Summary
En ny metod för att få makrofager från primär kultur av celler råttlever beskrivs. Denna metod utnyttjar spridningen av makrofager i kulturen, följt av skakning av kultur kolvar och rening genom selektiv bilaga till plastskålar. Denna teknik ger ett effektivt leverns makrofager utan komplicerad utrustning och kompetens.
Abstract
Kupfferceller är lever-specifika bosatt makrofager och spelar en viktig roll i den fysiologiska och patologiska funktioner i levern 1-3. Även om isoleringen metoder lever makrofager har väl beskrivna 4-6, de flesta av dessa metoder kräver avancerad utrustning, såsom en centrifugal elutriator och tekniska färdigheter. Här ger vi en ny metod för att få levern makrofager i tillräckligt antal och renhet från blandade primära kulturer av vuxna celler råttlever, som schematiskt visas i figur 1.
Efter dissociation i levern celler genom två steg perfusion metod 7,8, är en bråkdel mestadels består av parenkymal hepatocyter förberedd och seedade i T75 kolvar vävnadsodling med odlingsmedium som består av DMEM och 10% FCS.Parenchymal hepatocyter förlora epitelceller morfologi inom några dagar i kultur, degenererade eller förvandlas till fibroblastliknande celler (Figur 2). Som kultur intäkterna, runt dag 6, faskontrast-ljusa, runda makrofager-liknande celler börjar att föröka sig på fibroblastic cellen blad (figur 2). Tillväxten av makrofager-liknande celler fortsätta och nå till maximala nivåer runt dag 12, som täcker cellen arket på kolven ytan. Genom att skaka av kulturen kolvar, är makrofager lätt skjutas in i odlingsmedium. Senare överföring och korta inkubation i plastskålar resultera i selektiv vidhäftning av makrofager (Figur 3), där andra kontaminerande celler förblir svävande. Efter flera sköljningar med PBS, bifogas makrofager skördas. Mer än 10 6 celler kan skördas flera gånger från samma T75 vävnadsodling kolv två till tre dagars intervall under mer än två veckor (Figur 3). Renhet av de isolerade makrofager var 95 till 99%, som utvärderats med flödescytometri eller immuncytokemi med råtta makrofag-specifika antikroppar (Figur 4). isolerade celler visar aktiv fagocytos av polystylene pärlor (Figur 5), proliferativa svar på rekombinant GM-CSF, sekretion av inflammatoriska / anti-inflammatoriska cytokiner vid stimulering med LPS, och bildandet av flerkärniga jätteceller 9.
Avslutningsvis ger vi en enkel och effektiv metod för att få levern makrofager i tillräckligt antal och renhet utan komplicerad utrustning och skills.This metoden kan tillämpas på andra däggdjursarter.
Protocol
1. Genomblödning av levern
- Bedöva en vuxen man Sprague-Dawley råtta (vid 10 till 15 veckor gamla, kroppsvikt 150-200 g) genom en intraperitoneal injektion av en natrium pentobarbital lösning (50 mg natrium pentobarbital / kg kroppsvikt).
- Placera djuret i en rostfri kastrull och spraya 70% etanol på dess buk och thorax.
- Gör en liten klippa och dra av huden. Öppna buken genom skåran med en sax.
- Bekräfta placeringen av portalen ven, passerar en kirurgisk tråden under portalen ven och löst klump.
- Klumpar den distala delen av sämre vena cava och mesenteriska ven för att förhindra blod ske till levern. Öppna brösthålan genom att skära membranet med sax, och utsätta hjärtat.
- Sätt en plast-kateter (2 mm i diameter) till portalen ven och dra åt tråden ordentligt runt katetern.
- Koppla katetern till en perfusion system som är laddad med tvättlösning (Ca 2 +-Mg 2 + gratis HBSS innehållande 0,5 mM EGTA, 10 HEPES mm och 4,2 mm NaHCO 3, pH 7,2) uppvärmd vid 37 ° C.
- Börja perfusion på plats med en hastighet av 10 ml / min. Samtidigt, gör ett snitt i höger förmak väggen. Fortsätt perfusion i 10 min.
- Växla perfusionen lösningen kollagenas lösning [HBSS innehåller 10 mM HEPES och 4.2mm NaHCO 3 kompletteras med Typ I kollagenas (0,05%) och trypsin inhibitor (50 mikrogram / ml), pH 7,5], och BEGJUTA i 10 - 20 minuter med en hastighet 10 ml / min tills levern något sväller och visar tecken för upplösningen av levern struktur under serösa membran.
