Summary
تم وصف أسلوب الرواية للحصول على الضامة من الثقافة الأساسية للخلايا كبد الفئران. هذا الأسلوب يستخدم انتشار الضامة في الثقافة ، تليها اهتزاز قوارير الثقافة وتنقية عن طريق الحجز الانتقائي لأطباق بلاستيكية. هذا الأسلوب يوفر كفاءة الضامة الكبد بدون معدات معقدة والمهارات.
Abstract
خلايا كوبفر هي الضامة المقيمين الكبد محددة وتلعب دورا هاما في الوظائف الفسيولوجية والمرضية في الكبد 1-3. على الرغم من أن أساليب عزل الضامة الكبد وقد موصوفة وصفا جيدا 4-6 ، ومعظم هذه الطرق تحتاج إلى معدات متطورة ، مثل elutriator الطرد المركزي والمهارات التقنية. هنا ، ونحن نقدم طريقة جديدة للحصول على الضامة الكبد في عدد كاف من النقاء والثقافات الابتدائية المختلطة الكبار خلايا الكبد الفئران ، تخطيطي كما هو موضح في الشكل 1.
بعد تفكك خلايا الكبد من قبل اثنين من خطوة طريقة الارواء 7،8 ، تعد جزءا تتألف في معظمها من خلايا الكبد متني والمصنفة في قوارير T75 زراعة الأنسجة مع مستنبت تتكون من خلايا الكبد وDMEM FCS.Parenchymal 10 ٪ تفقد مورفولوجيا الخلايا الظهارية في غضون بضعة أيام في الثقافة ، أو تتحول إلى تحويل الخلايا الليفية مثل (الشكل 2). كما العائدات والثقافة ، وحول يوم 6 ، المرحلة التباين الساطع ، على مدار بلعم شبيهة تبدأ الخلايا في التكاثر على الورقة خلية ليفية (الشكل 2). نمو خلايا البلاعم مثل الاستمرار والوصول إلى أقصى مستويات حول 12 ايام ، وتغطي الورقة على سطح الخلية القارورة. التي تهز من القوارير والثقافة ، وتعلق بسهولة الضامة في المتوسط الثقافة. ونقل لاحقا في حضانة قصيرة نتيجة الصحون البلاستيكية في التصاق الانتقائي للالضامة (الشكل 3) ، حيث تظل معلقة وغيرها من الخلايا الملوثة. يشطف بعد عدة مع برنامج تلفزيوني ، ويتم حصاد الضامة المرفقة. يمكن حصاده أكثر من 10 6 خلايا مرارا وتكرارا من نفس الأنسجة T75 قارورة الثقافة اليوم على فترات 2-3 لأكثر من أسبوعين (الشكل 3). درجات نقاء من الضامة معزولة كان 95 الى 99 ٪ ، وتقييمها من قبل التدفق الخلوي أو كيمياء سيتولوجية مناعية مع الاجسام المضادة المحددة بلعم الفئران (الشكل 4). خلايا معزولة تظهر البلعمة نشطة من الخرز polystylene (الشكل 5) ، والاستجابة لالتكاثري المؤتلف GM - CSF ، إفراز التهاب / مضادة للالتهاب السيتوكينات على التحفيز مع LPS ، وتشكيل عملاق الخلايا multinucleated 9.
في الختام ، ونحن نقدم طريقة بسيطة وفعالة للحصول على الضامة الكبد في عدد كاف والنقاء بدون معدات معقدة وskills.This طريقة يمكن تطبيقها على الأنواع الأخرى من الثدييات.
Protocol
1. نضح من الكبد
- تخدير أحد البالغين الذكور ، سبراغ داولي (10 إلى 15 أسبوعا من العمر ؛ وزن الجسم 150-200 ز) عن طريق الحقن داخل الصفاق من حل بنتوباربيتال الصوديوم (50 ملغ صوديوم بنتوباربيتال / كيلوغرام من وزن الجسم).
- وضع الحيوانات في مقلاة غير القابل للصدأ ورذاذ الايثانول 70 ٪ على البطن والصدر.
