Summary
Een methode wordt beschreven voor de bereiding van de enkel levend fotoreceptorcellen van verschillende gewervelde soorten voor fluorescentie beeldvorming. De methode kan worden gebruikt om het imago van de fluorescentie van endogene fluoroforen, zoals NADH of vitamine A, of die van exogeen toegevoegde fluorescerende kleurstoffen gevoelig voor Ca
Abstract
In de gewervelde netvlies, is fototransductie, de omzetting van licht naar een elektrisch signaal, uitgevoerd door de staafjes en kegeltjes lichtgevoelige cellen 1-4. Rod fotoreceptoren zijn verantwoordelijk voor het zicht bij weinig licht, kegels in fel licht. Fototransductie vindt plaats in de buitenste segment van de fotoreceptorcel, een gespecialiseerd vak dat een hoge concentratie van visuele pigment, de primaire lichtdetector bevat. De visuele pigment bestaat uit een chromofoor, 11 - cis netvlies, bevestigd aan een eiwit, opsin. Een foton geabsorbeerd door het visuele pigment isomerizes de chromofoor van 11 - cis naar all-trans. Dit photoisomerization brengt een conformationele verandering in het visuele pigment dat een cascade van reacties afgesloten met een verandering in de membraan potentiaal, en het bewerkstelligen van de transductie van het licht stimulans om een elektrisch signaal initieert. Het herstel van de cel van lichte stimulatie betreft het uitschakelen van de tussenproducten geactiveerd door licht, en het herstel van de membraanpotentiaal. Ca 2 + moduleert de werking van een aantal van de enzymen die betrokken zijn bij fototransductie, en de concentratie is verminderd op licht stimulatie. Op deze manier, Ca 2 + speelt een belangrijke rol bij het herstel van de cel van lichte prikkeling en de aanpassing ervan aan achtergrond licht.
Een ander essentieel onderdeel van het herstelproces is de regeneratie van het visuele pigment dat is tijdens de licht-detectie verwoest door de photoisomerization van de 11 - cis chromofoor naar all-trans 5-7. Deze regeneratie begint met de introductie van all-trans retinal door de gefotoactiveerd pigment, met achterlating van de apo-eiwit opsin. De vrijgekomen all-trans retinal wordt snel gereduceerd in een reactie gebruik te maken van NADPH naar all-trans retinol, en opsin combineert met verse 11 - cis retinal gebracht in het buitenste segment om de visuele pigment hervorming. All-trans retinol wordt dan overgebracht uit het buitenste segment en in de aangrenzende cellen door de gespecialiseerde maatschappij Interphotoreceptor retinoïde Binding Protein (IRBP).
Fluorescentie beeldvorming van enkele fotoreceptorcellen kunnen worden gebruikt om hun fysiologie en celbiologie studeren. Ca 2 +-gevoelige fluorescente kleurstoffen kunnen gebruikt worden in detail te onderzoeken het samenspel tussen de buitenste segment Ca 2 + veranderingen en de reactie op 8-12, alsook de rol van de binnenste segment Ca 2 +-winkels in Ca 2 + licht homeostase 13,14 . Fluorescente kleurstoffen kunnen ook worden gebruikt voor het meten van Mg 2 + concentratie 15, pH, en als tracers van waterige en membraan compartimenten 16. Tot slot kan de intrinsieke fluorescentie van all-trans retinol (vitamine A) worden gebruikt om de kinetiek van zijn vorming en verwijdering in enkele fotoreceptorcellen 17-19 te controleren.
Protocol
1. Voorbereiding van Sylgard bedekte gerechten, experimentele kamers, en scheermesjes
- 35 mm Falcon Petrischalen bekleed met Sylgard elastomeer zijn nodig voor een goede hakken van een geïsoleerde netvlies om enkele lichtgevoelige cellen te verkrijgen. Het elastomeer is bereid volgens instructies van de leverancier en een kleine hoeveelheid wordt gegoten in elk gerecht om de bodem te bedekken met een laag. Plaats de schotel dekt na het coaten en bewaar ze. Over een paar dagen de tijd van het elastomeer verhardt en de gerechten klaar zijn.
