Summary
Makrofajlar sıçan karaciğer hücrelerinin primer kültür elde etmek için yeni bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, plastik tabaklar, seçici eklenti kültür matara ve arıtma sallayarak kültürün yayılması, makrofajlar kullanır. Bu teknik, karmaşık ekipman ve becerileri verimli olmadan karaciğer makrofajlar sağlar.
Abstract
Kupffer hücreleri karaciğer özel ikamet eden makrofaj ve karaciğer 1-3 fizyolojik ve patolojik fonksiyonları önemli bir rol oynamaktadır. Karaciğer makrofajların izolasyon yöntemleri 4-6 iyi tanımlanmış olmasına rağmen, bu yöntemlerin çoğu böyle bir santrifüj elutriator ve teknik beceri olarak gelişmiş donanım gerektirir. Burada, karaciğer makrofajlar şematik olarak Şekil 1'de gösterildiği gibi yetişkin sıçan karaciğer hücrelerinin karışık birincil kültürleri, yeterli sayıda ve saflık elde etmek için yeni bir yöntem sağlar.
Iki adım perfüzyon yöntemi 7,8 karaciğer hücrelerinin disosiasyon sonra, çoğunlukla parankimal hepatositlerde oluşan bir kısmını hazırlanan ve T75 DMEM ve% 10 FCS.Parenchymal hepatositlerde oluşan kültür ortamı ile doku kültürü şişeleri içine numaralı seribaşı epitel hücre morfolojisi kaybedersiniz birkaç gün içinde bir kültür, yozlaşmış ya da fibroblast benzeri hücreler (Şekil 2) haline dönüştürmek. Kültür, yaklaşık 6 gün ilerledikçe, faz kontrast parlak, yuvarlak makrofaj benzeri hücreler (Şekil 2) fibroblastik hücre kağıda prolifere başlar. Gibi Makrofaj gibi hücrelerin büyümesini devam şişeyi yüzeyinde hücre sayfasını kapsayan ve yaklaşık 12 gün maksimum seviyelere ulaşmak. Kültür şişe çalkalanarak, makrofajlar kolaylıkla kültür ortamı içine askıya alınır. Gibi diğer kirlenmesine neden olan hücreleri askıda kalır makrofajlar seçici yapışma plastik tabaklar sonucu sonraki transfer ve kısa inkübasyon (Şekil 3). PBS ile birkaç durular sonra, ekli makrofajlar hasat edilir. 10'dan fazla 6 hücre, iki haftadan daha uzun (Şekil 3), 2-3 gün aralıklarla aynı T75 doku kültürü şişesi sürekli hasat veya flow sitometri tarafından değerlendirilir olarak izole makrofajların saflık, 95 % 99 sıçan makrofaj-spesifik antikorların (Şekil 4) ile immünsitokimya izole hücrelerinin LPS ile uyarılması ve oluşumu üzerine polystylene boncuk aktif fagositoz (Şekil 5), GM-CSF rekombinant proliferatif yanıt, inflamatuar / anti-inflamatuar sitokinlerin salgılanması multinükleer dev hücreler 9.
Sonuç olarak, bu yöntemi diğer memeli türleri için geçerli olabilir, karmaşık ekipman ve skills.This olmadan, yeterli sayıda ve saflık karaciğer makrofajlar elde etmek için basit ve etkili bir yöntem sağlar.
Protocol
1. Karaciğer, Perfüzyon
- Intraperitoneal sodyum pentobarbital bir çözüm (50 mg sodyum pentobarbital / kg vücut ağırlığı); yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçan (vücut ağırlığı 150-200 gr hafta-10-15) anestezisi.
- Paslanmaz bir tavada hayvan koyun ve% 70 etanol, karın ve göğüs üzerine püskürtün.
- Açıklarındaki küçük bir kesim ve cilt soyma olun. Bir makas ile kesme karın açın.
