Summary
Мы опишем метод измерения энергии связи, представить в виде ткани поверхностное натяжение, между клетками тканей в 3D-подобных агрегатов. Различия в ткани поверхностного натяжения, как было продемонстрировано коррелируют с инвазивности легких, мышц и опухолей головного мозга, и являются основными детерминантами установления пространственных отношений между различными типами клеток.
Abstract
Строгие измерения межклеточных энергии могут быть сделаны только с использованием методов основан на термодинамических принципах системы в равновесии. Мы разработали поверхности ткани tensiometry (TST), специально для измерения поверхностной свободной энергии взаимодействия между клетками. Биофизической концепции, лежащие TST были ранее подробно описаны 1,2. Метод основан на наблюдении, что взаимно сплоченной клетки, если поддерживается в встряхивания культуры, будет спонтанно собираться в кластеры. С течением времени эти кластеры будут округлить до форме сферы. Это округление поведение имитирует поведение, характерных для жидких систем. Межклеточные энергия измеряется путем сжатия сферических агрегатов между параллельными пластинами в специально разработанных тензиометра поверхности ткани. Те же математические уравнения, используемые для измерения поверхностного натяжения капли жидкости используется для измерения поверхностного натяжения тканей 3D-подобные сферические агрегаты. Сотовые эквивалент жидкого поверхностного натяжения является межклеточное энергии, да и вообще, ткани cohesivity. Предыдущие исследования, проведенные в нашей лаборатории показали, что поверхностное натяжение ткани (1) предсказывает, как две группы эмбриональных клеток будут взаимодействовать друг с другом, 1-5, (2) может сильно повлиять на способность тканей взаимодействуют с биоматериалов 6, (3) можно быть изменен не только путем прямого манипулирования кадгерина основе межклеточных сплоченности 7, но и манипуляции ключевых молекул, таких как ЕСМ FN 8-11 и 4) коррелирует с инвазивный потенциал рака легких 12, фибросаркома 13, опухоли мозга 14 и опухоли простаты Клеточные линии 15. В этой статье мы опишем аппарат, подробно шаги, необходимые для получения сфероидов, для загрузки сфероидов в тензиометра камеру, чтобы начать совокупности сжатия, и для анализа и проверки ткани поверхностного натяжения измерений генерируется.
Protocol
1. Совокупный подготовки для измерения поверхностного натяжения тканей.
Для приверженца клеток, сфероиды могут быть сформированы с использованием либо метода висячей капли или путем генерации когерентного листе клеток, которые затем можно разрезать на фрагменты 1 мм.
Совокупный Формирование висячей капли метода:
- Ближней сливной приверженцем культуры клеток следует выращивать до 90% слияния, после чего монослоев должны быть дважды промывали PBS. После слива, добавьте 2 мл (на 100 мм пластины) в размере 0,05% трипсина-1 мМ ЭДТА, и инкубировать при температуре 37 ° С до клетки отделяются. Стоп трипсинизации путем добавления 2 мл полной среды и аккуратно использовать 5 мл пипеткой растирают смесь, пока клетки в суспензии. Передача клетки 15 мл коническую трубку.
- Добавить 40 мкл 10 мг / мл маточного раствора ДНКазы и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре. Кратко Vortex и центрифуги при 200 мкг в течение 5 минут.
- Удалите супернатант и мыть гранул с 1 мл полной среды культуры ткани. Повторите, то ресуспендирования клеток в 2 мл полной среды культуры ткани.
- Граф клеток с использованием hemacytometer, или автоматизированные счетчик клеток и регулировать концентрацию до 2,5 х 10 6 клеток / мл.
- Снимите крышку с 60 мм ткани блюдо культуры и место 5 мл PBS в нижней части блюда. Это будет действовать как гидратации камеры.
- Обратить крышкой и использовать 20 мкл пипетки внести 10 мкл капли на нижней части крышки. Убедитесь в том, что капли находятся друг от друга достаточно, чтобы не трогать. Можно разместить не менее 20 капель на блюдо.
- Обратить крышку на PBS заполненные дно камеры и инкубировать при температуре 37 ° C / 5% CO 2 / 95% влажности, монитор капель в день и инкубировать пока либо ячейке листа или агрегатов сформировали.
