Summary
Eine neuartige Methode, um Makrophagen aus primären Kultur von Leberzellen zu erhalten, ist beschrieben. Diese Methode nutzt die Proliferation von Makrophagen in der Kultur, durch Schütteln der Kulturflaschen und Reinigung durch selektive Bindung an Plastikschalen gefolgt. Diese Technik bietet effiziente Leber Makrophagen ohne komplexe Anlagen und Fähigkeiten.
Abstract
Kupffer-Zellen sind Leber-spezifische Makrophagen und spielen eine wichtige Rolle in der physiologischen und pathologischen Funktionen der Leber 1-3. Obwohl die Isolierung Methoden der Leber Makrophagen wurden gut beschrieben 4-6, erfordern die meisten dieser Methoden gehobene Ausstattung, wie eine Zentrifugalkraft elutriator und technischen Fähigkeiten. Hier bieten wir eine neuartige Methode zur Leber Makrophagen in ausreichender Zahl und Reinheit zu erhalten aus gemischten primären Kulturen von adulten Ratten Leberzellen, wie in Abbildung 1 schematisch dargestellt.
Nach Dissoziation der Leberzellen durch Zwei-Schritt-Perfusion-Methode 7,8, einem Bruchteil meist parenchymatösen Hepatozyten besteht vorbereitet und entkernt in T75 Zellkulturflaschen mit Kulturmedium DMEM und 10% FCS.Parenchymal Hepatozyten besteht verlieren die Epithelzellen Morphologie innerhalb von wenigen Tagen in Kultur, degenerieren oder Umwandlung in Fibroblasten-ähnlichen Zellen (Abbildung 2). Wie die Kultur geht, um den Tag 6, Phasenkontrast-hellen, starten rund Makrophagen-ähnlichen Zellen auf die Fibroblasten Zellrasen vermehren (Abbildung 2). Das Wachstum der Makrophagen-ähnlichen Zellen weiter und erreichen Höchstwerte um 12 Tage, für die Zellschicht auf der Flasche Oberfläche. Durch Schütteln der Kulturflaschen, sind Makrophagen leicht in das Kulturmedium suspendiert. Nachfolgende Übertragung und kurze Inkubation in Plastikschalen Ergebnis der selektiven Adhäsion von Makrophagen (Abbildung 3), wo andere kontaminierenden Zellen suspendiert bleiben. Nach mehreren Spülungen mit PBS, angeschlossen sind Makrophagen geerntet. Mehr als 10 6 Zellen können wieder aus dem gleichen T75 Zellkulturflasche auf zwei vor drei tägigen Intervallen geerntet werden für mehr als zwei Wochen (Abbildung 3). Die Reinheiten der isolierten Makrophagen wurden 95 bis 99%, wie mittels Durchflusszytometrie ausgewertet oder Immunzytochemie mit Ratten-Makrophagen-spezifischen Antikörpern (Abbildung 4). Die isolierten Zellen zeigen aktive Phagozytose von polystylene Perlen (Abbildung 5), proliferative Reaktion auf rekombinantes GM-CSF, die Sekretion von entzündlichen / anti-inflammatorischen Zytokinen nach Stimulation mit LPS und Bildung vielkernigen Riesenzellen 9.
Abschließend stellen wir eine einfache und effiziente Methode, um Leber-Makrophagen in ausreichender Zahl und Reinheit zu erhalten, ohne komplexe Anlagen und skills.This Methode auf andere Säugetierarten können.
Protocol
1. Perfusion der Leber
- Anesthetize ein erwachsenes Männchen Sprague-Dawley Ratten (bei 10 bis 15 Wochen alten, Körpergewicht 150-200 g) durch eine intraperitoneale Injektion von Natrium-Pentobarbital-Lösung (50 mg Natrium-Pentobarbital / kg Körpergewicht).
- Legen Sie das Tier in eine rostfreie Pfanne und Spray 70% Ethanol auf seinen Bauch und Brustkorb.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt und Abziehen der Haut. Öffnen Sie den Unterleib durch den Schnitt mit einer Schere.
- Bestätigen Sie den Speicherort der Pfortader, übergeben Sie einen chirurgischen Faden unter der Pfortader und lose Klumpen.
- Clump den distalen Teil der Vena cava inferior und Vena mesenterica Blut Rückfluss in die Leber zu verhindern. Öffnen Sie die Brusthöhle, indem die Membran mit einer Schere, und setzen das Herz.
- Legen Sie eine Kunststoff-Katheter (2 mm Durchmesser) in die Pfortader und ziehen Sie den Faden fest um den Katheter.
- Verbinden Sie den Katheter zu einer Perfusion System, das mit Waschlösung (Ca 2 +-Mg 2 + free HBSS mit 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES und 4,2 mM NaHCO 3, pH 7,2) geladen wird vorgewärmt auf 37 ° C.
- Begin Perfusion in situ mit einer Geschwindigkeit von 10 ml / min. Zur gleichen Zeit, einen Schnitt im rechten Vorhof Wand. Weiter Perfusion für 10 min.
