Summary
樹状細胞の取り込み抗原およびT細胞に処理された抗原を提示する免疫器官に向かって移動する。 Qdot ®二ナノラベルは、長期的かつ安定的な蛍光シグナルを提供します。これは、蛍光顕微鏡により異なる臓器に樹状細胞を追跡できます。
Abstract
樹状細胞（DC）は末梢組織で、そのような胸腺、骨髄、脾臓、リンパ節やパイエル板1から3のような免疫臓器で発見プロフェッショナル抗原提示細胞（APC）です。樹状細胞は末梢組織のサンプルでは、占有プロセスと主要組織適合性分子（MHC）のコンテキストでそれらの表面に存在する抗原の存在、のための生物を紹介。その後、抗原負荷したDCは、彼らが特定の免疫応答をトリガTリンパ球に処理された抗原を提示する免疫器官に移行する。樹状細胞の遊走機能を評価する一つの方法は、蛍光色素4で、それらにラベルを付けることです。
同封我々はマウス骨髄由来DCにラベルを付けるためにQdot ®二蛍光ナノクリスタルの使用方法を示しています。この標識の利点は、Qdot ®二ナノ結晶が回復した組織で標識された細胞を検出するのに最適です安定して長期的な蛍光を有していることです。これを達成するために、最初の細胞はDCの分化を誘導するために、マウスの骨の髄から回収し、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の存在下で8日間培養されます。これらの細胞は、in vitroでのインキュベーションにおける短期で蛍光Qdotsで標識されます。染色した細胞を蛍光顕微鏡で視覚化することができます。細胞はこの時点では実験動物に注入することができますまたは炎症性刺激を用いたin vitroインキュベーションの際の成熟した細胞にすることができます。私たちの手では、DCの成熟は、蛍光シグナルの損失を決定していないもQdot ®二の染色は、樹状細胞の生物学的特性に影響を与えます。注入時には、これらの細胞は、典型的な解剖と固定の手順に従って蛍光顕微鏡による免疫器官で識別することができます。
Protocol
1。マウスの大腿骨と脛骨と骨髄細胞の培養の解剖
- CO 2窒息により2匹を犠牲にし、慎重に骨の両端を切断することなく、脛骨と大腿骨を細かく分析。
- ティッシュペーパーを使用して接続されているすべての組織から骨をきれいに。骨を壊さないように注意してください。
- 35ミリメートルのシャーレに10分間70％エタノールに浸漬することによって骨を滅菌する。この瞬間から、細胞培養の汚染を避けるために、バイオセーフティフードの内部で動作する。
- エタノールからの骨を回復し、生物学的安全キャビネット内のシャーレの中で5分間、その空気が乾燥してみましょう。
- 最薄先端が半分に大腿骨、及び脛骨をカット。 RPMI培地（無血清、抗生物質を含む）を1mlの滅菌シャーレに無菌注射器を使用して骨の内側を吹き込む。
- 細胞懸濁液を回収し、スイング型バケットローター付き冷却遠心（4℃）の1,100 rpmで15 mlの遠心チューブ中で10分間の遠心によりRPMI培地で2倍洗浄する。
- 最後の洗浄の後、ACK溶解緩衝液2mlに細胞を再懸濁し、赤血球を除去するために、室温で5分間インキュベートする。
- 10％FBSを含むRPMIの13 mlを追加し、再懸濁し、として1.6に説明したのと同じ設定を使用して、この培地で2X洗浄。
- 2に調整し、細胞をカウントするRPMI、10％FBS、およびrm - GM - CSF（20 ng / mlの最終濃度）5を追加すると× 10 5細胞/ ml。
- CO 2インキュベーター（37℃、5％CO 2）の滅菌、微生物学的品質、10cmペトリ皿、そして文化にこの懸濁液10mlを追加。
- 三日後に、準備したプレートの各々にrmGM - CSFの20 ng / Lで含むRPMI、10％FBSの別の10 mlを加える。
- 三日後に細胞懸濁液10mlを、各ペトリ皿から回収1.6のように遠心分離、rmGM - CSFとのRPMI、10％FBSの同じボリュームに再懸濁し、シャーレに返されます。細胞はCO 2インキュベーター内でさらに2日間培養されています。
2。コレクションと樹状細胞のラベリング
- 培養中の8日後にゆるく付着細胞を新鮮な培地とシャーレを洗浄することによって回収されます。このプロトコルは、私たちの手に、2〜4 × 10 8樹状細胞の周囲にレンダリングされます。細胞はフローサイトメトリーによってDCの表現型を分析することができます。
- 回収した細胞を、製造元の指示に従って厳密にQtracker 655細胞標識キットで標識されています。
- 我々は、10 nMの濃度でQdotsでマウス骨髄由来の樹状細胞を標識する優秀な結果を得た。これを達成するために、AとBキットのコンポーネントをラベル付けQtrackerの細胞のアリコートは、等量で混合、室温で5分間インキュベートし、直ちに30秒間ボルテックスで新鮮な培地で1 / 100に希釈されています
- 5 × 10 6のDCを染色するために、エッペンドルフチューブと室温で5分間インキュベートするには各キットの構成要素とBの5μlを混合する。その後、1 RPMI、10％FBSインキュベートmlの、30秒間ボルテックスを追加。
- 5 × 10 6のDCを含む細胞懸濁液0.5 mlを加え、そして37℃で60分間。