- إجراء قطع صغيرة وتقشر الجلد. فتح البطن التي قطعت مع زوج من مقص.
- تأكيد موقع الوريد البابي ، وتمرير الخيط الجراحي تحت الوريد البابي وتتجمع فضفاضة.
- تتجمع في الجزء البعيد من الوريد الأجوف السفلي والوريد المساريقي لمنع ارتجاع الدم الى الكبد. فتح التجويف الصدري عن طريق خفض الحجاب الحاجز مع مقص ، وفضح القلب.
- ادخال قسطرة من البلاستيك (2 مم) في الوريد البابي وتشديد الخيط بقوة حول القسطرة.
- توصيل قسطرة لنظام الارواء التي يتم تحميلها مع حل الغسيل (كا 2 + 2 + ملغ HBSS الحرة التي تحتوي على 0،5 EGTA ملم ، 10 ملم HEPES و 4.2 ملي NaHCO 3 ؛ الرقم الهيدروجيني 7.2) prewarmed عند 37 درجة مئوية.
- يبدأ نضح في الموقع بمعدل 10 مل / دقيقة. في الوقت نفسه ، وجعل قطع في جدار الأذين الأيمن. يستمر لمدة 10 دقيقة الارواء.
- التبديل إلى الحل حل نضح كولاجيناز [HBSS تحتوي HEPES 10MM و4.2mM NaHCO 3 تستكمل مع النوع الأول كولاجيناز (0.05 ٪) ، ومثبط التربسين (50 ميكروغرام / مل) ؛ الرقم الهيدروجيني 7،5] ، ويروي لمدة 10 -- 20 دقيقة بمعدل من 10 مل / دقيقة حتى الكبد تتضخم قليلا ويظهر علامة للتفكك بنية الكبد تحت الغشاء المصلي.
2. إعداد جزء الخلية الكبدية متني الغنية
- إزالة بعناية ونقل الكبد في دورق العقيمة التي تحتوي على 25 مل من محلول كولاجيناز. اللحم المفروم إلى قطع صغيرة بواسطة مقص.
- إضافة 75 مل من MEM الباردة في تعليق الخلية الناتجة. بعد pipetting رقيقة ، والترشيح من خلال مصفاة الخلية (100 ميكرون) لإزالة الأنسجة الضامة وأنسجة شظايا عسر الهضم.
- نقل رشاحة في أنابيب مخروطية 50 مل و 50 في أجهزة الطرد المركزي لXG 1 دقيقة بمعدل 4 درجات مئوية (فرامل إيقاف).
- تجاهل بعناية طاف. Resuspend الكرية مع MEM الباردة.
- كرر 2.4) ثلاث مرات.
3. الثقافة الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد
- تعليق الخلايا التي تم الحصول عليها في 2.5) في المتوسط النمو تتألف من DMEM تحتوي على 10 ٪ FCS الحرارة المعطل ، على أن تستكمل مع 100 ميكرومتر β - المركابتويثانول ، 10 ميكروغرام / مل الانسولين ، و 100 ميكروغرام / مل و 100 الستربتوميسين البنسلين يو / لتر ، والبذور في 09:55 القوارير زراعة الأنسجة (مساحة : 75 سم 2) في مناطق ذات كثافة 6.7 X الخلايا 4 10 / سم 2 (5 × 10 6 خلية / قارورة / 12 -15 مل من المتوسط).
- احتضان ثقافة flasksat 37 درجة مئوية في جو من 5 ٪ CO 2-95 الهواء ٪.
- استبدال المتوسطة النمو كل 2 إلى 3 أيام فاصلة.
4. عزل انتقائية تقوم البلاعم
- بعد 12 يوما من الثقافة والضامة تتكاثر الخلايا على ورقة. يتم تعليق هذه الخلايا عن طريق المصافحة المتبادلة للثقافة في قوارير 80-120 السكتات الدماغية في الدقيقة الواحدة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- نقل الثقافة في المتوسط 100 ملم غير نسيج الثقافة الأطباق البلاستيكية الصف. بركة المتوسطة من قوارير T75 اثنين الى صحن من البلاستيك واحد. قوارير الثقافة الملء مع متوسط النمو وإعادتهم إلى الحاضنة.
