Summary
Un nuovo metodo per ottenere i macrofagi da colture primarie di cellule di fegato di ratto è descritto. Questo metodo utilizza la proliferazione dei macrofagi nella cultura, seguita da agitazione di palloni cultura e la purificazione di attaccamento selettivo ai piatti di plastica. Questa tecnica fornisce in modo efficiente i macrofagi del fegato, senza attrezzature complesse e competenze.
Abstract
Cellule di Kupffer del fegato sono specifici per macrofagi residenti e svolgono un ruolo importante nelle funzioni fisiologiche e patologiche del fegato 1-3. Anche se i metodi di isolamento dei macrofagi del fegato sono state ben descritte 4-6, la maggior parte di questi metodi richiedono apparecchiature sofisticate, come un elutriator centrifuga e competenze tecniche. Ecco, mettiamo a disposizione un nuovo metodo per ottenere i macrofagi del fegato in numero sufficiente e purezza da miste colture primarie di cellule adulte fegato di ratto, come schematicamente illustrato nella figura 1.
Dopo la dissociazione delle cellule del fegato da due fasi metodo di perfusione 7,8, una frazione per lo più composto da epatociti parenchimale è preparato e seminato in fiasche T75 tessuto cultura con terreno di coltura costituito da DMEM e il 10% epatociti FCS.Parenchymal perdere la morfologia delle cellule epiteliali entro pochi giorni di cultura, degeneri o si trasformano in cellule fibroblasto-simili (Figura 2). Con il procedere della cultura, intorno al 6 ° giorno, contrasto di fase-brillante, tondo macrofagi, come le cellule a proliferare sul foglio delle cellule fibroblastica (Figura 2). La crescita del macrofago-come le cellule continuare e arrivare ai livelli massimi intorno al giorno 12, che copre strato di cellule sulla superficie del pallone. Agitando dei flaconi cultura, i macrofagi sono prontamente sospese nel terreno di coltura. Il successivo trasferimento e breve incubazione in plastica risultato piatti in adesione selettiva dei macrofagi (Figura 3), dove rimangono sospese come le altre cellule contaminanti. Dopo diversi lavaggi con PBS, i macrofagi allegato vengono raccolte. Più di 10 6 cellule possono essere raccolte più volte dallo stesso T75 fiasco colture di tessuti a intervalli di 2-3 giorni per più di due settimane (Figura 3). La purezza dei macrofagi isolati sono stati del 95 al 99%, valutata mediante citometria di flusso o immunocitochimica con ratto macrofagi anticorpi specifici (Figura 4). Le cellule isolate mostrano fagocitosi attiva di perline polystylene (Figura 5), la risposta proliferativa a ricombinante GM-CSF, la secrezione di infiammatorio / citochine antinfiammatorie sulla stimolazione con LPS, e formazione di cellule giganti multinucleate 9.
In conclusione, mettiamo a disposizione un metodo semplice ed efficace per ottenere i macrofagi del fegato in numero sufficiente e purezza senza attrezzature complesse e skills.This metodo potrebbe essere applicabile ad altre specie di mammiferi.
Protocol
1. Perfusione del Fegato
- Anestetizzare un adulto maschio di ratto Sprague-Dawley (a 10 a 15 settimane di età, peso corporeo 150-200 g) con un'iniezione intraperitoneale di una soluzione di sodio pentobarbital (50 mg di sodio pentobarbital / kg di peso corporeo).
- Posto l'animale in una padella in acciaio e spray etanolo al 70% sul suo addome e torace.
- Fai un piccolo taglio e di staccare la pelle. Aperto l'addome dal taglio con un paio di forbici.
- Confermare la posizione di vena porta, passa un filo chirurgico sotto la vena porta e liberamente si aggregano.
- Clump la parte distale della vena cava inferiore e la vena mesenterica per prevenire il reflusso del sangue nel fegato. Aprire la cavità toracica tagliando il diaframma con le forbici, ed esporre il cuore.
- Inserire un catetere di plastica (2 mm di diametro) nella vena porta e serrare saldamente il filo intorno al catetere.
- Collegare il catetere ad un sistema di perfusione che viene caricato con soluzione di lavaggio (Ca 2 +-Mg 2 + HBSS gratuito contenente 0,5 mM EGTA, 10 HEPES mM e 4,2 mM NaHCO 3; pH 7,2) preriscaldata a 37 ° C.
- Iniziare perfusione in situ a una velocità di 10 ml / min. Allo stesso tempo, fare un taglio nella parete dell'atrio destro. Continua perfusione per 10 minuti.
