להיות מופעל להתמיין myofibroblasts כי הם שונים מהותית מתאי stellate שקטים. במהלך המטמורפוזה הזאת, stellate בתאי הכבד ביטוי חופשי של GFAP ו upregulate αSMA, אשר ניתן לאתרם בקלות ביום 7 של תרבות חוץ גופית. יש לציין, הפעלה של תאים במבחנה stellate מאוד דומה דפוס ההפעלה שלהם in vivo 6. הדבר בא לידי ביטוי על ידי מעורבותם לייפת הכבד, למשל, גם אם אחרים לייצור קולגן אוכלוסיות myofibroblast לתרום להתפתחות המחלה 7. לסיכום, stellate הכבד תאים מתקבל על ידי פרוטוקול המתואר לספק מודל עבור תאים stellate שקט, כמו גם עבור myofibroblasts כבד הופעל בהתאם לשלב הבידול שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי משפחת סמית פרס למצוינות מחקר ביו NIH RO1 AI083426-01 (FW). פטריק Maschmeyer ומלאני Flach נתמכים על ידי מלגות PhD מן Boehringer Ingelheim קרן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Collagenase P | Roche Group | 11249002001 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960 | |
| DNase I | Roche Group | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Peristaltic Pump | Cole-Parmer | HV-7523-70 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 | |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 | |
| Silicone Tube | Masterflex (Cole Palmer) | HV-96440-14 | |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD Biosciences | 353108 | |
| Winged Infusion Set | Terumo Medical Corp. | 1SV27EL |
References
- Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
- Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
- Gressner, A. M. &, Weiskirchen, R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).
- Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut. 50, 571-581 (2002).
- Winau, F. Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses. Immunity. 26, 117-129 (2007).
- Minicis, S. D. e Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo. Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).
- Knittel, T. Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair. Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).