- Portal ven yerini onaylayın, portal ven ve gevşek bir tutam altında bir cerrahi iplik geçer.
- Tutam inferior vena kava ve karaciğerde kanın geri kaçmasını önleyecek şekilde mezenterik ven distal parçası. Göğüs boşluğu diyafram makasla keserek açın ve kalp maruz.
- Plastik bir kateter (2 mm çapında) ve portal ven içine yerleştirin ve kateter etrafında konu iyice sıkın.
- 37 ° prewarmed ° C; yıkama solüsyonu (pH 7,2 Ca 2 +-Mg 2 + 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES ve 4.2 mM NaHCO 3 içeren ücretsiz HBSS) ile yüklenen bir perfüzyon sistemi kateter bağlayın
- 10 ml / dak hızında in situ perfüzyon başlayın. Aynı zamanda, sağ atrium duvarında bir kesim olun. 10 dakika için perfüzyon devam edin.
- Perfüzyon çözüm kollajenaz çözüm Anahtarı [Tipi ile desteklenmiş 10mM Hepes ve 4.2mm NaHCO 3 içeren HBSS kollajenaz (% 0.05) ve tripsin inhibitörü (50 mg / ml), pH 7.5] 10 ve serpmek hızında 20 dakika 10 ml / dak karaciğer biraz şişer ve seröz membran altında karaciğer yapısının dağılması için işareti gösterene kadar.
2. Parankimal Hepatosit zengin Hücre Kesir hazırlanması
- Çıkarın ve dikkatli bir şekilde steril bir behere 25 ml kollajenaz çözüm içeren karaciğer transferi. Makasla küçük parçalar halinde Kıyma.
- Ortaya çıkan hücre süspansiyonu içine 75 ml soğuk MEM ekleyin. Nazik pipetleme sonra, süzüntü bir hücre süzgeç (100 mm) ile, bağ dokuları ve sindirilememiş doku parçaları kaldırmak için.
- 4 ° C (fren kapalı) 1 dakika 50 xg'de süzüntü 50 ml konik tüpler ve santrifüj içine aktarın.
- Süpernatantı dikkatli atın. Soğuk MEM pelletini tekrar.
- ) Üç kez 2.4 tekrarlayın.
3. Karaciğer Hücreleri Karma İlköğretim Kültür
- DMEM 100 mcM β-mercaptoethanol 10 mg / ml insülin, 100 mg / ml streptomisin ve 100 U / ml penisilin ve tohum ile desteklenmiş% 10 ısı inaktive FCS içeren oluşan besi 2.5 'te elde edilen hücreler) Askıya Alma 6.7 x 10 4 hücre / cm 2 (orta 5 x 10 6 hücre / şişeyi / 12 -15 ml) yoğunluğu: 09:55 doku kültürü şişeleri (75 cm 2 yüzey alanı).
- Inkübe kültür flasksat 37 ° C -% 5 CO 2 'nin bir atmosfer% 95 hava.
- Besi her 2 ila 3 gün aralıklarla değiştirin.
4. Makrofajlar, Seçici İzolasyon
- 12 gün sonra kültür, makrofaj hücre kağıda çoğalırlar. Bu hücreler, 80 kültür şişe sallayarak karşılıklı tarafından askıya alınır - 30 dakika için dakikada 120 vuruş 37 ° C
- 100 mm olmayan doku kültürü dereceli plastik tabaklar kültür ortamı içine aktarın. Bir plastik tabak içine iki T75 şişeler orta Havuzu. Büyüme, orta ve Yedek kültür şişeler inkübatör onları geri.
- 37 30 dakika inkübe plastik tabaklar ° C -% 5 CO2 atmosferi% 95 hava Makrofajlar kolayca diğer kirliliğe neden olan hücreleri yok ise, bu kuluçka süreci kapsamında olmayan doku kültürü notu plastik tabaklar eklemek.