2. Beredning av parenkymal Hepatocyte-rika Cell Bråk
- Ta bort och töm i levern till en steril bägare som innehåller 25 ml kollagenas lösning. Mal i små bitar med sax.
- Tillsätt 75 ml kall MEM in den resulterande cellsuspension. Efter varsam pipettering, filtratet genom en cell sil (100 mikrometer) för att ta bort bindväv och osmält fragment vävnad.
- Överför filtratet till 50 ml koniska rör och centrifugera vid 50 xg i 1 min vid 4 ° C (broms av).
- Försiktigt kassera supernatanten. Suspendera pelleten med kallt MEM.
- Upprepa 2,4) tre gånger.
3. Blandade Primär Kultur av leverceller
- Häng de celler som erhållits i 2,5) i det odlingsmedium som består av DMEM innehåller 10% värmeinaktiverad FCS, kompletterat med 100 mikroM β-merkaptoetanol, 10 mikrogram / ml insulin, 100 mikrogram / ml streptomycin och 100 E / ml penicillin, och utsäde till 09:55 vävnadsodling kolvar (yta: 75 cm 2) med en densitet på 6,7 x 10 4 celler / cm 2 (5 x 10 6 celler / kolv / 12 -15 ml medium).
- Inkubera kultur flasksat 37 ° C i en atmosfär av 5% CO 2 - 95% luft.
- Byt odlingsmedium var 2 till 3 dagars intervall.
4. Selektiv Isolering av makrofager
- Efter 12 dagar av kultur, makrofager föröka sig på cellens arket. Dessa celler är upphängda med ömsesidiga skaka av kulturen kolvar vid 80 till 120 slag per minut i 30 minuter vid 37 ° C.
- Överför odlingsmedium till 100 mm icke-vävnadsodling kvalitet plastskålar. Pool mediet från två T75 kolvarna till en plast skål. Fyll kultur kolvar med den tillväxt på medellång och returnera dem till inkubatorn.
- Inkubera plastskålar i 30 minuter vid 37 ° C i en atmosfär av 5% CO 2 - 95% luft. Makrofager fäster lätt till icke-vävnaden plast kultur årskurs rätter under denna inkubation processen, medan andra kontaminerande celler inte.
- Aspirera på medellång och försiktigt skölja plasten skålen med PBS. Upprepa detta steg tre gånger.
- Tillsätt 1 ml TrypLE Express lösning i skålen, och inkubera i 10 min vid 37 ° C i en atmosfär av 5% CO 2 - 95% luft.
- Tillsätt 9 ml odlingsmedium. Försiktigt skrapa bort den bifogade makrofager av en cell skrapa.
- Överför cellsuspension i en 15 ml koniska rör och centrifugera vid 180 xg under 5 minuter vid 25 ° C (broms på).
- Kassera supernatanten och tillsätt 1 ml av tillväxten medium. Sönderfalla i enstaka celler av kraftig pipettering. Räkna cellen antalet med en hemocytometer-räkna.
- Isolering steg kan upprepas med samma kultur kolvarna två till tre dagars intervall under mer än två veckor.
- Isolerade makrofager kan odlas i odlingsmedium som beskrivs i 3.1.
5. Representativa resultat
Ett exempel på en blandad primär kultur av vuxna celler råttlever visas i figur 2. Parenkymal hepatocyter förlorar epitelceller morfologi inom några dagar i kultur, degenererade eller förvandlas till fibroblastliknande celler.Sedan, runt dag 6 till 12, faskontrast-ljusa, runda makrofager-liknande celler föröka vigourouly på fibroblastic cell bladet. Genom att skaka av kulturen kolvar, är makrofager lätt skjutas in i ett odlingsmedium och efterföljande överföring och inkubation i plastskålar resultera i selektiv vidhäftning av makrofager (Figur 3). Det makrofager-liknande celler kan skördas så tidigt som dag 8, och antalet nådde maximala nivåer dagar 12 till 14. Mer än 10 6 celler kan tas ut från en T75 kultur kolv upprepade gånger vid 2 till 3 dagars intervall under mer än två veckor, vilket möjliggör en total cell avkastning per kolv 10 7 per T75 kultur kolven (Figur 3). Den renhet av de isolerade makrofager var 95 till 99%, som utvärderats av flowcytometry eller immuncytokemi med råtta makrofag-specifika antikroppar, såsom ED-1 (Figur 4), ED-3, OX-41 (Figur 4) och Iba1 9. Den isolerade celler visar typiska egenskaper makrofager, såsom aktiv fagocytos av polystylene pärlor (Figur 5), proliferativa svar på rekombinant GM-CSF, sekretion av inflammatoriska / anti-inflammatoriska cytokiner vid stimulering med LPS, och bildandet av flerkärniga jätteceller 9.
