Summary
우리는 세포 성숙을 유발하지 않고 플라스미드 DNA 나 siRNA 중과 기본 인간 단핵구 파생 돌기 세포를 transfecting의 효율적인 방법으로서 최적화된 높은 처리량 nucleofection 프로토콜을 제시한다. 우리는 더 타겟 유전자 mRNA와 단백질 수준 모두에서 릭 - 전의 성공적인 siRNA의 입을 대한 증거를 제공합니다.
Abstract
돌기 세포 (DCS)은 자사의 개시 및 감염 1 반응에서 중요한 역할을 면역 시스템의 센티넬 간주될 수 있습니다. 나이브 DC가에 의해 병원성 항원의 검색은 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPS)로 불리는 특정 보존 구조를 인식할 수있는 패턴 인식 수용체 (PRRs)를 통해이다. DC가로 PAMPs가 탐지 성숙 DC가 자신의 활성화 및 변화의 결과로 세포내 신호 폭포를 트리거합니다. 이 과정은 일반적으로 다른 전염증성 크린 시토킨와 함께 제 1 형 인터페론의 생산이 특징입니다, 이러한 T 세포와 상호 작용이 적응 면역 반응 2을 시작 배수 림프절에 성숙한 DC의 MHCII와 CD86 및 마이 그 레이션과 같은 세포 표면 마커의 upregulation, 3. 따라서 DC가 그 본래 및 적응 면역 시스템을 연결합니다.
각종 병원균에 DC 응답을 기본 분자 네트워크를 해부하다하는 능력은 이러한 신호 경로의 규제 및 유도 유전자를보다 잘 이해하는 데있어 매우 중요합니다. 또한 전염병 및 종양에 대한 DC - 기반 백신의 개발을 용이하게 도움이 될 것입니다. 그러나, 연구의이 라인은 심각하게 기본 DC가 4 transfecting의 어려움으로 장애가되었습니다.
같은 lentiviral 시스템으로 바이러스 전달 방식은, 일반적으로 사용하지만, 이러한 복잡 성과 바이오 유해 위험 (관련 비용) 5,6,7,8 많은 한계를 가지고있다. 또한, 바이러스성 유전자 제품의 배달 DC가 9,10,11,12을 transduced 사람의 immunogenicity을 증가시킵니다. Electroporation은 혼합 결과 13,14,15와 함께 사용하지만, 우리는 높은 처리량 transfection 프로토콜의 사용을보고하고 결론의 유틸리티를 입증하는 최초되었습니다.
이 보고서에서 우리는 제한된 세포 독성 및 DC 성숙 16 부재와 함께, 인간의 기본 DC가의 높은 처리량 transfection을 위해 최적화된 상용 프로토콜을 요약합니다. Transfection 효율 (GFP 플라스미드의)와 세포 생존 능력은 각각 50 % 이상 70 % 였어요. qRT - PCR은 IFNβ 전혀 upregulation을 증명하지 동안 외과 분석, transfected 세포의 성숙 마커 CD86와 MHCII 표현 증가의 부재를 설립하였습니다. 이 electroporation 프로토콜을 사용하여, 우리는 siRNA와 효과적인 타겟 유전자의 허물고와 DC가 성공적으로 transfection에 대한 증거를 제공하는 장비 - I, mRNA와 단백질 수준 모두에서 핵심적인 바이러스성 인식 수용체 16,17.
Protocol
1. 프로그램 Amaxa 96 잘 셔틀 Nucleofector
- 새 매개 변수 파일을 엽니다.
- 당신이 96 잘 플레이트 그림 위에 커서를 드래그하여 표준 transfection에 사용됩니다 웰스의 번호를 선택합니다. 각 실험 샘플에 대해 수영장 3 웰스의 최소 사용합니다.
- 입력 프로그램 코드 : part1 선택 'FF'와 파트에서 선택한 '168 '메뉴를 풀다운에서
- 솔루션 박스 선택 '단핵구, 인간'에서
- 제어 옵션에서 '표준'을 선택합니다.
- 적용을 클릭합니다.
- 노 transfection 컨트롤을 포함하려면 필요하고 제어 옵션에서 '없음 프로그램 제어'를 선택하지하고 적용을 클릭하면 다이어그램에서 더 이상 우물을 선택합니다.
- 플레이트 다이어그램에 남아있는 사용하지 않는 우물을 선택하고 Undefine을 클릭합니다.
2. transfection에 대한 DC가 준비
- 모든 작업은 가능한 세포 배양 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야합니다. 추가하여 nucleofection 솔루션을 준비 96 - 잘 450-2025의 비율에 인간 단핵구 96 잘 Nucleofector 솔루션을 보완. 믹스 룸 온도 따뜻한 수 있습니다. 당신은 당 잘 nucleofection 솔루션의 20μl가 필요합니다. 오류를 pipetting 수 있도록 10 %의 초과하십시오.