- Accendere la soluzione di perfusione alla soluzione collagenasi [HBSS contenente HEPES 10mm e 4,2 mm NaHCO 3 integrati con collagenasi di tipo I (0,05%) e inibitori della tripsina (50 mg / ml), pH 7,5], e profumato per 10 - 20 minuti a una velocità di 10 ml / min fino a quando il fegato si gonfia leggermente e mostra il segno di disintegrazione della struttura del fegato sotto membrana sierosa.
2. Preparazione di epatociti parenchimale ricchi frazione di cellule
- Rimuovere e trasferire con cautela il fegato in un bicchiere sterile contenente 25 ml di soluzione di collagenasi. Tritare in piccoli pezzi con le forbici.
- Aggiungere 75 ml di MEM freddo nella sospensione cellulare risultante. Dopo pipettaggio dolce, filtrato attraverso un colino cellulare (100 micron) per rimuovere i tessuti connettivi e frammenti di tessuto non digerito.
- Trasferire il filtrato in provette da 50 ml e centrifugare a 50 xg per 1 minuto a 4 ° C (freno off).
- Eliminare attentamente il supernatante. Risospendere il pellet con MEM freddo.
- Ripetere 2,4) tre volte.
3. Misti Cultura primaria delle cellule del fegato
- Sospendere le cellule ottenute in 2.5) nel mezzo di crescita composto da DMEM contenente 10% FCS inattivato con il calore, integrato con 100 mM β-mercaptoetanolo, 10 mg / ml di insulina, 100 mg / ml di streptomicina e 100 U / ml di penicillina, e di semi in 09:55 tessuto fiaschi cultura (superficie: 75 cm 2) ad una densità di 6,7 x 10 4 cellule / cm 2 (5 x 10 6 cellule / fiasco / 12 -15 ml di terreno).
- Incubare la cultura flasksat 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2-95% di aria.
- Sostituire il mezzo di coltura ogni 2 o 3 intervalli di giorni.
4. Isolamento selettivo dei macrofagi
- Dopo 12 giorni di coltura, i macrofagi proliferano sul foglio delle cellule. Queste cellule sono sospese dalle reciproche agitazione dei flaconi cultura a 80-120 colpi al minuto per 30 minuti a 37 ° C.
- Trasferire il terreno di coltura in 100 mm non tessuto cultura piatti di qualità plastica. Piscina del mezzo da due T75 fiaschi in un piatto di plastica. Fiaschi cultura riempire con il mezzo di crescita e li riporta ai incubatrice.
- Incubare piatti di plastica per 30 minuti a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2-95% di aria. Macrofagi prontamente attribuiscono alla non-tessuti piatti di plastica di qualità della cultura in questo processo di incubazione, mentre altre cellule contaminanti non lo fanno.
- Aspirare il mezzo e risciacquare delicatamente il piatto di plastica con PBS. Ripetere questa operazione tre volte.
- Aggiungere 1 ml di soluzione TrypLE espresso nel piatto, e incubare per 10 minuti a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2-95% di aria.
- Aggiungere 9 ml del mezzo di crescita. Delicatamente togliere la macrofagi attaccato da un raschietto cellula.
- Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml e centrifugare a 180 xg per 5 min a 25 ° C (freno).
- Eliminare il supernatante e aggiungere 1 ml del mezzo di crescita. Dissociano in singole cellule pipettando vigoroso. Enumerare il numero di cellulare da un emocitometro conteggio.
- Passaggi di isolamento può essere ripetuto con la stessa cultura fiaschi a intervalli di 2-3 giorni per più di due settimane.
- Macrofagi isolati possono essere coltivate in terreno di coltura cui al punto 3.1.
5. Rappresentante Risultati
Un esempio di una coltura mista primaria di cellule adulte fegato di ratto è illustrato nella figura 2. Epatociti parenchimale perdere la morfologia delle cellule epiteliali in pochi giorni di cultura, degeneri o si trasformano in fibroblasto-come le cellule.Poi, intorno al giorno 6 a 12, a contrasto di fase-brillante, tondo macrofago-come le cellule proliferano vigourouly sul foglio cellulare fibroblastica. Agitando dei flaconi cultura, i macrofagi sono prontamente sospese nel terreno di coltura, e il successivo trasferimento e l'incubazione in piatti di plastica risultato in adesione selettiva dei macrofagi (Figura 3). Il macrofago-come le cellule possono essere raccolte fin dal giorno 8, e il numero ha raggiunto livelli massimi nei giorni 12 a 14. Più di 10 6 cellule possono essere raccolte da un pallone T75 cultura ripetutamente da 2 a intervalli di 3 al giorno per più di due settimane, consentendo un rendimento totale di cellule per bombola del 10 7 al T75 fiasco cultura (Figura 3). La purezza dei macrofagi isolati sono stati del 95 al 99%, come valutato da flowcytometry o immunocitochimica con ratto macrofagi anticorpi specifici, come ED-1 (Figura 4), ED-3, OX-41 (Figura 4) e Iba1 9. Le cellule isolate mostrano caratteristiche tipiche dei macrofagi, come la fagocitosi attiva di perline polystylene (Figura 5), la risposta proliferativa a ricombinante GM-CSF, la secrezione di infiammatorio / citochine antinfiammatorie sulla stimolazione con LPS, e la formazione di cellule giganti multinucleate 9.