- احتضان الصحون البلاستيكية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2-95 ٪ الهواء. الضامة نعلق بسهولة لغير نسيج الثقافة الأطباق البلاستيكية الصف تحت حضانة هذه العملية ، في حين أن غيرها من الخلايا الملوثة لا.
- نضح على المديين المتوسط والشطف بلطف طبق من البلاستيك مع برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- إضافة 1 مل من محلول اكسبريس TrypLE في الطبق ، واحتضان ل10min عند 37 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2-95 ٪ الهواء.
- إضافة 9 مل من متوسطة النمو. كشط بلطف قبالة الضامة التي توليها مكشطة الخلية.
- نقل تعليق خلية في أنبوب مخروطي 15 مل و 180 جهاز طرد مركزي في XG لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية (على الفرامل).
- تجاهل طاف وإضافة 1 مل من المتوسط النمو. فصل في الخلايا واحد عن طريق pipetting قوية. تعداد عدد الخلايا من قبل العد عدادة الكريات.
- ويمكن تكرار الخطوات العزلة مع قوارير نفس الثقافة اليوم على فترات 2-3 لأكثر من أسبوعين.
- يمكن تربيتها الضامة معزولة في وسط النمو وصفها في 3.1.
5. ممثل النتائج
ويرد مثال للثقافة ابتدائية مختلطة من البالغين خلايا كبد الفئران في الشكل 2. تفقد خلايا الكبد متني مورفولوجيا الخلايا الظهارية في غضون بضعة أيام في الثقافة ، أو تتحول إلى تحويل الخلايا الليفية مثل الخلايا.ثم ، حول يوم 6 إلى 12 ، مرحلة التباين الساطع ، على مدار بلعم تشبه الخلايا تتكاثر vigourouly على الورقة خلية ليفية. التي تهز من القوارير والثقافة ، وتعلق بسهولة الضامة في مستنبت ، ونقل لاحقا وحضانة في أطباق بلاستيكية في نتيجة التصاق الانتقائي للالضامة (الشكل 3). يمكن حصاده خلايا البلاعم تشبه في اقرب وقت يوم 8 ، والأعداد وصلت إلى مستويات قصوى في أيام 12 إلى 14. يمكن حصاده أكثر من 10 6 خلايا من قارورة الثقافة T75 مرارا في فترات اليوم 2 إلى 3 لأكثر من أسبوعين ، مما يتيح تحقيق عائد إجمالي في الخلية القارورة من قارورة الثقافة في 10 7 T75 (الشكل 3). كانت درجات نقاء من الضامة معزولة 95-99 ٪ ، حسب تقييم flowcytometry أو كيمياء سيتولوجية مناعية مع الاجسام المضادة المحددة بلعم الفئران ، مثل ED - 1 (الشكل 4) ، ED - 3 ، OX - 41 (الشكل 4) و 9 Iba1. الخلايا معزولة تظهر الخصائص المميزة للالضامة ، مثل البلعمة نشطة من الخرز polystylene (الشكل 5) ، والاستجابة لالتكاثري المؤتلف GM - CSF ، إفراز التهاب / مضادة للالتهاب السيتوكينات على التحفيز مع LPS ، وتشكيل خلايا عملاقة multinucleated 9.
الشكل 1. مخطط لعزل وتنقية انتقائية مثل خلايا البلاعم من الثقافة الابتدائية المختلطة للخلايا كبد الفئران.
الشكل 2. الثقافة الأولية للخلايا كبد الفئران وانتشار بلعم تشبه الخلايا. يشير السهم خلية عملاقة متعدد النوى. مقياس بار = 100 ميكرومتر. نقلا عن مجلة طرق مناعية ، Vol.360 ، 47-55 (2010) 9 بإذن من السيفير.