Figur 1. Ett system för selektiv isolering och rening av makrofag-liknande celler från blandade primära kultur av celler råttlever.
Figur 2. Primär kultur av celler råttlever och spridning av makrofag-liknande celler. Pilen visar ett multinuclear jätte cell. Skala bar = 100 ìm. Utdrag ur Journal of immunologiska metoder, Vol.360, 47-55 (2010) 9 med tillstånd från Elsevier.
Figur 3. Selektiv isolering av makrofager-liknande celler genom att skaka och redskap metod. Celler avbröts i substratet genom att skaka kolvar, därefter överföras till icke-vävnadsodling kvalitet plastskålar, och inkuberas vid 37 ° C. Redan 10 min efter plätering, makrofager-liknande celler som bifogas skålen ytan, medan andra kontaminerande fibroblastic cellerna förblev svävande. Efter sköljning med PBS, var en högt renat makrofag befolkningen erhålls. Dessa celler fick typiska makrofag morfologi efter 40 min för kultur och mitotiska celler observerades ofta (pilar). Efterföljande förändringar i cell nummer återhämtat sig från flaskor på olika kultur perioder visas. Värdena är ett genomsnitt ± SD 3-5 kolvar. Experiment upprepades tre gånger och data visas med olika symboler. Skala bar = 100 ìm. Utdrag ur Journal of immunologiska metoder, Vol.360, 47-55 (2010) 9 med tillstånd från Elsevier.
Figur 4. Immuncytokemiska färgning av makrofager-liknande celler med monoklonala antikroppar mot råtta makrofager.
Figur 5. Fagocytos av FITC-märkt mikrokulor av makrofager-liknande celler.
Discussion
Här rapporterar vi en enkel och effektiv metod för att få makrofager från blandade primära kulturer av vuxna celler råttlever. Vår metod är man först på romanen proliferativ aktivitet av makrofager i den blandade kulturen av celler råttlever och sedan efterföljande isolering och rening av dessa celler på grund av deras biologiska egenskaper som makrofager 9. Det kan vara möjligt makrofagerna snabbt föröka sig i den blandade primära kultur vuxna leverceller kan ha sitt ursprung i Kupffers eller relaterade celler som förorenade i parenkymal hepatocyter fraktion. Det makrofager kan ha svarat på särskilda miljömässiga förändringar orsakade av omvandlingen av parenkymal hepatocyte 10 och andra fibroblastic celler i blandade primära kulturer.
Sammanfattningsvis ger vår metod isolering av makrofager-liknande celler i tillräckligt antal och renhet från den primära kultur råttlever cellswithout med avancerad utrustning och tekniska färdigheter. Dessutom kan isoleringen proceduren upprepas med samma kultur kolv i mer än två veckor. Denna metod kan tillämpas på andra däggdjursarter.
Disclosures
Alla djur hölls och drivs i djuret anläggningen i National Institute of Animal Health, enligt de riktlinjer och regler som anges av institutionens kommitté för djurförsök.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av ett forskningsanslag och ett bidrags-i-Stöd från Food Nanoteknik projekt av ministeriet för jordbruk, skogsbruk och fiske i Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital solution | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl Injection | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Cell dissociation grade (Lot check needed) |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
| Eagle’s minimum essential medium (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) | Sigma-Aldrich | D-6459 | High glucose-type |
| Fetal calf serum (FCS) | Hyclone | SH30070.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed) |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ free |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Stock: 100 mM in distilled water |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-5500 | Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | Mesh size: 100 μm |
| Tissue culture flask | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Surface area: 75 cm2 |
| Non-tissue culture plastic dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Cell scraper | Corning | 3010 | |
| Reciprocal shaker | TAITEC | NR-1 |
References
- Crispe, I. N. The liver as a lymphoid organ. Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).
- Roberts, R. A. Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis. Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).
- Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. Liver: An organ with predominant innate immunity. Hepatology. 47, 729-736 (2008).
- Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation. J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).
- Olynyk, J. K., Clarke, S. L. Isolation and primary culture of rat Kupffer cells. J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).
- Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay. J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Yoshioka, M. Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells. Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).
- Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells. J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).
- Gorrell,
