Summary
A açıklanmıştır sivrisinek hemocytes toplamak ve leke henüz doğru yöntem basitleştirilmiş. Bizim metodumuz Aedes sivrisinek hemocytes temiz hazırlıkları izole etmek için yüksek enjeksiyon teknikleri doğruluk ile perfüzyon sadeliği birleştirir. Bu yöntem çalışmaları gerektiren türleri hemocytes bilgi ve bolluk kolaylaştırır.
Abstract
Sivrisinekler, sarı humma virüsü, sıtma parazitleri ve filarial solucanları gibi hastalığa neden olan patojenleri bir dizi için vektörler. Laboratuvarlar gibi patojenlerin 1, 2 dirençli transgenik sivrisinek üreten umuduyla hastalık vektör türlerinde doğuştan gelen bağışıklık sisteminin anti-patojen bileşenleri araştırıyoruz. Sivrisinek doğuştan gelen bağışıklık sisteminin savunma 3 birkaç satır oluşur . Epiteli-astarlı sivrisinek midgut 4 dayattığı bariyer kaçmayı patojenlerin hemolimf girin ve dolaşan hemocytes kapsülleyen önemli hücresel bileşenleri ve içine patojenlerin 5, 6 karşılaşma. Araştırmacılar, sivrisinekler hematopoetik dokular için kanıt değildir ve mevcut delil hemocytes sayısı yetişkin ortaya çıkması sabittir ve numaraları aslında sivrisinek yaşları 7 olarak azalabilir göstermektedir. Düzgün bir şekilde toplamak ve tıbben önemli böceklerden hemocytes tespit yeteneği hücresel bağışıklık çalışmaları için önemli bir adımdır. Ancak, sivrisinek, küçük boyutu ve sınırlı hemolimf hacmi bağışıklık hücreleri toplamak için bir meydan okuma oluşturmaktadır.
Sivrisinek hemocytes toplamak için iki yerleşik yöntemlerin bir kesim burnumun 8 hemolimf sürülmesi ve ses hacmi (perfüzyon), tuzlu su, baş ve göğüs (yani, serviks) ve perfüze hemolimf toplanan arasında membranöz necklike bölgeye enjekte edilir karın 9, 10 distal bölgede yırtık bir açılış. Bu teknikler, ancak hemocytes düşük kurtarma ve sırasıyla 11 yağlı vücut hücreleri ile mümkün kirlenme ile sınırlıdır. Kirlenmesine neden olan ölçekler ve iç dokularda 11 seviyelerini azaltırken Daha yakın zamanlarda bir yöntem antikoagülan tamponlarının kullanımı ile immunocytes yüksek enjeksiyon / kurtarma, gelişmiş kurtarma olarak anılacaktır . Bu yöntem geliştirilmiş bir yöntem için birincil kültür hemocytes toplama ve bakımı sağlar, ancak enjeksiyon ve mansap hedefi teşhis için hemocytes, toplamak, düzeltmek ve leke ise gerekli değildir toplama adımları bir dizi gerektirir. Burada, Aedes sivrisinek hemocytes temiz hazırlıkları izole etmek için yüksek enjeksiyon tekniklerinin doğruluğu, salin solüsyonu yerine antikoagülan tamponlar kullanarak perfüzyon kolaylık getiren sivrisinek hemolimf toplama yöntem göstermektedir.
Protocol
1. Hemocyte toplama önceden hazırlanması
- (Antikoagülan; 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 41 mM sitrik asit, pH 4,5)% 60 Schneider Orta,% 10 fetal sığır serumu (FBS), ve% 30 sitrat tampon oluşan bir hemolimf seyreltici çözüm hazırlayın 11. -20 ° C'de saklanabilir 1.0 mL alikotları yapın (Malzeme) her bir kısım sadece bir kez kullanın.
- Cam gravür aracını kullanarak bir ucunda 1 cm çapında bir daire puanlama cam mikroskop slayt (75 x 25 x 1 mm) hazırlayın. Alternatif olarak, iki ön kazınmış çevreleri ile mikroskop lamı (örneğin Fisher Scientific veya EMS kaynakları) satın alınabilir. Sivrisinek başına bir cam slayt ihtiyaç duyulacaktır.
- (Malzeme) cam iğneler bir dizi hazırlayın aşağıda önerilen ayarları (Sutter Instruments, Model P-87) göre çekilir:
Isı Rampa 5 Çekme: 45 Vel: 75 Time: 175 Basınç 580
Bu çektirmenin önerilen ayarları kullanarak, sap uzunlukları yaklaşık 3 mm toplam uzunluğu 500 mm çapında iğne inşa. Önceden çekilmiş iğneler de (örneğin TriTech Araştırma) satın alınabilir.
2. Hemocyte toplama önceden mikroenjektör hazırlanması
- Üreticinin talimatlarına göre mikroenjektör iğne tutucu çekti içine bir iğne takın. Dolgu mikroenjektör (Malzeme) boru, şırınga ve üreticinin talimatlarına göre mineral yağ ile cam iğne çekti.
