Summary
Um novo método para obter macrófagos de cultura primária de células de fígado de rato é descrito. Este método utiliza a proliferação de macrófagos na cultura, seguido por agitação de frascos de cultura e purificação pelo apego seletivo para pratos de plástico. Esta técnica proporciona eficiente macrófagos do fígado, sem equipamentos complexos e habilidades.
Abstract
Células de Kupffer são macrófagos hepáticos específicos residente e desempenhar um papel importante nas funções fisiológicas e patológicas do fígado 1-3. Embora os métodos de isolamento de macrófagos do fígado têm sido bem descrita 4-6, a maioria destes métodos requerem equipamentos sofisticados, como um elutriator centrífuga e habilidades técnicas. Aqui, nós fornecemos um novo método para obter macrófagos de fígado em número suficiente e pureza da mistura culturas primárias de células do fígado de ratos adultos, como esquematicamente ilustrada na Figura 1.
Após a dissociação das células do fígado por duas etapas método de perfusão 7,8, uma fração na sua maioria composta de hepatócitos do parênquima é preparado e semeado em cultura de tecidos T75 frascos com meio de cultura composto por DMEM e 10% hepatócitos FCS.Parenchymal perder a morfologia das células epiteliais dentro de poucos dias em cultura, degenerados ou transformar em fibroblasto-como as células (Figura 2). Como o produto da cultura, por volta do dia 6, de contraste de fase brilhante, redondo macrófagos-like células começam a proliferar na camada de células fibroblásticas (Figura 2). O crescimento das células macrófagos-like continuar e chegar ao nível máximo, em torno de 12 dias, cobrindo a camada de células na superfície do frasco. Por agitação dos frascos de cultura, os macrófagos são facilmente suspensos no meio de cultura. Posterior transferência e incubação curto, em resultado pratos de plástico na adesão seletiva de macrófagos (Figura 3), enquanto que outras células contaminantes permanecem suspensas. Depois de várias lavagens com PBS, os macrófagos são colhidas em anexo. Mais de 10 6 células podem ser colhidas várias vezes da mesma garrafa de cultura de tecidos T75 menos duas a três intervalos dias por mais de duas semanas (Figura 3). Purezas dos macrófagos isolados foram de 95 a 99%, avaliada por citometria de fluxo ou imunocitoquímica com ratos macrófagos anticorpos específicos (Figura 4). células isoladas mostram fagocitose ativa de contas polystylene (Figura 5), a resposta proliferativa a GM-CSF recombinante, a secreção de inflamatórias / citocinas anti-inflamatórias após estimulação com LPS, e formação de células gigantes multinucleadas 9.
Em conclusão, nós fornecemos um método simples e eficiente para obter macrófagos de fígado em número suficiente e pureza sem equipamentos complexos e skills.This método pode ser aplicável a outras espécies de mamíferos.
Protocol
1. Perfusão do Fígado
- Anestesiar um adulto de ratos Sprague-Dawley do sexo masculino (de 10 a 15 semanas de idade; peso corporal 150-200 g) por uma injeção intraperitoneal de uma solução de pentobarbital sódico (50 mg de sódio pentobarbital / kg de peso corporal).
- Colocar o animal em uma panela inoxidável e spray de etanol a 70% em seu abdômen e tórax.
- Faça um pequeno corte e retire a pele. Abrir o abdômen pelo corte com uma tesoura.
- Confirmar a localização da veia porta, passe um fio cirúrgico sob a veia porta e vagamente moita.
- Moita a parte distal da veia cava inferior e veia mesentérica para evitar o refluxo de sangue para o fígado. Abrir a cavidade torácica, cortando o diafragma com uma tesoura, e expor o coração.
- Inserir um cateter plástico (2 mm de diâmetro) na veia porta e apertar firmemente o fio ao redor do cateter.
- Conectar o cateter a um sistema de perfusão que é carregado com a solução de lavagem (Ca 2 +-Mg 2 + livre HBSS contendo 0,5 mM EGTA, 10 HEPES mM e 4,2 mM NaHCO 3, pH 7,2) pré-aquecido a 37 ° C.
- Comece a perfusão in situ a uma taxa de 10 ml / min. Ao mesmo tempo, faça um corte na parede do átrio direito. Continue perfusão por 10 min.
- Mudar a solução de perfusão para a solução de colagenase [HBSS contendo HEPES 10 mM e NaHCO 3 4,2 suplementado com colagenase tipo I (0,05%) e inibidor de tripsina (50 mcg / ml), pH 7.5], perfundir e por 10 - 20 min a uma taxa de 10 ml / min, até o fígado incha um pouco e mostra o sinal para a desintegração da estrutura do fígado sob membrana serosa.