- После листах форме, они могут быть переданы с круглым дном стеклянные колбы, содержащие шейкер 3 мл полной среды и инкубировали в пожимая водяной бане при температуре 37 ° С и 5% CO 2, пока форма сфероидов.
Совокупный формирование методом ячеек листа:
- Одноместный клеточные суспензии готовят, как описано выше, но концентрация регулируется до 1х10 6 кл / мл.
- Передача 3 мл клеточной суспензии до 10 мл с круглым дном колбы (Белко, Вайнленд, NJ).
- Инкубируйте колбы в вращательное водяной бане / шейкере (New Brunswick Scientific, Эдисон, штат Нью-Джерси) при 37 ° C, 5% СО 2 в течение 4 часов при 120 оборотов в минуту, пока клетки оправиться от трипсинизации.
- Передача клетки стекла с круглым дном трубки центрифуги и центрифуги при 200 Х г в тонкую гранул. Инкубируйте в течение еще 24 часов до согласованной формы листа.
- Аккуратно водоворот в пробирку, чтобы сместить лист и залить содержимое пробирки в небольшую, стерильную чашку культуры тканей стекла.
- Использование микро скальпели резать листы на фрагменты разных размеров.
- Инкубируйте фрагментов при 37 ° С на водяной бане вращательное шейкере при 120 оборотов в минуту до 5% CO 2 от 2 до 3 дней или пока они не станут сферической.
2. Измерение совокупной поверхностного натяжения
- Тензиометра поверхности ткани. Установки показана на рис. 1 и 2. Сжатие ячейки (рис. 3) состоит из двух палат. Внешней камеры (OC) подключен к 37 ° С водяного насоса циркулирует, и служит для регулирования температуры внутренней камеры (IC). Камеры изготовлены из фрезерованных Delrin и содержат кварцевые окна для визуализации совокупности. Нижний в сборе (LA) винтов в основание внутренней камеры и используется для 1) положение совокупности во внутренней камере, 2) уплотнение нижней части внутренней камеры, 3) поднять совокупный инициировать сжатия, и (4 ) контролировать расстояние между параллельными пластинами и, следовательно, сжатие совокупности. Центральное ядро (КС) сборки можно регулировать. Кончика центрального ядра (постамент) состоит из гладкого тефлона и выступает в качестве нижнего сжатия пластины (КСУ). Верхняя пластина сжатия (ОГП) является тефлон цилиндра 15мм долго, что висит на коромысло (В) пламени выпрямился никель-хром провода (НСВ) *. В ходе эксперимента, клетка агрегат (А) расположен на нижней пластине и вырос до контакта с верхней пластиной. Верхняя пластина подключена к коромысло (B). Сжатие совокупного вызывает смещение баланса руку. Баланс Кана / Ventron модель 2000 electrobalance записи, которая работает на принципе нулевой баланс. Опоры коромысла имеет арматуру в постоянном магнитном поле. Когда баланс работает, он постоянно модулирует ток, проходящий через электромагнитные собрание, которое в свою очередь, утверждает, коромысло в горизонтальном положении. Когда объект подвешивается коромысло, напряжение, которое распространяется на баланс держать руку в horizontal позицию, пропорционально вес объекта. Это напряжение меры внешней сжимающей силы, приложенной к совокупности. Форма агрегата контролируется путем визуального наблюдения через 25 х Nikon SMZ10A стереоскоп связан с компьютером, снабженным видеозахвата. В целях минимизации адгезии клеточных агрегатов на сжатие плит, как нижняя и верхняя пластины сжатия были покрыты поли (2-гидроксиэтилметакрилата) {поли (НЕМА)}, полимерных материалов, к которым клетки не придерживаются 16.
* Проволока пламени выпрямился через повешение 15-дюймовый длина провода от реторты стоять и зажима небольшой ролик связующего до конца. Горелки Бунзена, затем подбежать и по всей длине проволоки до проволоки светится красным. Поправил провод может быть разрезана на соответствующую длину. Небольшой крюк формируется изгиб провода примерно на ¼ дюйма от конца с помощью двух лезвий. Другой конец вставляется в ствол ниже сжатия пластины. - Совокупный сжатия.