- Schalten Sie die Perfusionslösung zu Kollagenase-Lösung [10 mM HEPES HBSS und 4,2 NaHCO 3 mit Typ I Kollagenase ergänzt (0,05%) und Trypsin-Inhibitor (50 ug / ml); pH 7,5] und perfuse für 10 bis 20 min mit einer Rate von 10 ml / min, bis die Leber leicht anschwillt und zeigt das Zeichen für den Zerfall der Leber-Struktur unter Serosa.
2. Vorbereitung der Parenchymale Hepatocyte-rich Zellfraktion
- Entfernen und transferieren es vorsichtig in der Leber in ein steriles Becherglas mit 25 ml Kollagenase-Lösung. Mince in kleine Stücke schneiden mit der Schere.
- Fügen Sie 75 ml kaltem MEM in die resultierende Zellsuspension. Nach einer sanften Pipettieren, Filtrat durch eine Zelle Sieb (100 um) zu entfernen, Bindegewebe und unverdaute Gewebeteile.
- Das Filtrat in 50 ml konische Röhrchen und zentrifugieren bei 50 xg für 1 min bei 4 ° C (Bremse aus).
- Den Überstand sorgfältig entfernen. Das Pellet mit kaltem MEM.
- Wiederholen 2,4) dreimal.
3. Mixed Primary Kultur von Leberzellen
- Suspend die Zellen in 2,5 erhalten) in das Wachstumsmedium DMEM mit 10% Hitze-inaktiviertem FCS, mit 100 uM β-Mercaptoethanol, 10 pg / ml Insulin, 100 ug / ml Streptomycin und 100 U / ml Penicillin und Samen in Ergänzung zusammen fünf vor zehn Zellkulturflaschen (Fläche: 75 cm 2) bei einer Dichte von 6,7 x 10 4 Zellen / cm 2 (5 x 10 6 Zellen / Kolben / 12 -15 ml Medium).
- Inkubieren Sie die flasksat 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 bis 95% Luft.
- Ersetzen Sie das Nährmedium alle 2 bis 3 Tage Abständen.
4. Selektive Isolierung von Makrophagen
- Nach 12 Tagen der Kultur, vermehren Makrophagen auf der Zellschicht. Diese Zellen sind durch gegenseitige ausgesetzt Schütteln der Kulturflaschen bei 80 bis 120 Hüben pro Minute für 30 Minuten bei 37 ° C.
- Übertragen Sie die Kulturmedium in 100 mm nicht Gewebekultur grade Plastikschalen. Pool des Mediums aus zwei T75-Kolben in eine Plastikschale. Refill Kulturflaschen mit dem Nährmedium und bringt sie in den Inkubator.
- Inkubieren Plastikschalen für 30 min bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 bis 95% Luft. Makrophagen leicht auf nicht-Gewebekultur grade Plastikschalen unter dieser Inkubation Prozess anhängen, während andere kontaminierenden Zellen nicht.
- Saugen Sie das Medium und sanft spülen Sie die Plastikschale mit PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- 1 ml TrypLE Express-Lösung in die Schüssel, und Inkubation für 10min bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 bis 95% Luft.
- Add 9 ml des Nährmediums. Vorsichtig abkratzen der beigefügten Makrophagen durch einen Zellschaber.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15 ml Tube und zentrifugieren bei 180 xg für 5 min bei 25 ° C (Bremse).
- Überstand verwerfen und 1 ml Wachstumsmedium. Distanzieren in einzelne Zellen durch kräftiges Pipettieren. Zählt die Anzahl der Zellen durch eine Zählkammer-Zählen.
- Isolation Schritte können mit der gleichen Kulturflaschen auf zwei vor drei tägigen Intervallen für mehr als zwei Wochen wiederholt werden.
- Isolierte Makrophagen in das Nährmedium in 3.1 beschrieben kultiviert werden.
5. Repräsentative Ergebnisse
Ein Beispiel für eine gemischte primäre Kultur der erwachsenen Ratte Leberzellen ist in Abbildung 2 dargestellt. Parenchymale Hepatozyten verlieren die Epithelzellen Morphologie innerhalb von wenigen Tagen in Kultur, degenerieren oder Umwandlung in Fibroblasten-ähnlichen Zellen.Dann um den Tag von 6 bis 12, Phasenkontrast-helle, runde Makrophagen-ähnlichen Zellen vigourouly wuchern auf den Fibroblasten Zell-Blatt. Durch Schütteln der Kulturflaschen, sind Makrophagen leicht in das Kulturmedium suspendiert und nachfolgende Übertragung und Inkubation in Plastikschalen in selektiven Adhäsion von Makrophagen (Abbildung 3) führen. Die Makrophagen-ähnlichen Zellen können so früh wie Tag 8 geerntet werden, und die Zahlen erreicht maximal Werte an den Tagen 12 bis 14. Mehr als 10 6 Zellen können aus einer T75 Kulturflasche geerntet wiederholt werden auf 2 bis 3 Tage-Intervallen für mehr als zwei Wochen, so dass insgesamt Zelle Ertrag pro Flasche von 10 7 pro T75 Kulturflasche (Abbildung 3). Die Reinheiten der isolierten Makrophagen wurden 95 bis 99%, wie durch Durchflusszytometrie oder Immunzytochemie mit Ratten-Makrophagen-spezifischen Antikörpern, wie ED-1 (Abbildung 4), ED-3, OX-41 (Abbildung 4) und Iba1 9. Bewertet Die isolierten Zellen zeigen typische Merkmale von Makrophagen, wie aktive Phagozytose von polystylene Perlen (Abbildung 5), proliferative Reaktion auf rekombinantes GM-CSF, die Sekretion von entzündlichen / anti-inflammatorischen Zytokinen nach Stimulation mit LPS, und die Bildung von vielkernigen Riesenzellen 9.
