Summary
Описан способ подготовки одной живой клетки фоторецепторов из разных видов позвоночных для флуоресцентной визуализации. Метод может быть использован для изображений флуоресценции эндогенных флуорофоров, таких как NADH или витамин А, или, что из экзогенно добавил флуоресцентные красители чувствительны к Са
Protocol
1. Подготовка Sylgard покрытых блюд, экспериментальной камеры, и бритвенных лезвий
- 35 мм Сокол чашки Петри покрытые эластомера Sylgard необходимы для надлежащего колки изолированной сетчатки получить отдельные клетки фоторецепторов. Эластомер получают в соответствии с инструкциями поставщика и небольшое количество наливают в каждое блюдо, чтобы покрыть дно слой. Замените блюдо охватывает после нанесения покрытия и хранить их. Через несколько дней эластомер твердеет и блюда будут готовы.
- Изолированные фоторецепторы должны придерживаться нижней части экспериментальной камеры, чтобы они были иммобилизованным в ходе визуализации эксперимента. Это достигается за счет покрытия днища камеры с поли-L-лизин или поли-L-орнитина. Добавить 200 мкл 0,01% раствора или по одному в камере, и крышка камеры с бумажным полотенцем, чтобы защитить их от пыли. После того как раствор высохнет, смойте камеры с дистиллированной водой и хранят в фургон. Используйте в течение 2 недель.
- Для очистки камер в конце эксперимента, промойте их 100%-ным этанолом для удаления нефти с нефтью погружения линз и сотовых мусора. Для удаления ячейки мусора, использование хлопка наконечником аппликатора и тщательно мыть нижней части камеры. Затем промыть дистиллированной водой и дайте высохнуть перед камерами повторного покрытия.
- Вырезать обоюдоострым лезвием бритвы на небольшие кусочки (8 из одного лезвия) с металлическим резаком.
2. Приготовление растворов
- Состав решений зависит от вида. Для амфибий, Рингера имеет (в ммоль / л): 110 NaCl, 2,5 KCl, 1,6 MgCl 2, 1 CaCl 2, 5 HEPES, рН = 7,55. РН должен быть настроен на конечного значения с NaOH. Для млекопитающих, Рингера имеет (в ммоль / л): 130 NaCl, 5 KCl, 0,5 2 MgCl, CaCl 2 2, 25 hemisodium-HEPES, рН = 7,40. Решение Рингера может храниться хорошо запечатаны при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
- Сток раствора глюкозы, 1 моль / л, хранится при температуре -20 ° С, чтобы избежать роста бактерий.
- В день эксперимента, добавить глюкозу к решению Рингера до конечной концентрации 5 ммоль / л В конце концов, отказаться от Рингера, который содержит глюкозу, поскольку это может расти бактерии.
3. Выделение сетчатки
- Для надлежащего иссечение сетчатки важно, чтобы животное быть темно-адаптированных, по крайней мере за 2-3 часа до жертвы. Животные должны быть темно-адаптирована в подходящем контейнере в вентилируемом темном зале.
- Заполните два 35-мм чашки Петри на полпути с раствором Рингера.
- Жертвы животных под тусклый красный свет и удалить глаз. Впоследствии все процедуры проводятся под инфракрасный свет, используя рассекает микроскопа или камеры с видео монитор.
- Удалите все остатки ткани от внешней поверхности глаза. Вырезать и удалить передней части, а затем перенести наглазник в одну из чашек Петри заполнены Рингера.
- Удаление стекловидного тела и тщательно отделить сетчатку от остальной наглазник, зажимая выключен или резки любые вложения. Аккуратно поднимите сетчатки и отделить его полностью от наглазник.
- Передача сетчатки на второй чашке Петри с пластиковой пипеткой передачи. Держите блюдо с сетчатки в светонепроницаемый ящик.