- Внутренняя камера заполнена подогретого CO 2-независимой культуры тканей среды (Gibco / BRL, Нью-Йорк).
- Агрегаты размером от около 200-300 μ расположены на нижней сжатия пластины (рис. 4). Агрегаты загружаются аспирационных совокупности в культуре ткани среду на полпути до кончика пипетки Пастера оснащена силиконовыми луковица, передачи пипетки на внутреннюю камеру, и позиционирования кончика пипетки выше LCP. Агрегат затем аккуратно изгнаны на КСУ, осторожно сжимая лампочки. Кроме того, агрегат падать под действием силы тяжести на LCP.
- Верхняя пластина сжатия (ОГП) расположена над совокупности и дают отстояться, установление предварительного сжатия очевидными базовые веса ОГП.
- LCP затем поднимается до агрегат давили ОГП (рис. 4б). Регулировка высоты внутреннее ядро нижнего аппарат будет контролировать различные степени сжатия. Сжатие контролируется наблюдения через рассекает микроскопа, снабженного видеокамерой CCD.
- Совокупный изображения будут захвачены, оцифровывается и проанализированы с помощью ImageJ. Видимое изменение веса ОГП непрерывно записывается на магнитофон ленточных диаграмм, достижение равновесной формы будучи обозначается выравнивания выходного напряжения баланс Кана. Каждый агрегат подвергается 2 различных степенях сжатия.
- Расчет совокупного поверхностным натяжением.
В форме равновесия, cohesivity из совокупности клеток сжаты между параллельными пластинами, к которым она не придерживается могут быть получены из молодых-Лапласа (рис. 5), где σ является cohesivity, F-сила, действующая на сжатие совокупного , πr 3 2-площадь поверхности, на которых совокупная сила F оказывают, и R 2 и R 3 являются, соответственно, радиус экватора совокупности сжатого и радиус дуги определения его профиля поверхности нормальных на сжатие плит и расположенного между ними (рис. 6). Измерение силы сжатия и геометрии в силу и форму равновесия и применении этих измерений для молодых-Лапласа генерирует числовые значения очевидным поверхностное натяжение ткани. По достижении равновесия и расчета σ 1, агрегатов распаковываются и позволила приблизиться второй равновесия и σ 2 вычисляется как описано выше. - Подтверждение совокупной ликвидности.
Рассчитывается поверхностное натяжение жидкости совокупности, при воздействии на двух разных компрессий будет оставаться постоянным. В таких агрегатах отношение σ 2 / σ 1 будет равен 1, а будет меньше, чем отношение силы, приложенной в каждом последующем сжатии (F 2 / F 1). В противоположность этому, рассчитанные поверхностное натяжение упругой совокупности подчиняется закону Гука и увеличить пропорционально приложенной силе. Для упругих агрегатов отношение σ 2 / σ 1, не будет равна 1, но вместо этого подхода отношение F 2 / F 1. Поверхностное натяжение жидкости агрегатов также будет независимым от совокупного размера 2,17. Только измерений, в которых поверхностное натяжение не зависит от приложенной силы и размера используются для расчета среднего σ для каждой клеточной линии.
3. Представитель результаты:
Ниже приведена таблица типичных результатов TST для агрегатов крысы простаты фибробластов (ПФР) и крысы простаты гладкомышечных клеток (RPSMC). Как видно на рис. 7 агрегатов клеток ПФР поверхностное натяжение 22,8 ± 1,1 дин / см. Кроме того, среднее значение поверхностного натяжения измеряется после сжатия 1 и 2 после сжатия были статистически идентческих при сравнении по парных т-тест. Мы также сравнили отношение σ 2 / σ 1 и F 2 / F 1, чтобы эти агрегаты не подчиняются закону Гука, как если бы они вели себя в качестве упругих твердых тел. Как показано в таблице 1, отношение σ 2 / σ 1, действительно, подход 1.0. Более того, отношение F 2 / F 1 была значительно больше, чем σ 2 / σ 1 (парный Т-тест, p <0,05), далее, подтверждающие, что эти агрегаты не подчиняются закону Гука и в самом деле ведут себя как жидкости. В отличие RPSMCs подчинился закону Гука. Как видно из таблицы 1, отношение σ 2 / σ 1 значительно больше, чем 1 и статистически не различалась, чем у F 2 / F 1. Для дальнейшей демонстрации жидкоподобной поведение, мы исследовали связь между поверхностным натяжением (σ) и совокупного объема. Как видно на рис. 8, объем не зависит от сигма для клеток ПФР (красная линия регрессии, R 2 = 0,002), в то время, как представляется, некоторую зависимость сигма по объему для RPSMCs (синяя линия регрессии, R 2 = 0,146). Эти данные также подтверждают, что ПФР агрегатов вести себя в жидкости-образной манере, тогда как те из RPSMCs появляются вести себя больше как упругих тел. Только те, mesurements получена из агрегатов ведет себя как жидкость будет использоваться для расчета поверхностного натяжения.