- Geïsoleerd fotoreceptoren moeten vasthouden aan de onderkant van de experimentele kamer, zodat ze worden geïmmobiliseerd in de loop van een imaging experiment. Dit wordt bereikt door het bekleden van de bodems van de kamers met poly-L-lysine of poly-L-ornithine. Voeg 200 ul van 0,01% oplossing van een van beide een per kamer, en dekking van de kamers met een papieren handdoek om ze te beschermen tegen stof. Nadat de oplossing is opgedroogd, was de kamers met gedestilleerd water en bewaar in een gesloten doos. Gebruik binnen 2 weken.
- Voor het reinigen van de kamers aan het einde van een experiment, was ze met 100% ethanol om de olie te verwijderen uit de olie-immersie lens en celresten. Voor het verwijderen van de cel puin, het gebruik wattenstaafje applicators en zorgvuldig scrub de bodem van de kamer. Daarna wassen met gedestilleerd water en laat de kamers drogen alvorens opnieuw te coaten.
- Cut tweesnijdend scheermesjes in kleine stukjes (8 van de ene blad) met een metalen mes.
2. Bereiding van oplossingen
- De samenstelling van de oplossingen is afhankelijk van de soort. Voor amfibieën, van de Ringer's heeft (in mmol / L): 110 NaCl, KCl 2,5, 1,6 MgCl 2, een CaCl 2, 5 HEPES, pH = 7,55. De pH moet worden aangepast aan de eindwaarde met NaOH. Voor zoogdieren, van de Ringer's heeft (in mmol / L): 130 NaCl, 5 KCl, 0,5 MgCl 2, 2 CaCl2, 25 hemisodium-HEPES, pH = 7,40. De Ringer-oplossing kan worden bewaard in goed afgesloten op kamertemperatuur voor een paar maanden.
- Voorraad glucose-oplossing, 1 mol / L, bewaard bij -20 ° C om bacteriële groei te voorkomen.
- Op de dag van het experiment, toe te voegen aan glucose-oplossing van de Ringer tot een uiteindelijke concentratie van 5 mmol / L. Aan het eind van de dag, gooi het Ringer dat glucose bevat, omdat het zou kunnen groeien bacteriën.
3. Isolatie van netvliezen
- Voor de goede excisie van een netvlies is het belangrijk dat het dier donker aangepast voor minstens 2-3 uur voor het offer. Dieren moeten donker aangepast worden in een geschikte geventileerde container in de donkere kamer.
- Vul twee 35-mm petrischalen half-way met Ringer's.
- Offer het dier onder gedimd rood licht en verwijder de ogen. Vervolgens worden alle procedures uitgevoerd onder infrarood licht met behulp van een dissectie microscoop of een camera met een video-monitor.
- Verwijder alle overgebleven weefsel van de buitenkant van het oog. Knippen en verwijder het voorste deel, vervolgens over de oogschelp in een van de petrischalen gevuld met Ringer's.
- Verwijder het glasvocht en het netvlies zorgvuldig gescheiden van de rest van de oogschelp door knijpen of snijden eventuele bijlagen. Til het netvlies en volledig scheiden van de oogschelp.
- Overdracht van het netvlies naar de tweede petrischaal met een plastic pipet overdracht. Houd het schaaltje met het netvlies in een lichtdichte doos.
4. Isolatie van enkele fotoreceptorcellen
- Alle procedures worden uitgevoerd onder infrarood licht. Snijd een klein stukje van het netvlies en over te dragen met een plastic pipet aan op een Sylgard bedekte schotel. Het volume van de oplossing die het netvlies stuk moet ongeveer 250 pi.
- Pak een klein stukje van het scheermesje met het mes houder - de rand van het mes moet worden bij ongeveer 45 ° hoek van de houder. Platter het stukje netvlies op de Sylgard laag en het gebruik van het blad hak het stukje netvlies terwijl het vast aan de Sylgard laag.
- Overdracht 200 pi van de oplossing met de cellen aan een experimentele kamer - laat de resterende stuk van het netvlies in de Sylgard bedekte schotel. Houd de kamer met de geïsoleerde cellen in een lichtdichte doos.