- 당신은 행 1과 2에 첫 번째를 삽입 올바른 방향 IE에서는 nucleocuvette 판에 필요한 nucleocuvette 모듈의 개수를 놓습니다.
- 실험을 위해 10 분 400g에 centrifuging에 의해 잘하고 펠렛 당 500,000 세포에 대한 계산에 필요한 DC가의 수를 결정합니다. 조심스럽게 뜨는을 제거합니다.
- 부드럽게 몇 번 아래 pipetting과로 nucleofection 솔루션에있는 세포를 Resuspend.
- 특정 치료 예 글로 하는걸 - I에 대한 분류 eppendorfs로 resuspended 세포의 올바른 볼륨을 나누십시오.
- pipetting하여 세포와 혼합 500,000 당 0.25μg siRNA를 추가합니다. 당신의 노 transfection 컨트롤 샘플이 아닌 타겟 siRNA를 사용합니다.
- 귀하의 실험 레이아웃에 따라 nucleocuvette 모듈로 위의 혼합물의 피펫 20μl는, 액체를 보장하는 것은 우물의 바닥에 배달됩니다.
- 뚜껑과 nucleocuvette 판을 차지하고 있으며 공기 거품의 제거를 보장하기 어려운 표면 몇번에 번호판을 누릅니다.
3. Transfect DC가
- Nucleofector 96 - 웰 셔틀 트레이에 접시를 넣고 업로드를 클릭한 다음 시작합니다.
- 무릎 톱 디스플레이에 transfection 과정의 진행률을 따라, 빨간색 배경에 검은 막대가 실패했습니다 의미 반면 녹색 배경에 검은 십자가, 그 우물에 성공적으로 transfection을 의미합니다.
- transfection 과정의 완료에 접시를 제거하고 잘 멀티채널 피펫을 사용하여 각 DC 성장 매체의 80μl를 추가합니다.
- 37 10 분 번호판을 품어 ° C와 5% CO 2.
- 올바른 방향을 유지, 미리 예열 DC 성장 매체의 100μl를 포함하는 행렬 튜브로 nucleocuvettes에서 100μl 볼륨을 전송합니다.
- transfection이 발생하지 않았 이러한 튜브를 제거하고 폐기.
- 37 품어 ° C와 5% 24 시간 또는 기타 원하는 시간 간격에 대한 CO 2.
4. NDV와 세포를 감염
- eppendorfs에 각 실험 샘플에 대한 인큐베이터에서 세포 배양 후드와 수영장 튜브에 매트릭스 튜브를 제거
- 펠렛 세포가 부드럽게 5 분 데스크 톱 원심 분리기의 회전에 의해하고하면 뜨는 제거합니다.
- 뫄 1에 NDV를 포함하는 혈청없는 성장 매체에있는 세포를 Resuspend 37에서 품어 ° C와 느슨하게 살균 방식으로 덮여 eppendorfs와 5% 45 분에 대한 CO 2.
- 80-10 H.위한 DC 성장 매체 900μl, 다시 품어 추가
5. 수확 세포
- 데스크 톱 원심 분리기에 eppendorfs 잔을 돌리면서 뜨는 제거하여 세포 펠렛.
- 귀하의 프로토콜에 따라 RNA 또는 단백질 추출을위한 수확 세포.
6. 대표 결과 :
우리 최적화된 프로토콜을 사용하는 우리와 DC가를 transfected RIGI 타겟팅 인터페론 반응 경로를 자극하는 NDV (릭 - I에 의해 감지 paramyxovirus)으로 세포를 감염 후 24 H에 대한 siRNA를합니다. qRT - PCR 분석에 의해 우리는 전사 수준에서 75 % 유전자의 다운 노크 보여주었다. 우리는 또한 IFN 신호 계단식 찾으 - I의 스트림 이펙터입니다 IFNβ의 표현에서 유사한 감소를 관찰했다. 또한, 우리는 MxA, IFNβ 하류 응답 유전자의 그 (그림 1A)을 최소화하는 동안 비 감염 제어 transfected 세포에서 IFNβ의 표현이 감지되지 않았음을 관찰했다.
와 DC가의 두 번째 transfection RIGI 타겟 siRNA 것은 서양 얼룩 분석을 포함하는 충분한 세포를 사용하여 수행되었습니다. 어디RT - PCR 결과와 유사했다 우리가 (62 % 및 66% 장비 - I와 IFNβ 표현은 각각의 허물고) 이전에 본 것은 (그림 1B), 서양 얼룩이 유전자의 표현이되어 있다고 발표 전 - 릭에 대한 탐지 완전히 (그림 1C) 차단.