- その後、RPMI、10％FBS（1,100 RPM）の2倍の細胞を洗う。細胞は、実験用マウスに注射するため、さらにカルチャまたはPBSでRPMIで再懸することができます。
3。ラベルの付いたDCの評価
- 細胞標識は、蛍光顕微鏡を用いて評価することができます。これを達成するために、細胞懸濁液の滴が（ 図3、顕微鏡のスライドに追加ガラスカバーで覆われ、そして蛍光顕微鏡は、それぞれこれらのQdotsが565nmと405 - 525nmの発光スペクトルおよび励起スペクトルを持っていることを考慮すると評価される）
- この時点で、標識された細胞は、動物を注入することができます、または成熟は48時間、これらの細胞をインキュベートすることによって誘導することができる（37℃、5 CO 2）LPS（100 ng / ml）およびTNF -（の存在下で20 ng / ml）を。蛍光標識は、DCの成熟（ 図4）の影響を受けません。
4。代表的な結果：
同封我々はマウス骨髄由来樹状細胞とその蛍光Qdotsとラベル付けを準備する方法について説明図。 1は、図一方、セルを取得する手順をまとめたものです。 2 Qdotsでそれらにラベルを付ける手順を示しています。 図に示す。 3、ほとんどすべての細胞は、この手順によってラベル付けされており、これは炎症性因子によるDCの成熟（ 図4）の影響を受けません。炎症カクテルで処理するとQdot ®二重染色のDC（Fig.5a）は 、非染色細胞に似て振舞うことを図5に示す。両方の細胞調製物は、同様に共刺激分子の発現（ 図5b）をアップレギュレート、および成熟の刺激によりIL - 6（ 図5C）と一酸化窒素（ 図5D）の同じような量を生成。これはpreviに同意Qdot ®二染色、免疫応答[6]を引き出すことができる成熟した細胞に有効にするDCの能力に影響しないことを示すOUが公開されたデータ。これらの細胞を実験動物に注入するために使用することができます。 図に示す。 6は 、2日間マウスに標識した樹状細胞の静脈内注射した後、我々は脾臓にQdot ®二染色細胞を検出することができた。これは、 生体内でも、DCの移行を評価するためにQdot ®二ナノ結晶の使用を示す以前公開されているデータと一致している[6]非侵襲的イメージングおよびフローサイトメトリーによる。
骨髄からDCの発生の 図1。 フローチャート 。同封我々は骨髄由来のDCを取得するためにその過程を描く。脛骨と大腿骨の両方に解剖し、周囲の組織からきれいにされています。骨のヒントは保持され、骨の内部は、培地にフラッシュされます。赤血球を除去した後、骨髄細胞は、樹状細胞にそれらを区別するためにGM - CSFの存在下で8日間培養する。
ラベリング手順の 図2。 フローチャート 。 Qtrackerの細胞標識キットのコンポーネントの等しいアリコートAおよびBは、エッペンドルフチューブ内で混合される。樹状細胞はGM - CSFの8日間の骨髄培養物から採取し、37℃で60分間ラベリング色素と混合されています。その後、細胞は過剰の標識粒子を除去するために媒体中で洗浄されています。
図3。 直ちに標識後の樹状細胞の蛍光顕微鏡写真 。標識された細胞の滴をガラススライド上に堆積し、カバースリップでカバーされた。その後、サンプルはMicropublisher 5.0デジタルCCDカラーカメラ（Qimaging、サリー、BC、カナダ）を介して取得された蛍光顕微鏡と画像で評価した。
図4 in vitroで48時間の熟成後に樹状細胞の蛍光顕微鏡写真 。標識されたDCは、LPS（100 ng / ml）およびCO 2インキュベーター（37℃、5％CO 2）でスライドガラス上にTNF -α（20 ng / ml）の持つ48時間培養した。その後、サンプルは、PBS（5分、2X）で洗浄し、アセトン（15分、4℃）で固定し、DAPIで対比染色した。細胞は、上記のように蛍光顕微鏡で評価した。
図5。Qdot ®二ステンド成熟DCの生物活性 。上記のようにin vitroで成熟というラベルの樹状細胞は、フローサイトメトリー（）と（B）により分析した。 （）Qdot ®二染色細胞は、FL3（PercP）チャンネルで強いシグナルを与える。影付きのヒストグラム：未染色のコントロール。とアイソタイプコントロール、（B）Qdot ®二重染色し、染色の樹状細胞は、さらに成熟マーカーCD86とCD40に対する特異的抗体で染色した。次に、細胞をFACSortのフローサイトメーター（ベクトンディッキンソン、サンノゼ、カリフォルニア州）で分析した。さらに、IL - 6（C）と窒素酸化物は（NO）成熟したQdot ®二重染色DCおよびコントロールの上清で測定した。 IL - 6と一酸化窒素のレベルをELISA分析と我々は、以前は7に記載したようにグリースアッセイ、8により測定した。この図に示した全てのデータは、同様の結果を示す二、三の独立した実験の代表である。データは、GraphPadソフトウェアを使用してANOVAによって分析した。