- Aspire orta ve PBS ile plastik yemek nazikçe yıkayın. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
- TrypLE Express çözümü 1 ml çanak içine ekleyin ve 37 o 10 dakika süreyle inkübe ° C -% 5 CO2 atmosferi% 95 hava.
- Besi 9 ml ekleyin. Bir hücre kazıyıcı bağlı makrofaj hafifçe kazıyın.
- Hücre süspansiyonu, ° C (fren) 5 dakika boyunca 25 180 xg 15 ml konik tüp ve santrifüj içine aktarın.
- Süpernatantı atın ve besi 1 ml ekleyin. Dinç pipetleme tek hücre içine ayrıştırmaları. Hemasitometre sayma hücre sayısı numaralandırılamıyor.
- İzolasyon adımları, 2-3 gün aralıklarla en fazla iki hafta boyunca aynı kültür şişeler tekrarlanmalıdır.
- İzole makrofajlar 3.1 'de açıklanan büyüme ortamında yetiştirilebilir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Yetişkin sıçan karaciğer hücrelerinin karışık bir birincil kültürünün bir örneği Şekil 2'de gösterilmiştir. Parankimal hepatositler kültür birkaç gün içinde epitel hücre morfolojisi kaybedersiniz, yozlaşmış ya da fibroblast-benzeri hücreler haline dönüştürmek.Sonra, günde yaklaşık 6 ila 12, faz kontrast parlak, yuvarlak makrofaj benzeri hücreler vigourouly fibroblastik hücre kağıda çoğalırlar. Kültür şişe çalkalanarak, makrofajlar kültür ortama kolayca askıya alınır ve plastik tabaklar sonraki transfer ve inkübasyon makrofaj seçici yapışma (Şekil 3). Makrofaj-benzeri hücreler 8. günde olduğu kadar erken olarak hasat ve sayıları 12 ila 14 gün maksimum seviyelere ulaşmıştır. Fazla 10 6 hücre kültür şişesi (Şekil 3) 10 7 T75 her bir şişesi ortalama toplam hücre verimi sağlayan, en fazla iki hafta boyunca 2 ila 3 gün aralıklarla art arda T75 kültür şişelerinde hasat edilebilir . Izole makrofajların saflık ED-1 (Şekil 4), ED-3, OX-41 (Şekil 4) ve Iba1 9 gibi sıçan makrofaj-spesifik antikorların flowcytometry veya immünsitokimya tarafından değerlendirilir 95 ila% 99, izole hücreler polystylene boncuk aktif fagositoz (Şekil 5), rekombinant GM-CSF, LPS ile stimülasyon, ve çok çekirdekli dev hücreler 9 oluşumu üzerine inflamatuar / anti-inflamatuar sitokinlerin salgılanması proliferatif yanıt olarak makrofaj tipik özelliklerini gösterir.
Şekil 1 sıçan karaciğer hücrelerinin karışık primer kültür makrofaj benzeri hücreler seçici izolasyonu ve saflaştırılması için bir şema.
Şekil 2 sıçan karaciğer hücreleri ve makrofaj gibi hücrelerin çoğalması Primer kültür. Ok multinükleer dev hücreli gösterir. Ölçeği bar = 100 mikron. Elsevier izin İmmünolojik Yöntemleri Dergisi, Vol.360, 47-55 (2010) 9 yayımlanmaktadır.
Şekil 3 sallayarak ve ek yöntemi makrofaj benzeri hücreler seçici izolasyon. Hücreler, matara sallayarak kültür ortamı içine askıya Daha sonra doku kültürü olmayan dereceli plastik tabaklar aktarılır ve 37 ° C'de inkübe Kaplama gibi erken 10 dakika sonra, diğer bulaşıcı fibroblastik hücreler asılı kalırken, çanak yüzeye bağlı makrofaj benzeri hücreler. PBS ile iyice durulandıktan sonra, son derece saf bir makrofaj nüfus elde edildi. Bu hücreler kültür 40 dakika sonra tipik makrofaj morfolojisi kazanmıştır ve mitotik hücrelerin sık sık gözlenmiştir (oklar). Farklı kültür dönemlerde şişeler ele hücre sayıları daha sonra yapılan değişiklikler gösterilmiştir. Değerler üç beş şişeler ortalama ± SD. Deneyler, üç kez tekrarlandı ve veri farklı sembollerle gösterilir. Ölçeği bar = 100 mikron. Elsevier izin İmmünolojik Yöntemleri Dergisi, Vol.360, 47-55 (2010) 9 yayımlanmaktadır.