- Wacht 10 min voor de cellen om zich te vestigen, voeg dan 2-3 ml van Ringer's. In dit stadium kan de geïsoleerde cellen worden geladen met een bepaalde fluorescerende kleurstof (bijvoorbeeld Fura-2) op basis van de kleurstof laden protocol.
- De cellen kunnen nu worden genomen om de microscoop podium voor experimenten.
5. Fluorescentie beeldvorming
- Breng de kamer tot het stadium van de epifluorescentiemicroscoop. Pas oplossing perfusie, temperatuur sondes, infrarood verlichting, enz.
- Sluit de gordijnen en begint te experimenteren. Schakel de infrarood licht in de microscoop kooi, focus op de bodem van de experimentele kamer, en verplaats het podium op zoek naar cellen.
6. Vertegenwoordiger van Results:
Fig. 1 toont de morfologie van gezonde geïsoleerde staafjes en kegeltjes photoreceptors verkregen met dit protocol van een salamander (Ambystoma tigrinum) netvlies. Salamander cellen zijn uitgebreid gebruikt voor single cell fluorescentie imaging studies vanwege hun grote omvang en hun vermogen om te overleven voor een paar uur na isolatie van het netvlies. Daarnaast, vanuit een salamander netvlies kan men regelmatig krijgen zowel de staafjes en kegeltjes fotoreceptoren.
Een belangrijk criterium voor de gezondheid van de cellen is de aanwezigheid van een intacte ellipsoïde (afb. 1), het deel van de cel waar de mitochondriën zijn geconcentreerd. Wanneer de cellen worden bekeken onder DAPI optiek, deze concentratie van mitochondria geeft een sterke fluorescentie-signaal (afb. 2) als gevolg van de aanwezigheid van NADH. Het ontbreken van een intacte ellipsoïde is een teken van een beschadigde cel, over het algemeen ongeschikt voor het experiment. Fig. 3 toont een beschadigde salamander staaf afdrukband, met een gezwollen cellichaam en een gecondenseerde kern. Dergelijke cellen weer veel lagere fluorescentie onder DAPI optiek, maar bekeken onder FITC optiek een sterke FAD signaal in de ellipsoïde regio (afkomstig van geoxideerd Flavin nucleotiden en flavoproteins). Een ander criterium voor de gezondheid van geïsoleerde fotoreceptoren is hun vermogen om all-trans retinol (vitamine A) te genereren in hun buitenste segmenten na stimulatie door licht. De aanmaak van vitamine A vereist aanzienlijke hoeveelheden NADPH, die afhankelijk is van een intacte metabolisme. Figuren 4 en 5 tonen de vorming van vitamine A in de buitenste segmenten van intacte kikker en muis staaf fotoreceptoren respectievelijk.
Figuur 1. Gezonde single staafjes en kegeltjes fotoreceptoren. De cellen werden geïsoleerd uit een tijger salamander netvlies. Fototransductie vindt plaats in de buitenste segment en de ellipsoïde is dicht op elkaar gepakte met mitochondriën. Staven zijn verantwoordelijk voor weinig licht visie, kegels voor helder licht zien.
Figuur 2. Fluorescentie van levende salamander staafjes en kegeltjes. Dit zijn donker aangepaste cellen, met een sterke NADH fluorescentie in hun respectieve ellipsoïden en geen significante vitamine A fluorescentie in hun buitenste segmenten. De vangst van de fluorescentie afbeelding is hun eerste blootstelling aan zichtbaar licht na de periode van donker-adaptatie.
Figuur 3. Beschadigde salamander stang afdrukband. De gezwollen cel lichaam en de gecondenseerde kern zijn een indicatie van schade. De cel wordt geoxideerd en er is minimaal NADH-signaal (DAPI optiek), maar veel sterker FAD-signaal (FITC optiek).
Figuur 4. Kikker hengel met NADH en retinol. Dit is een gezonde kikker staaf fotoreceptor vertoont een sterke NADH fluorescentie in de ellipsoïde regio. Voor blootstelling aan licht is er een minimale fluorescentie in de buitenste segment. Na blootstelling aan licht, er is een aanzienlijke stijging in de buitenste segment fluorescentie door de vorming van vitamine A.