Abbildung 1. Ein Schema für die selektive Isolierung und Aufreinigung von Makrophagen-ähnliche Zellen aus gemischten Primärkultur von Leberzellen.
Abbildung 2. Primäre Kultur der Leberzellen und die Proliferation von Makrophagen-ähnlichen Zellen. Der Pfeil zeigt eine mehrkernige Riesenzelle. Maßstab = 100 um. Nachdruck aus der Zeitschrift für Immunologische Methoden, Vol.360, 47-55 (2010) 9 mit Genehmigung von Elsevier.
Abbildung 3. Selektive Isolierung von Makrophagen-ähnliche Zellen, die durch das Schütteln und Befestigungsart. Die Zellen wurden in das Kulturmedium durch Schütteln der Kolben suspendiert, anschließend in nicht-Gewebekultur grade Plastikschalen übertragen, und bei 37 ° C. Bereits 10 min nach dem Ausplattieren, Makrophagen-ähnlichen Zellen an das Gericht Oberfläche, während andere verunreinigende Fibroblasten-Zellen blieb suspendiert. Nach dem Spülen mit PBS wurde ein hochreines Makrophagen Bevölkerung erhalten. Diese Zellen gewonnen typischen Makrophagen Morphologie nach 40 min der Kultur, und mitotischen Zellen wurden häufig beobachtet (Pfeile). Nachträgliche Änderungen in Zellzahlen von Flaschen in verschiedenen Kultur Perioden erholt gezeigt. Die Werte sind im Durchschnitt ± SD 3-5 Flaschen. Die Experimente wurden dreimal wiederholt und die Daten sind durch unterschiedliche Symbole gekennzeichnet. Maßstab = 100 um. Nachdruck aus der Zeitschrift für Immunologische Methoden, Vol.360, 47-55 (2010) 9 mit Genehmigung von Elsevier.
Abbildung 4. Immunzytochemische Färbung von Makrophagen-ähnliche Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen Ratten-Makrophagen.
Abbildung 5. Phagozytose von FITC-markierten Mikrokugeln durch Makrophagen-ähnlichen Zellen.
Discussion
Hier berichten wir über eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus dem gemischten primären Kulturen von adulten Ratten Leberzellen zu erhalten. Unsere Methode beruht zunächst auf dem Roman proliferative Aktivität von Makrophagen in der Mischkultur von Leberzellen, und anschließender Isolierung und Aufreinigung dieser Zellen auf der Basis ihrer biologischen Eigenschaften wie Makrophagen 9. Es kann möglich sein die Makrophagen in der gemischten Primärkultur von erwachsenen Leberzellen vermehrt könnte von Kupffer oder verwandten Zellen, die in den parenchymatösen Hepatozyten Bruchteil kontaminierten entstanden sein. Die Makrophagen könnte zu spezifischen Veränderungen der Umwelt durch Umwandlung von parenchymatösen Hepatozyten 10 und andere Fibroblasten-Zellen in der gemischten primären Kulturen verursacht geantwortet haben.
Zusammenfassend bietet unsere Methode Isolierung von Makrophagen-ähnlichen Zellen in ausreichender Zahl und Reinheit aus dem primären Kultur von Rattenleber cellswithout mit hoch entwickelten Geräten und technischen Fähigkeiten. Darüber hinaus kann die Isolierung Verfahren mit der gleichen Kulturflasche für mehr als zwei Wochen wiederholt werden. Diese Methode könnte auch für andere Säugetierarten.
Disclosures
Alle Tiere wurden gehalten und betrieben in der Tierhaltung in der National Institute of Animal Health, nach den Richtlinien und Vorschriften her durch die Institution des Ausschusses für Tierversuche eingestellt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium und ein Grant-in-Aid aus dem Food Nanotechnologie Projekt des Ministeriums für Landwirtschaft, Forsten und Fischerei Japans. Finanzierte
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital solution | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl Injection | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Cell dissociation grade (Lot check needed) |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
| Eagle’s minimum essential medium (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) | Sigma-Aldrich | D-6459 | High glucose-type |
| Fetal calf serum (FCS) | Hyclone | SH30070.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed) |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ free |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Stock: 100 mM in distilled water |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-5500 | Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | Mesh size: 100 μm |
| Tissue culture flask | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Surface area: 75 cm2 |
| Non-tissue culture plastic dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Cell scraper | Corning | 3010 | |
| Reciprocal shaker | TAITEC | NR-1 |
References
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- Gorrell,