그림 1. (A) MoDCs이 중 siRNA 타겟팅 transfected되었습니다 장비를 - I 또는 qRT - PCR에 의해 결정 릭 - I, IFNβ과 MxA의 표현에 특이 현상이 글로의 siRNA 및 효과. (-) transfection 프로토콜은 단핵구 특정 버퍼와 nucleoporation 프로그램 FF168 (Lonza 워커스빌 주) 24 H에 대해 다음과 부화를 사용, transfected 세포는 어느 NDV (+) 또는 왼쪽으로 감염되지 않은 감염되었습니다. 10 H에 대한 자세한 부화 후, 세포는 수확 및 RNA 추출 성적 수준은 두 복제 실험의 결과를 대표했다. 보울스 외 16 일부터 촬영. (B) 그림 1A에 사용되는 같은 다른 버피의 코트에서 얻은 MoDCs 다시와 transfected되었습니다 중 릭 - I - 타겟 siRNA 또는 위와 같은 transfection 프로토콜을 사용하여 특이 현상이 글로의 siRNA합니다. untransfected MoDCs를 사용하여 추가적인 제어 실험에 통합되었습니다. 모든 세포가 NDV 감염과 RNA 및 단백질 추출 모두 수확되기 전에 추가로 10 H에 대한 incubated 있었다 24 H 보육에 따라. 장비 - I, IFNβ 및 qRT - PCR에 의해 결정으로 MxA의 성적 수준은 두 복제 실험의 결과를 나타냅니다. 보울스 외 16 일부터 촬영. (C) 위의 그림 1B에 설명되어있는 세포에서 Lysates는 서양 얼룩에 의해 분석되었다. 레인스 1과 2는 untransfected 세포에서 lysates, 차선 3과 4는 글로의 siRNA transfected 세포에서 lysates, 차선 5 6 장비 - I - 타겟 siRNA와 transfected 세포에서 lysates. 샘플은 장비 - I에 대한 탐지 또한 GAPDH (로딩 제어 등)과 중복에서 실행 하였다. 보울스 외 16 일부터 촬영.
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Discussion
나이브 기본 돌기 세포의 transfection 효율이 높은 처리량 분석 및 본래 - 적응 면역 전환을 중재이 핵심 세포 세포 염증 경로의 리버스 엔지니어링을 위해 중요합니다. 그러나, 대부분의 조사는 이러한 세포가 표준 transfection 기술을 사용하는 경우 모두 효율적으로 transfection 절차 유도 세포 성숙하지 않고 transfect하기 어려운다는 것을 찾을 수 있습니다. 우리는 이러한 제한이 동시에 독립 96 - 웰 상업용 핵 transfection 시스템 (Lonza)를 사용하여 높은 처리량 프로토콜 최적화에 의해 극복할 수 있는지 여부를 조사 하였다.
형광 활성 세포 분류 (외과)를 사용하여, 우리는 GFP - 표현 세포 성숙의 판독으로 transfection 효율과 CD86 및 MHCII immunoreactivity위한 표식으로 플라스미드를 측정했습니다. 궁극적으로> 50 %의 transfection과 성숙 마커 증가의 부재를 보여주는 조건을 확인하고 버퍼 electroporation 프로그램을 평가하는 일련의 실험.
더욱 nucleofection 과정에서 DC가 가능한 활성화를 조사하기 위해 우리는 mRNA 수준에서 IFNβ 표현 수준과 스트림 응답 유전자 MxA을 분석했다. MxA 식은 IFNβ 생산에 묘할 정도로 민감하고 매우 낮은 수준을 감지하는 bioassay로 사용할 수 cytokine18. qRT - PCR 분석을 통해 우리는 전혀 감지 IFNβ 표현을 본 적이 있지만 MxA식으로 위에서 기본 IFNβ 유도를 나타내는 일부 upregulation 봤어. 그러나 비 감염 제어 transfected 세포에 MxA이 최소한의 upregulation은 IFNβ 신호 폭포 (그림 1A)의 바이러스 중재 자극으로 인해에 비해 무시할 수 있었고 우리가 성공적으로 활성화하지 않고 DC가를 transfect 위해 nucleoporation 프로토콜을 사용할 수 있음을 확인 그들이 어떤 상당한 수준.
우리 최적화된 프로토콜의 유틸리티는 서양 얼룩 분석에 의해 확인되었다. 대상 장비 - 난 감지 장비 - I 단백질 (그림 1C)의 전체 손실을 일으켰습니다.을 siRNA와 DC가의 Transfection 우리는 다른 유전자의 성공적인 섭동위한 siRNA의 금액은 사용 transfection 시간의 길이가 최적화해야 할 수 있습니다 것입니다.
우리의 지식,이 작품은 따라서이 분야의 연구에 어려운 장애를 해결, 처음 기본 인간의 DC가 높은 처리량 손실의 기능 연구의 디자인을 허용합니다. 이것은 DC 신호 연구를위한 새로운 기회를 제공해야하며 DC 기반 immunotherapies을 개발 발전에 기여할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 NIH NIAID 계약 번호 HHSN2662000500021C에 의해 지원되었다. 우리는 그의 기술 지원 밍 첸 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza Inc. | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza Inc. | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
- Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
- Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
- Aicher, Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
- Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
- Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
- Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
- Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
- Roth, Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
- Tendeloo, V. F. V. an Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
- Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
- Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
- Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
- Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
- Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).