3. Dişi sivrisineklerin hemocyte toplama önceden hazırlanması
- Buz ile temas halinde küçük katı kafesi kaplar içine 15 yetişkin kadın aspire. Yeterince derin buz sivrisinek daldırın kafes kafes ve tüm tarafların bu tüm yükseklik böylece buz ile temas halinde. Bu sivrisinek, soğuğa maruz olacağını garanti eder.
Yaklaşık 8 dakika kadar veya Soğuk anestezisi sivrisinek artık hareketli. - Bir sivrisinek bir depresyon slayt üzerine yerleştirin. Bu slayt enjeksiyonlar için site olarak hizmet verecek.
4. Hemocyte toplama
- Mikroenjektör çekti cam iğne içine hemolimf seyreltici 12 ul sürebilir ve çözüm yedinci ve sekizinci karın segmentleri arasındaki sivrisinek içine enjekte etmek için ayarlayın. Yaklaşık 3 sivrisinek kadar alınan toplam 12 ul hacmi 3-3.5 ul enjekte edilebilir. Enjeksiyon yapılır sivrisinek forseps ile yavaşça yerinde tutulan olmalıdır. Küçük hacimli bir seyreltici mineral yağ enjekte ediliyor önlemek amacıyla iğnenin ucunda kalmalıdır. Enjeksiyondan sonra karın "dolu" ya da şişirilmiş bakmak gerekir.
- Ayrı bir temiz bir kaba koyun, 5 dakika boyunca kurtarma buz sivrisinek enjekte. Sivrisinek içindeki antikoagülan seyreltici çözüm inkübasyon iç dokuya yapışmış hemocytes yerinden yardımcı olacaktır. Ortalama 3 ila 5 taze sivrisinekler, her 5 dakikada bir iyileşme döneminde enjekte edilebilir.
- 5 dakika sonra kurtarma, bacaklarını snip, kanatlar ve mikro makaslar kullanılarak bir anda her sivrisinek birinin karın (sekizinci segment) ucu. Bu buz üzerinde yerleştirilen kurtarma fincan yapılmalıdır. Bacaklarını ve kanatlarını keserek koleksiyon slaytlar aktarılıyor ölçeklerin olasılığını azaltır. Not: bacakları kesilmiş ve kanatları çok torasik eklenti sitelerini yakın ya da kaçmaya hemolimf diğer açıklıklar yaratma riski yoktur. Hemolimf sadece karnın ucunda oluşturulan açılması yoluyla toplanan olmalıdır.
- % 70 Etanol bir cam kazınmış mikroskop lamı kimwipe ile yıkayın ve kurulayın. Pozisyon kazınmış dairenin dış kenarından slayt sivrisinek enjekte ve iyileşti. Mikroenjektör taze hemolimf seyreltici 12 ul almak ve bu birimde, mesothorax lateral tarafında sivrisinek içine enjekte etmek için ayarlayın. Mineral yağ enjekte ediliyor önleyecek şekilde seyreltici değil tüm hacmi (10 ul yaklaşık 8) en sunun ama. Seyreltici bir iğnenin ucunda küçük hacimli kalmalıdır.
- Kesme karın açılış kenarında 1 cm daire sivrisinek böylece yerleştirin. Enjeksiyondan sonra işaretli alana seyreltilmiş hemolimf içinde alınmalıdır. Iğne, mesothoracic enjeksiyon yerinden kaldırıldıktan sonra, forseps iki kolu arasındaki sivrisinek tutan devam kazınmış daire alan üzerine hemolimf doğrudan bu forseps ile karın hafifçe sıkın.
- Seyreltilmiş hemolimf, yaklaşık 10 dakika veya kadar gözle görülür bir şekilde kuru slayt üzerinde kurumasına izin verin.
5. Hemocyte fiksasyon ve boyama
- Dip s: HEMA3 7 (Malzeme) ile ayrı ayrı slayt Lekemakrolid fiksatif 5 kez her defasında 1 saniye için, her 1 saniye için ve, nihayet, çözüm II daldırma slayt 3 kez, ben her 1 saniye için 3 kez çözüm Dipslide. DI su ile slayt arka durulayın. Slayt ön durulanır olmamalıdır. Kazınmış çemberin dışında boyanan doku içeren slayt ön Blot kurulayın.