Рисунок 1. Обзор тензиометра поверхности ткани.
Рисунок 2. Подробное представление тензиометра камеры (справа).
Рисунок 3. Схематическое изображение тензиометра камеры.
Рисунок 4. Изображения несжатый () и сжатый (B) агрегатов.
Рисунок 5. Уравнение Лапласа.
Рисунок 6. Схема капли жидкости сжимается между двумя параллельными пластинами, к которым она придерживается плохо, по крайней формы равновесия. R 1 и R 2 являются два основных радиусов кривизны, на экваторе капли, так и в плоскости, проходящей через его ось симметрии, соответственно. R 3 является радиус круговой области капельки контакта с любой сжатия пластины. Н-расстояние между верхней и нижней пластин сжатия. X является одной стороне прямоугольного треугольника с гипотенузой R 2 и до точки контакта между поверхностью капли и либо сжатия пластины.
| σ 1 (дин / см ± SEM) | σ 2 (дин / см ± SEM) | Pσ 1 против 2 σ | σ 1,2 (дин / см ± SEM) | σ 2 / σ 1 | F 2 / F 1 | Pσ 2 / σ 1 и F 2 F 1 | |
| ПФР | 22,6 ± 1,7 | 22,9 ± 1,4 | > 0,05 * | 22,8 ± 1,1 | 1,04 ± 0,04 | 1,47 ± 0,06 | <0,05 |
| RPSMC | 15,0 ± 2,8 | 23,0 ± 3,2 | 0,039 | Не Доступно | 1,9 ± 0,3 | 1,6 ± 0,1 | 0,16 * |
Рисунок 7. TST измерений и подтверждения совокупного ликвидности для агрегатов крысы простаты фибробластов и гладкомышечных клеток.
Рисунок 8. Связь между сигма и объем для агрегатов ПФР (красная линия) и RPSMCs (синяя линия).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Измерение совокупной сплоченность путем TST относительно проста. Есть, однако, основные шаги, которые должны быть освоены в целях получения полезной данных TST: 1) агрегаты должны быть "здоровым". Это можно контролировать путем обеспечения образования агрегатов начинается с клетки, которые при оптимальном слияния до отряда. Совокупный размер и время в культуре также должны находиться под контролем, чтобы минимизировать развитие некротического ядра в совокупности, 2) Другой параметр, который может повлиять на TST измерений степень адгезии совокупности с верхней или нижней пластин сжатия. Таким образом, оптимальной концентрации поли-НЕМА используется для покрытия пластин должны быть определены эмпирически для каждого типа агрегата; 3) Хотя желательно, чтобы до сжатия агрегатов должны быть в виде сферических как это возможно, не является строго обязательным. Некоторые агрегаты, особенно те, которые удерживаются вместе слабо, как правило, не форма идеальной сферы. Объясняется это тем, что для того, чтобы полностью облавы клетки должны расходовать энергию путем перемещения и перестановки. Если количество энергии, необходимой для облавы в сфере превышает энергию минимизации становится сферической, агрегаты будут иметь тенденцию к останавливаются на некоторых суб-сферической формы. По нашему опыту, такие агрегаты, превратившись в сжатой, сопротивляться сжимающей силы до такой степени, что стороны сводном виде полукругов, точно так, как они будут делать, если, начиная с идеальной сферой, 4) Кроме того, важно, что сжатие пластин параллельны друг-друга. Лучше всего это достигается путем обеспечения того, никель-хром провода прямо и, что прибор уровня и отвеса. Если эти меры не будут соблюдаться, tensiometry поверхности ткани относительно проста и может генерировать очень полезную информацию о механических свойствах ткани и лежащих в их основе молекулярно детерминанты.