Figura 1. Un sistema per l'isolamento e la purificazione dei macrofagi come cellule miste colture primarie di cellule di fegato di ratto.
Figura 2. Colture primarie di cellule di fegato di ratto e la proliferazione dei macrofagi come cellule. Freccia indica una cella multinucleare gigante. Barra di scala = 100 micron. Ristampato dalla Gazzetta di metodi immunologici, Vol.360, 47-55 (2010) 9 con il permesso di Elsevier.
Figura 3. Isolamento selettivo di macrofagi come le cellule dalle scosse e il metodo di fissaggio. Le cellule sono state sospese nel terreno di coltura agitando i palloni, successivamente trasferito in non-tessuto piatti di plastica cultura grado, e incubate a 37 ° C. Già 10 minuti dopo la placcatura, macrofagi come le cellule attaccate alla superficie piatto, mentre altre cellule contaminanti fibroblastica è rimasta in sospeso. Dopo il risciacquo con PBS, una popolazione di macrofagi altamente purificato è stato ottenuto. Queste cellule guadagnato morfologia tipica dei macrofagi dopo 40 min di cultura e cellule mitotiche sono stati osservati frequentemente (frecce). Successive modifiche del numero delle cellule recuperato palloni in periodi di diversa cultura sono mostrati. I valori sono una media ± SD 3-5 fiaschi. Gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte ed i dati sono indicate da simboli diversi. Barra di scala = 100 micron. Ristampato dalla Gazzetta di metodi immunologici, Vol.360, 47-55 (2010) 9 con il permesso di Elsevier.
Figura 4. Colorazione immunocitochimica dei macrofagi come cellule con anticorpi monoclonali contro macrofagi di ratto.
Figura 5. Fagocitosi di marcato con FITC microsfere da macrofagi come cellule.
Discussion
Qui riportiamo un metodo semplice ed efficace per ottenere macrofagi dalle culture miste primarie di cellule adulte fegato di ratto. Il nostro metodo si basa sul primo romanzo l'attività proliferativa dei macrofagi nella cultura mista di cellule del fegato di ratto, e poi il successivo isolamento e la purificazione di queste cellule in base alle loro caratteristiche biologiche come macrofagi 9. Potrebbe essere possibile i macrofagi proliferato nella cultura misto primario delle cellule epatiche adulte potrebbero avere origine da cellule di Kupffer o correlati che contaminata nella frazione parenchimale epatociti. I macrofagi potrebbe avere risposto a specifici cambiamenti ambientali causati dalla trasformazione delle cellule parenchimali epatociti 10 e altre fibroblastica in colture miste primarie.
In conclusione, il nostro metodo fornisce l'isolamento di cellule macrofaghe in numero sufficiente e la purezza della cultura primario del fegato di ratto cellswithout utilizzando sofisticate apparecchiature e competenze tecniche. Inoltre, la procedura di isolamento può essere ripetuta con il pallone stessa cultura per più di due settimane. Questo metodo può essere applicabile ad altre specie di mammiferi.
Disclosures
Tutti gli animali erano tenuti e gestiti nella struttura animale presso l'Istituto Nazionale della Salute degli animali, secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dal comitato dell'istituzione per gli esperimenti sugli animali.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di ricerca e una borsa-in-Aid dalla Food Project Nanotecnologia del Ministero dell'agricoltura, delle foreste e della pesca del Giappone.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital solution | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl Injection | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Cell dissociation grade (Lot check needed) |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
| Eagle’s minimum essential medium (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) | Sigma-Aldrich | D-6459 | High glucose-type |
| Fetal calf serum (FCS) | Hyclone | SH30070.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed) |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ free |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Stock: 100 mM in distilled water |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-5500 | Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | Mesh size: 100 μm |
| Tissue culture flask | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Surface area: 75 cm2 |
| Non-tissue culture plastic dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Cell scraper | Corning | 3010 | |
| Reciprocal shaker | TAITEC | NR-1 |
References
- Crispe, I. N. The liver as a lymphoid organ. Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).
- Roberts, R. A. Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis. Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).
- Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. Liver: An organ with predominant innate immunity. Hepatology. 47, 729-736 (2008).
- Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation. J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).
- Olynyk, J. K., Clarke, S. L. Isolation and primary culture of rat Kupffer cells. J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).
- Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay. J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Yoshioka, M. Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells. Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).
- Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells. J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).
- Gorrell,