4. Выделение отдельных клеток фоторецепторов
- Все процедуры проводятся под инфракрасным излучением. Отрежьте небольшой кусочек сетчатки и перенести его с пластиковой пипеткой Sylgard покрытые блюдо. Объем раствора, содержащего сетчатки кусок должен быть около 250 мкл.
- Возьмите небольшой кусочек лезвия бритвы с лезвием держатель - край лезвия должны быть примерно под углом 45 ° к держателю. Свести часть сетчатки на слое Sylgard и используя лезвие нарезать кусок сетчатки мелко, сохраняя при этом он придерживался слой Sylgard.
- Передача 200 мкл раствора, содержащего клетки экспериментальной камеры - оставьте все оставшиеся части сетчатки в Sylgard покрытые блюдо. Держите камеру с изолированными клетками в светонепроницаемый ящик.
- Подождите 10 минут для клеток на поселение, затем добавьте 2-3 мл Рингера. На данном этапе, изолированных клеток могут быть загружены с особым флуоресцентным красителем (например Фура-2) в соответствии с красителем протокол загрузки.
- Теперь клетки могут быть приняты для столике микроскопа для экспериментов.
5. Флуоресценции
- Передача камеры этапе epifluorescence микроскопом. Отрегулируйте решение перфузии, датчиков температуры, инфракрасную подсветку, и т.д.
- Закрыть шторы и начать эксперимент. Включите ИК-света внутри микроскопа клетку, сосредоточить внимание на нижнюю часть экспериментальной камере, и двигаться этапе ищет клеток.
6. Представитель Результатс:
Рис. 1 показана морфология здоровый изолированных палочек и колбочек, фоторецепторы, полученные с применением протокола от саламандра (Ambystoma tigrinum) сетчатки. Salamander клетки широко используются для одной ячейки флуоресценции исследования изображений из-за их больших размеров и их способность выживать в течение нескольких часов после изоляции от сетчатки. Кроме того, от сетчатки саламандры можно регулярно получать как палочек и колбочек фоторецепторов.
Одним из важных критериев для здоровья клетки является наличие интактной эллипсоид (рис. 1), часть клетки, где сосредоточены митохондрии. Когда клетки рассматриваются под DAPI оптики, эта концентрация митохондрий дает сильный сигнал флуоресценции (рис. 2) из-за присутствия NADH. Отсутствие нетронутыми эллипсоида знак поврежденной клетки, как правило, непригодны для эксперимента. Рис. 3 показаны поврежденные саламандра стержень фоторецепторов, с опухшим тело клетки и конденсированных ядра. Такие клетки дисплей намного ниже флуоресценции под DAPI оптика, но смотреть под FITC оптики показывают сильный сигнал ФАД в эллипсоид регионе (информация, поступающая из окисленных флавин нуклеотидов и флавопротеидов). Еще один критерий для здоровья изолированных фоторецепторов является их способность генерировать полностью транс-ретинол (витамин А) в их наружных сегментов при стимуляции светом. Поколения витамина требует значительного количества НАДФН, который зависит от нетронутыми техники обмена веществ. На рисунках 4 и 5 показывают, образование витамина А в наружных сегментах интактных лягушки и мыши фоторецепторов стержня соответственно.
Рисунок 1. Здоровый одного фоторецепторов палочек и колбочек. Клетки были изолированы от сетчатки глаза тигра саламандры. Фототрансдукции происходит во внешнем сегменте и эллипсоид плотно с митохондриями. Палочки отвечают за тусклом свете видения, конусы для яркого видения света.
Рисунок 2. Флуоресценция жизни саламандр палочек и колбочек. Это темно-адаптированы клетки, показывая сильную флуоресценцию NADH в своих эллипсоидов и никаких существенных витамина флуоресценции в их наружных сегментов. Захват флуоресценции изображение представляет свой первый воздействия видимого света после периода темно-адаптации.
Рисунок 3. Поврежденные саламандра стержень фоторецепторов. Опухшие тело клетки и конденсированных ядра указывают на повреждение. Ячейка окисляется и есть минимальное сигнал NADH (DAPI оптики), но гораздо сильнее, ФАД сигнала (FITC оптики).