Другие методы измерения совокупности единство существует, те, которые устраняют необходимость для специализированного оборудования, такие как electrobalance Кана. Один из таких методов аспирационной сфероида в пипетку гораздо меньшего диаметра, чем у сфероида, при постоянном давлении всасывания. Вязко-упругих свойств ткани выводятся из изменения напряжения при измерении изменения длины клеточного материала, как она течет внутри пипетки 18. Хотя полезно, этот метод может иметь ограничения в диапазоне поверхностного натяжения, в которых он может быть применен. Очень слабые агрегаты, вероятно, будет уничтожена, поскольку они атмосферный в пипетку, а агрегаты, которые удерживаются вместе очень сильно, не может быть атмосферный вообще. Параллельные сжатия пластины измеряется поверхностное натяжение ниже, чем 0,33 ± 0,02 дин / см для рыбок данио эктодермы слой зародыша получавших E-кадгерина морфолино 3 до высоты 20,1 ± 0,5 дин / см для агрегатов эмбриональных куриных конечностей бутон мезодермы 2, демонстрирует свою общего назначения в широком диапазоне сплоченности в течение нескольких эмбриональных систем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| water bath/shaker | New Brunswick Scientific | ||
| 10 ml round-bottom flasks | Bellco Glass |
References
- Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions. Phys Rev Lett. 72, 2298-2301 (1994).
- Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122, 1611-1620 (1996).
- Schotz, E. -M. Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning. HFSP Journal. 2, 42-56 (2008).
- Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).
- Schwarz, M. A., Zheng, H., Legan, S., Foty, R. A. Lung Self-Assembly is Modulated by Tissue Surface Tensions. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2010).
- Ryan, P. L., Foty, R. A., Kohn, J., Steinberg, M. S. Tissue spreading on implantable substrates is a competitive outcome of cell-cell vs. cell-substratum adhesivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4323-4327 (2001).
- Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Dev Biol. 278, 255-263 (2005).
- Robinson, E. E., Foty, R. A., Corbett, S. A. Fibronectin matrix assembly regulates alpha5beta1-mediated cell cohesion. Mol Biol Cell. 15, 973-981 (2004).
- Robinson, E. E., Zazzali, K. M., Corbett, S. A., Foty, R. A. alpha5beta1 integrin mediates strong tissue cohesion. J Cell Sci. 116, 377-386 (2003).
- Winters, B. S., Raj, B. K., Robinson, E. E., Foty, R. A., Corbett, S. A. Three-dimensional culture regulates Raf-1 expression to modulate fibronectin matrix assembly. Mol Biol Cell. 17, 3386-3396 (2006).
- Caicedo-Carvajal, C. E., Shinbrot, T., Foty, R. A. Alpha5beta1 integrin-fibronectin interactions specify liquid to solid phase transition of 3D cellular aggregates. PLoS One. 5, e11830-e11830 (2010).
- Foty, R. A., Steinberg, M. S. Measurement of tumor cell cohesion and suppression of invasion by E- or P-cadherin. Cancer Res. 57, 5033-5036 (1997).
- Foty, R. A., Corbett, S. A., Schwarzbauer, J. E., Steinberg, M. S. Dexamethasone up-regulates cadherin expression and cohesion of HT-1080 human fibrosarcoma cells. Cancer Res. 58, 3586-3589 (1998).
- Winters, B. S., Shepard, S. R., Foty, R. A.
- Foty, R. A., Cummings, K. B., Ward, S. Tissue surface tensiometry: a novel technique for predicting invasive potential of prostate tumors based on tumor cell aggregate cohesivity in vitro. Surgical Forum L. , 707-708 (1999).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions. Physical Review Letters. 72, 2298-2301 (1994).
- Guevorkian, K., Colbert, M. J., Durth, M., Dufour, S., Brochard-Wyart, F.