2. Preparação de Fração celular no parênquima Hepatócito ricos
- Remover e transferir cuidadosamente o fígado, para um copo estéril contendo 25 ml de solução de colagenase. Picar em pedaços pequenos com tesoura.
- Adicionar 75 ml de MEM frio para a suspensão celular resultante. Após pipetar gentil, filtrado através de um filtro de células (100 mm) para remover o tecido conjuntivo e fragmentos de tecido não digerido.
- Transfira o filtrado para 50 ml tubos cônicos e centrifugar a 50 xg por 1 min a 4 ° C (freio).
- Cuidadosamente desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento com MEM frio.
- Repita 2.4) três vezes.
3. Cultura primária mista de células do fígado
- Suspender as células obtidas em 2.5) no meio de crescimento composto por DMEM contendo 10% de calor FCS inativada, suplementado com 100 mM β-mercaptoetanol, 10 de insulina mcg / ml, estreptomicina 100 mg / ml e 100 U / ml de penicilina, e sementes em 09:55 frascos de cultura de tecido (superfície: 75 cm 2) com uma densidade de 6,7 x 10 4 células / cm 2 (5 x 10 6 células / frasco / 12 -15 ml de meio).
- Incubar a cultura flasksat 37 ° C em uma atmosfera de 5% CO 2-95% de ar.
- Substituir o meio de crescimento a cada 2 a 3 intervalos de dias.
4. Isolamento seletivo de macrófagos
- Após 12 dias de cultura, os macrófagos proliferam na folha de celular. Estas células são suspensas por recíproca agitação dos frascos de cultura em 80-120 golpes por minuto por 30 min a 37 ° C.
- Transferência do meio de cultura em 100 milímetros de tecido não-cultura grade pratos de plástico. Piscina meio de dois frascos de T75 em um prato de plástico. Frascos de cultura de recarga com o meio de crescimento e devolvê-los à incubadora.
- Incubar pratos de plástico por 30 min a 37 ° C em uma atmosfera de 5% de CO 2-95% de ar. Macrófagos facilmente anexar ao tecido não-cultura pratos grade de plástico no âmbito do presente processo de incubação, enquanto que outras células não contaminar.
- Aspirar a médio e lave o prato de plástico com PBS. Repita este passo três vezes.
- Adicionar 1 ml de solução TrypLE Express para o prato, e incubar por 10 min a 37 ° C em uma atmosfera de 5% de CO 2-95% de ar.
- Adicionar 9 ml do meio de crescimento. Delicadamente raspar os macrófagos presa por um raspador de celular.
- Transferir a suspensão de células em um tubo cônico de 15 ml e centrifugar a 180 xg por 5 min a 25 ° C (freio).
- Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 ml do meio de crescimento. Dissociar-se em células isoladas por pipetagem vigoroso. Enumerar o número de células por um hemocitômetro contagem.
- Medidas de isolamento pode ser repetido com a mesma cultura em frascos de 2-3 intervalos de dia para mais de duas semanas.
- Macrófagos isolados podem ser cultivadas em meio de cultura descrito no ponto 3.1.
5. Resultados representante
Um exemplo de uma cultura mista primária de células do fígado de ratos adultos é mostrado na Figura 2. Hepatócitos do parênquima perder a morfologia das células epiteliais dentro de poucos dias em cultura, degenerados ou transformar em fibroblasto-como pilhas.Então, por volta do dia 6 a 12, de contraste de fase brilhante, redondo macrófagos como células vigourouly proliferam na camada de células fibroblásticas. Por agitação dos frascos de cultura, os macrófagos são facilmente suspensos no meio de cultura, e sua posterior transferência e incubação em pratos de plástico resultam em adesão seletiva de macrófagos (Figura 3). As células macrófagos-like podem ser colhidas mais cedo dia 8, e os números atingiram níveis máximos nos dias 12 a 14. Mais de 10 6 células podem ser colhidas a partir de uma garrafa de cultura T75 repetidamente em intervalos de 2-3 dias por mais de duas semanas, permitindo um rendimento total de células por frasco de 10 7 por T75 frasco de cultura (Figura 3). A pureza dos macrófagos isolados foram de 95 a 99%, avaliada pelo flowcytometry ou imunocitoquímica com ratos macrófagos anticorpos específicos, como o ED-1 (Figura 4), ED-3, OX-41 (Figura 4) e Iba1 9. As células isoladas mostram características típicas de macrófagos, tais como fagocitose ativa de contas polystylene (Figura 5), a resposta proliferativa a GM-CSF recombinante, a secreção de inflamatórias / citocinas anti-inflamatórias após estimulação com LPS, e formação de células gigantes multinucleadas 9.