الشكل 3. العزل الانتقائي للخلايا البلاعم الشبيهة بها وأسلوب الهز المرفق. علقت الخلايا في مستنبت التي تهز قوارير أو نقلها لاحقا إلى أطباق ثقافة غير النسيج البلاستيكية الصف ، وحضنت في 37 درجة مئوية. اعتبارا من 10 دقيقة بعد الطلاء ، مثل خلايا البلاعم ، تعلق على سطح الطبق ، في حين أن غيرها خلايا ليفية تلويث ظلت معلقة. بعد الشطف مع برنامج تلفزيوني ، وكان حصل على السكان بلعم عالي النقاء. اكتسبت هذه الخلايا عادة البلاعم التشكل بعد 40 دقيقة من الثقافة ، وشوهدت في كثير من الأحيان الخلايا الإنقسامية (الأسهم). وتظهر التغييرات اللاحقة في أعداد الخلايا المستخرجة من القوارير في فترات ثقافة مختلفة. القيم هي في المتوسط ± SD 3-5 القوارير. تكررت التجارب ثلاث مرات وأشارت بيانات برموز مختلفة. مقياس بار = 100 ميكرومتر. نقلا عن مجلة طرق مناعية ، Vol.360 ، 47-55 (2010) 9 بإذن من السيفير.
الشكل 4. تلطيخ Immunocytochemical من مثل خلايا البلاعم مع الاجسام المضادة ضد الضامة الفئران.
الشكل 5. البلعمة من FITC المسمى microbeads التي تشبه خلايا البلاعم.
Discussion
هنا ، نحن تقرير طريقة بسيطة وفعالة للحصول على الضامة من ثقافات الابتدائية المختلطة الكبار خلايا الكبد الفئران. أسلوبنا يعتمد أولا على النشاط التكاثري رواية الضامة في ثقافة مختلطة من خلايا كبد الفئران ، ومن ثم عزل وتنقية لاحق من هذه الخلايا على أساس خصائصها البيولوجية والضامة 9. قد يكون من الممكن الضامة انتشرت في الثقافة الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار قد نشأت من خلايا كوبفر أو ذات الصلة التي الملوثة في كسر خلايا الكبد متني. قد استجابت الضامة مع التغيرات البيئية الناجمة عن التحول معينة من الخلايا الكبدية متني 10 ليفية وغيرها من الثقافات الابتدائية المختلطة.
في الختام ، اسلوبنا يوفر عزل خلايا البلاعم التي تشبه في عدد كاف من النقاء والثقافة الأساسي من الفئران الكبد cellswithout باستخدام معدات متطورة ومهارات فنية. بالإضافة ، يمكن تكرار إجراء العزل مع قارورة الثقافة نفسها لأكثر من أسبوعين. قد تكون هذه الطريقة تنطبق على الأنواع الأخرى من الثدييات.
Disclosures
وتظل جميع الحيوانات وتعمل في منشأة الحيوان في المعهد الوطني للصحة الحيوانية ، وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها اللجنة المؤسسة للتجارب على الحيوانات.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة البحث ومنحة في والمعونة. الأغذية من مشروع تقنية النانو في وزارة الزراعة والغابات ومصائد الأسماك في اليابان
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital solution | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl Injection | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Cell dissociation grade (Lot check needed) |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
| Eagle’s minimum essential medium (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) | Sigma-Aldrich | D-6459 | High glucose-type |
| Fetal calf serum (FCS) | Hyclone | SH30070.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed) |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ free |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Stock: 100 mM in distilled water |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-5500 | Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | Mesh size: 100 μm |
| Tissue culture flask | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Surface area: 75 cm2 |
| Non-tissue culture plastic dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Cell scraper | Corning | 3010 | |
| Reciprocal shaker | TAITEC | NR-1 |
References
- Crispe, I. N. The liver as a lymphoid organ. Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).
- Roberts, R. A. Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis. Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).
- Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. Liver: An organ with predominant innate immunity. Hepatology. 47, 729-736 (2008).
- Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation. J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).
- Olynyk, J. K., Clarke, S. L. Isolation and primary culture of rat Kupffer cells. J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).
- Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay. J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Yoshioka, M. Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells. Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).
- Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells. J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).
- Gorrell,