Figuur 5. Muis staaf met retinol. Dit is een gezonde muis staaf fotoreceptor vertonen aanzienlijke buitenste segment fluorescentie na blootstelling aan licht door de vorming van vitamine A. Het ellipsoïde regio's van muis staaf fotoreceptoren niet laten een sterke fluorescentie signaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Als gezonde geïsoleerde cellen zijn niet verkregen, ligt het probleem niet met de isolatie of de gezondheid van het netvlies of met haar hakken. Typisch, na het verwijderen van de voorkant van het oog en het glasvocht, het netvlies liften gemakkelijk uit het pigment epitheel. Als dit niet gebeurt, probeer dan te pellen het af te rekenen vanaf de periferie van de oogschelp. Als het nog steeds moeilijk te scheiden, een waarschijnlijke mogelijkheid is dat het dier niet is donker aangepast voor een ruime periode van tijd, of het rode licht te fel is. Zorg voor een goede dark-aanpassing voor het dier, en dim de rode licht. De aanwezigheid van staaf fotoreceptoren in het netvlies kan eenvoudig worden vastgesteld door het controleren van de kleur van de geïsoleerde netvlies: knip een klein stukje van het netvlies en overbrengen naar een aparte petrischaal, die vervolgens kunnen worden bekeken onder kamer lichten. Een stuk van het netvlies met staaf fotoreceptoren heeft een helder rode kleur (als gevolg van rhodopsine) die vervaagt snel. Een kleurloze stuk zou wijzen op de afwezigheid van rhodopsine, en dus ook van staaf fotoreceptoren. Dit zou te wijten aan onjuiste scheiding van het netvlies van het pigment epitheel of naar een ongezonde netvlies. In een dergelijk geval moet u zorgen voor de gezondheid van de dieren en de juiste duistere aanpassing. Als een gezond netvlies is verkregen, maar niet gezond geïsoleerde cellen, dan is het probleem waarschijnlijk bij de hakken. Een fijne hakselen kritisch is: als de hakken is te grof, of het netvlies wordt unstuck, het resulteert meestal in stukjes netvlies in plaats van geïsoleerde cellen. Goede hakken resulteert typisch in een "cloud" van de cellen die in de oplossing.
Fluorescentie beeldvorming van enkele fotoreceptoren cellen kunnen gebruiken endogene cel fluoroforen zoals NADH, FAD of vitamine A, evenals fluorescente kleurstoffen gevoelig voor verschillende factoren, om een breed scala van fysiologische processen in real-time sonde. De methode kan worden toegepast op veel verschillende soorten, waaronder amfibieën zoals de salamander (Ambystoma tigrinum) 17,18 en kikker (Rana pipiens) 20, hagedissen (Gecko gekko) 21, vis (zebravis, Danio rerio) 11, en de muis (Mus musculus) 22. De uitbreiding van de methode om muizencellen maakt de studie van de verschillende typen van genetisch gemodificeerde dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Ondersteund door NEI verlenen EY014850.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources andinfrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools(scissors, forceps, blade holder) | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
- Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction. Neuron. 48, 387-401 (2005).
- Ebrey, T., Koutalos, Y.
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y.
- Palczewski, K.
- Saari, J. C. Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).
- Lamb, T. D., Pugh, E. N. Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision. Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).
- Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision. Biochemistry. 46, 9674-9684 (2007).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods. J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors. J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).
- Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice. J Physiol. 542, 843-854 (2002).
- Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish. J Physiol. 579, 15-27 (2007).
- Matthews, H. R., Fain, G. L. Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors. Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).
- Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors. J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).
- Krizaj, D., Copenhagen, D. R. Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors. Neuron. 21, 249-256 (1998).
- Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments. J Physiol. 553, 125-135 (2003).
- Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks. Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).
- Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors. J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).
- Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology. J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).
- Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors. Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).
- Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments. Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).
- Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors. Vision Res. 47, 363-374 (2007).
- Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).