Рисунок 4. Лягушка стержень с NADH и ретинола. Это здоровый стержень фоторецепторов лягушки показывает сильную флуоресценцию NADH в эллипсоид регионе. Перед освещенности есть минимальное флуоресценции во внешнем сегменте. После воздействия света, есть значительное увеличение внешнего флуоресценции сегмента в связи с образованием витамина А.
Рисунок 5. Мышь стержень с ретинолом. Это здоровый фоторецепторов стержня мыши показывает значительный внешний сегмент флуоресценции после воздействия света в связи с образованием витамина А. эллипсоида регионов фоторецепторов мыши стержень не показывают сильного сигнала флуоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Если здоровый изолированных клеток не получено, проблема заключается либо с изоляцией или здоровья сетчатки или с ее измельчать. Как правило, после удаления передней части глаза и стекловидное тело, сетчатку легко отрывается от земли пигментного эпителия. Если этого не произойдет, попробуйте очистить его от начиная с периферии наглазник. Если он все еще трудно отделить, что вполне возможно, что животное не было темно-адаптированы для соответствующего периода времени, или красный свет слишком яркий. Обеспечить надлежащее темно-адаптации для животных, и тусклый красный свет. Наличие стержня фоторецепторов в сетчатке может быть легко установлена, проверяя цвет изолированной сетчатки: вырезать небольшой кусок сетчатки и перенести его на отдельные чашки Петри, которые затем могут быть просмотрены в комнате свет. Часть сетчатки содержащих фоторецепторов стержня имеет ярко-красный цвет (из-за родопсин), который исчезает очень быстро. Бесцветная часть будет означать отсутствие родопсина, и, следовательно, стержень фоторецепторов. Это может быть связано как с неправильным разделение сетчатки от пигментного эпителия или нездоровый сетчатки. В таком случае, вы должны убедиться, здоровье животных и их надлежащей адаптации к темноте. Если здоровый сетчатке получается, но не здоровье изолированных клеток, то проблема, скорее всего с измельчать. Штрафа измельчения имеет решающее значение: если измельчения слишком грубым, или сетчатка становится расклеиваться, это приводит в основном в части сетчатки, а не изолированных клеток. Хорошая рубка обычно приводит к «облако» клеток, входящих в решение.
Флуоресценции одиночных клеток фоторецепторов может использовать эндогенных флуорофоров клеток, таких как NADH, FAD или витамин, а также флуоресцентные красители чувствительны к различным факторам, чтобы исследовать широкий спектр физиологических процессов в реальном времени. Метод может быть применен к различным видам, включая амфибий, таких как саламандра (Ambystoma tigrinum) 17,18 и лягушки (Rana pipiens) 20, ящериц (геккон Gecko) 21, рыбы (данио рерио, данио rerio) 11, и мышь (Mus мышцы) 22. Расширение метод клеток мыши позволяет изучение различных типов генетически модифицированных животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Поддержка НОУ грант EY014850.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources andinfrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools(scissors, forceps, blade holder) | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
- Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction. Neuron. 48, 387-401 (2005).
- Ebrey, T., Koutalos, Y.
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y.
- Palczewski, K.
- Saari, J. C. Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).
- Lamb, T. D., Pugh, E. N. Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision. Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).
- Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision. Biochemistry. 46, 9674-9684 (2007).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods. J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors. J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).
- Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice. J Physiol. 542, 843-854 (2002).
- Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish. J Physiol. 579, 15-27 (2007).
- Matthews, H. R., Fain, G. L. Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors. Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).
- Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors. J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).
- Krizaj, D., Copenhagen, D. R. Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors. Neuron. 21, 249-256 (1998).
- Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments. J Physiol. 553, 125-135 (2003).
- Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks. Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).
- Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors. J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).
- Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology. J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).
- Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors. Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).
- Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments. Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).
- Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors. Vision Res. 47, 363-374 (2007).
- Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).