Şekil 4 sıçan makrofajlar karşı monoklonal antikorlar ile makrofaj benzeri hücreler İmmünositokimyasal boyama.
Şekil 5 makrofaj benzeri hücreler tarafından FITC etiketli mikro Fagositoz.
Discussion
Burada, yetişkin sıçan karaciğer hücrelerinin karışık primer kültürlerden gelen makrofajlar elde etmek için basit ve verimli bir yöntem raporu. Bizim sıçan karaciğer hücrelerinin karışık kültür yöntemi makrofajların roman proliferatif aktivite ilk güvenir ve daha sonra makrofajlar 9 olarak biyolojik özellikleri temelinde, bu hücrelerin sonraki izolasyonu ve saflaştırılması. Yetişkin karaciğer hücrelerinin karışık birincil kültür çoğaldı makrofajlar Kupffer veya parankimal hepatositler fraksiyonu kontamine ilişkili hücreler kaynaklanmış olabilir mümkün olabilir. Makrofajlar karışık birincil kültürlerde parankimal hepatosit 10 ve diğer fibroblastik hücreler dönüşüm neden olduğu çevresel değişikliklere yanıt olabilir .
Sonuç olarak, yöntemi, gelişmiş donanım ve teknik becerileri kullanarak, sıçan karaciğer cellswithout birincil kültürünün yeterli sayıda ve saflık makrofaj gibi hücreleri izolasyonu sağlar. Buna ek olarak, yalıtım işlemi en fazla iki hafta boyunca aynı kültür şişesi ile tekrar edilebilir. Bu yöntem, diğer memeli türleri için geçerli olabilir.
Disclosures
Tüm hayvanlar, hayvan deneyleri için Kurum Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve düzenlemelere göre, Hayvan Sağlığı Ulusal Enstitüsü hayvan tesis tutulur ve ameliyat edildi.
Acknowledgments
Bu çalışma, bir araştırma hibe ve Hibe Yardım, Japonya Tarım, Orman ve Balıkçılık Bakanlığı Gıda Nanoteknoloji Projesi tarafından finanse edildi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital solution | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl Injection | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | |
| Collagenase | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 032-10534 | Cell dissociation grade (Lot check needed) |
| Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T-9128 | |
| Eagle’s minimum essential medium (MEM) | Sigma-Aldrich | M-4655 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) | Sigma-Aldrich | D-6459 | High glucose-type |
| Fetal calf serum (FCS) | Hyclone | SH30070.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min. (Lot check needed) |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 14190 | Ca2+-Mg2+ free |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | Stock: 100 mM in distilled water |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-5500 | Stock: 10 mg/ml in 0.1N HCl |
| Penicillin/ streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | Mesh size: 100 μm |
| Tissue culture flask | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-21250 | Surface area: 75 cm2 |
| Non-tissue culture plastic dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Cell scraper | Corning | 3010 | |
| Reciprocal shaker | TAITEC | NR-1 |
References
- Crispe, I. N. The liver as a lymphoid organ. Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).
- Roberts, R. A. Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis. Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).
- Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. Liver: An organ with predominant innate immunity. Hepatology. 47, 729-736 (2008).
- Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation. J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).
- Olynyk, J. K., Clarke, S. L. Isolation and primary culture of rat Kupffer cells. J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).
- Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay. J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Yoshioka, M. Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells. Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).
- Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells. J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).
- Gorrell,