図6。 切除組織における標識した樹状細胞の検出 。ラベル付け成熟DC（1 × 10 6細胞）を静脈内C57BL / 6マウスに注入した。 （）二日後マウスを屠殺し、脾臓を採取し、凍結OCTに埋め込まれており、クライオスタットを用いて調製8μMのセクションスナップ。その後、試料をアセトン（15分、4℃）で固定し、DAPIで対比染色した。細胞は、上記のように蛍光顕微鏡で評価した図6A：。40X倍率、 図6B：100X倍率、 図が。 6C、400Xの倍率。
Discussion
T細胞相互作用またはDCの開発、および様々な疾患9-11にその役割を決定する：DCを調査、マウス骨髄性）DCが広く、DCベースのワクチンの有効性と改善を決定するために使用されている。同封我々は、脛骨と大腿骨の骨の髄から回収した前駆体からのDCを生成する方法を示します。そこで我々は、汚染の確率を減らすこと、私たちは70％エタノールに浸して、それらを殺菌することができるように、先端を切断することなく骨を回復する。骨髄細胞からDCを区別するために我々は、唯一、前述の5とGM - CSFを使用してください。一部のプロトコルはまた、IL - 4を使用していますが、それはGM - CSF 12の高レベルで作業する場合には、このサイトカインは必要ではないことが報告されている。実際、我々は以前にこれらのDCは免疫応答13を誘導することができることを実証した。また、介護が接続されている細胞はより多くの単球様表現型を示すので、培地とシャーレを洗浄することにより、8日間の培養物からだけ緩く接着細胞を回収するために取られる必要があります。ここでは、蛍光Qdot ®二粒子と樹状細胞のラベリングを示しています。この標識は、いくつかの利点が他のメソッドへの敬意を持っています。最初に、Qdots粒子は容易に細胞内に取り込まれている。第二に、蛍光シグナルは非常に高く、DCの成熟によって変更されません。第三に、蛍光は、細胞または組織をアセトンなどの溶剤で固定した場合のGFPが染色プロトコールを選択する時点でより多くの柔軟性を与え、DCが14をタグ付けするために使用されている場合にどうなるかに反して失われることはありません。最後に、これらの粒子によって与えられる高い蛍光シグナルは、組織自家蛍光にもかかわらず、細胞の可視化が可能になります。以前に6を説明されているように、Qdot ®二の染色は、これらの細胞の成熟の機能に影響を与えなかった。同封我々は、Qdot ®二重染色DCは共刺激分子をアップレギュレートし、炎症性刺激に応答してIL - 6と一酸化窒素の産生、非染色された樹状細胞と同様の方法で動作することを示している。 DCが免疫応答の引き金に特化した細胞であるが、これらは、癌やアテローム性動脈硬化症4、15、16などの病的状態に関与することが示されている。彼らはまた、さらに構造的に新しい血管19、20の開発に参加するよう提案、18、血管新生のプロセス17に参加することを主張されている。したがって、DCはin vivoで追跡し、異なる組織4で、その地理的な局在を決定するために可能にする方法、21、22は非常に貴重なものです。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、グラントR15 CA137499 - 01（FB）とオハイオ大学（FB）からスタートアップ資金でNIHによって部分的にサポート。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | Females, 6-8 weeks old | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-119 | |
| Fetal bovine serum, qualified | Invitrogen | 10437-028 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-096 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-049 | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Recombinant murine GM-CSF | PeproTech Inc | 315-03 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Invitrogen | Q25021MP | |
| Lipopolysaccharide | Invitrogen | tlrl-eblps | |
| Recombinant murine TNF alpha | PeproTech Inc | 315-01A | |
| CD86 antibody | BD Biosciences | 553691 | |
| CD40 antibody | BD Biosciences | 553791 | |
| Griess reagent system | Promega Corp. | G2930 | |
| IL-6 capture antibody | eBioscience | 13-7061-81 | |
| IL-6 detection antibody | eBioscience | 13-7062-81 |
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