Figura 1. Um esquema de isolamento seletivo e purificação de macrófagos como células de cultura primária mista de células de fígado de rato.
Figura 2. Cultura primária de células de fígado de rato e proliferação de macrófagos como células. Seta indica uma célula gigantes multinucleadas. Barra de escala = 100 mm. Reproduzido do Jornal de métodos imunológicos, Vol.360, 47-55 (2010) 9 com permissão da Elsevier.
Figura 3. Isolamento selectivo de macrófagos como células pela agitação e método de fixação. As células foram suspensas em meio de cultura por agitação dos frascos, posteriormente transferida para o tecido não-cultura pratos de plástico de grau, e incubados a 37 ° C. Já em 10 min após o plaqueamento, macrófagos como células aderidas à superfície do prato, enquanto outros contaminar células fibroblásticas permaneceu suspenso. Após lavagem com PBS, uma população de macrófagos altamente purificada foi obtida. Estas células ganhou a morfologia típica de macrófagos após 40 min da cultura, e as células mitóticas foram freqüentemente observadas (setas). Alterações subsequentes no número de células recuperado de frascos em períodos diferentes culturas são mostradas. Os valores são em média ± SD 3-5 frascos. Experimentos foram repetidos três vezes e os dados são indicados por símbolos diferentes. Barra de escala = 100 mm. Reproduzido do Jornal de métodos imunológicos, Vol.360, 47-55 (2010) 9 com permissão da Elsevier.
Figura 4. Coloração imunocitoquímico dos macrófagos como células com anticorpos monoclonais contra macrófagos de ratos.
Figura 5. Fagocitose de FITC marcado por microesferas de macrófagos como células.
Discussion
Aqui, nós relatamos um método simples e eficiente para obter macrófagos da mistura de culturas primárias de células do fígado de ratos adultos. Nosso método baseia-se primeiro sobre a atividade proliferativa romance de macrófagos na cultura mista de células de fígado de rato, e depois posterior isolamento e purificação dessas células, com base em suas características biológicas como macrófagos 9. Pode ser possível os macrófagos proliferaram na cultura mista primária de células do fígado adulto pode ter se originado a partir de Kupffer ou células relacionadas que contaminou a fração em hepatócitos do parênquima. Os macrófagos podem ter respondido a alterações específicas ambientais causados pela transformação do parênquima hepatócito 10 e outras células fibroblásticas na mistura de culturas primárias.
Em conclusão, nosso método proporciona isolamento dos macrófagos como células em número suficiente e pureza da cultura primária de fígado de rato cellswithout usando equipamentos sofisticados e habilidades técnicas. Além disso, o procedimento de isolamento pode ser repetido com o frasco mesma cultura por mais de duas semanas. Esse método pode ser aplicável a outras espécies de mamíferos.
Disclosures
Todos os animais foram mantidos e operados na unidade animal no Instituto Nacional de Saúde Animal, de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Comitê da Instituição para experimentos com animais.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma bolsa de investigação e um Grant-in-Aid do Projeto de Alimentos Nanotecnologia do Ministério da Agricultura, Florestas e Pesca do Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital solution | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl Injection | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Cell dissociation grade (Lot check needed) |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
| Eagle’s minimum essential medium (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) | Sigma-Aldrich | D-6459 | High glucose-type |
| Fetal calf serum (FCS) | Hyclone | SH30070.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed) |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ free |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Stock: 100 mM in distilled water |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-5500 | Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | Mesh size: 100 μm |
| Tissue culture flask | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Surface area: 75 cm2 |
| Non-tissue culture plastic dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Cell scraper | Corning | 3010 | |
| Reciprocal shaker | TAITEC | NR-1 |
References
- Crispe, I. N. The liver as a lymphoid organ. Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).
- Roberts, R. A. Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis. Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).
- Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. Liver: An organ with predominant innate immunity. Hepatology. 47, 729-736 (2008).
- Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation. J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).
- Olynyk, J. K., Clarke, S. L. Isolation and primary culture of rat Kupffer cells. J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).
- Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay. J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Yoshioka, M. Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells. Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).
- Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells. J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).
- Gorrell,