- Kazınmış merkezi etrafında montaj orta (örneğin Shur / Mount veya Polymount) uygulayın ve bunun üzerine bir kapak kayma yerleştirin. Kapak kayma (25 x 25 mm) üzerine hafifçe bastırın kapak kayma (boyanan doku içeren kazınmış daire dahil) kapsamındaki tüm alanı montaj orta yayılır. Slaytlar en az 3 saat veya gece boyunca kurumaya bırakın. Hemocytes optimum görüntüleme ve görüntüleme için toplama takiben 2 hafta içinde görülmelidir.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1A-C sabit ve HEMA3 lekeli hemocytes Aedes aegypti yetişkin dişi toplanan örnekler gösterilmiştir. Şekil 1A, sitoplazma oranı (550x büyütme) 11 nükleer küçük boyutu, küresel sfero şekil ve yüksek dayalı bir prohemocyte olarak tanımlanan bir hemocyte gösterir . Şekil 1B nükleer oranı (550x büyütme), sfero şekil ve yüksek sitoplazma dayalı bir oenocytoid olarak sınıflandırılan bir hemocyte gösterir. Son olarak, Şekil 1C bir granülosit-tipi hemocyte (550x büyütme) gösterir. Granülositler doğada daha taneli ve cam yüzeylere bağlı olarak, şekil ve davranış daha amoeboid eğilimindedir. Hemocyte yazarak ve kurtarma 11 için daha önce yayımlanmış kriterler kullanarak, toplama yöntemi toplam hemocytes benzer bir numara verdi, ve biz de aynı şekilde granülositler, toplam hemocytes en büyük yüzde 11 (Şekil 2) makyaj bulundu .
Şekil 1 HEMA3 sabit bir temsilcisi, lekeli prohemocyte Işık mikroskop görüntüleri (A), oenocytoid (B) ve bir Ae granülosit (C). aegypti yetişkin kadın. C = sitoplazma, N = nükleus G = granüller.
Şekil 2 Toplam sayıları ± dişi sivrisineğin başına hemolimf seyreltme ve toplama yöntemi ile elde edilen tüm hemocytes ve granülositler GD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan hemocyte toplama yöntemi değiştirilmiş ve daha önce yayınlanmış yöntemlerden biri daha az adımlarla Aedes sivrisinek hemocytes temiz hazırlıkları izole etmek için izin verir . Bizim özel ilgi hemocyte Aedes sivrisinek popülasyonları karakterize yatıyor, biz doğru enjeksiyon hacimlerini belirlemek için ilk denemeler yapıldıktan sonra bu tekniğin diğer sivrisinek gruplarına uygulanabilir inanıyoruz. Bizim protokol salin solüsyonu yerine antikoagülan tamponlar kullanır ve in vivo rakamlar doğru yansıtan hemocytes bir nüfus ortaya çıkarır . Ancak, henüz izole kültür hemocytes korumak için bizim protokol uygunluğu tespit değil.
Dolaşan hemocytes az sayıda bir kesim probosis üzerinden hemolimf Koleksiyon verim gösterilmiştir ve burada daha fazla gündeme alınmayacak. Perfüzyon tabanlı yöntemler, yapmak kolay iken, daha yüksek düzeyde bir iç doku ve ölçekler 11 kontaminasyon izin verdiği için eleştirdi edilmiştir. Son zamanlarda, yüksek enjeksiyon / geri kazanım yöntemleri kirlenmektedir 11 seviyelerini azaltırken, hemocytes kurtarma artırmak için geliştirilmiş, ancak enjeksiyon ve toplama adımları bir dizi gerektirir. Bizim protokol kurtarıldı hemocytes ve azaltılmış kirlilikleri aynı düzeyde elde ediyoruz, ancak daha az sayıda enjeksiyon ve toplama adımları, böylece hemocytes temiz hazırlıkları elde etmek için basit fakat doğru bir yöntem sunuyor. Birincisi, bizim protokolde kaldırarak bacaklar, kanatlar ve hemolimf hemocytes daha temiz hazırlıklarında sonuçlar toplanan olduğu ayrı bir kapta karın ucu basit adım. İkincisi, pozitif deplasmanlı mikroenjektör bağlı bir iğne tutucu düzenlenen cam iğneler kullanılarak yöntemi kazançlar doğruluğu. Seyreltici aynı şekilde elle tutulan iğneler kullanılarak enjekte veya diğer elle tutulan teslim cihazlar, bir mikroenjektör kullanımı da toplanan hemolimf tutarlı hacmi, teslimat hacmi ve daha sonra sonuçları doğruluğunu artar. Bizim çalışmalarda böylece hemocyte popülasyonları niceleme tutarlılık başka bir ölçü sağlayan, 9,5 10,5 ul (adım 4.1 ve 4.4) bize sürekli enjekte dişi sivrisineklerin (yayınlanmamış veri) hemolimf 9-10 ul toplamak için izin kombine enjeksiyon hacimleri göstermektedir. Bizim yöntemi, diğer elle tutulan enjeksiyon iğneleri ve / veya seyreltilmiş hemolimf toplamak için kılcal cam tüpler için ihtiyacını ortadan kaldırarak genel toplama kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
John Frey ve Ben Peterson Yazarlar sivrisinek yetiştirme için teşekkür etmek istiyorum. Biz de hemocyte mikrograflar yardım için teşekkür ederim. Christine Davis ve Gary Radice Bu araştırma, Richmond Sanat ve Bilim yaz bursu AA Qayum ve fakülte hibe A. Telang Üniversitesi tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher Scientific | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research, Inc. | MINJ-4 |
References
- Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
- Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).
- Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors. Insect Sci. 15, 15-15 (2008).
- Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).
- Bartholomay, L. C. Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-1 (2008).
- Hillyer, J. F. Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers. Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).
- Chen, C. C., Laurence, B. R. In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction. International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).
- Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae. Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity. Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).
