Summary
Um método é descrito para a preparação de células vivas único fotorreceptoras de diferentes espécies de vertebrados para imagens de fluorescência. O método pode ser usado para a imagem da fluorescência de fluoróforos endógenos, como o NADH ou vitamina A, ou que de adicionado exogenamente corantes fluorescentes sensíveis ao Ca
Abstract
Na retina de vertebrados, fototransdução, a conversão da luz em sinal elétrico, é realizado pela vara e células fotorreceptoras cone 1-4. Os bastonetes são responsáveis pela visão com pouca luz, cones de luz brilhante. Fototransdução ocorre no segmento externo da célula fotorreceptoras, um compartimento especializado que contém uma alta concentração de pigmento visual, o detector de luz primária. O pigmento visual é composto de um cromóforo, 11 - cis retinal, ligado a uma proteína, a opsina. Um fóton absorvida pelo pigmento visual isomeriza o cromóforo de 11 - cis para trans. Este photoisomerization traz uma mudança conformacional na pigmento visual que inicia uma cascata de reações que culmina em uma mudança no potencial de membrana, e provocar a transdução do estímulo luminoso em sinal elétrico. A recuperação da célula de estímulo de luz envolve a desativação da intermediários ativados pela luz, eo restabelecimento do potencial de membrana. Ca 2 + modula a atividade de várias enzimas envolvidas na fototransdução, e sua concentração é reduzida após estimulação luminosa. Desta forma, Ca 2 + tem um papel importante na recuperação da célula de estimulação luminosa e sua adaptação à luz de fundo.
Outra parte essencial do processo de recuperação é a regeneração do pigmento visual que foi destruída durante a detecção de luz pela photoisomerization de seus 11 - cromóforo cis para trans 5-7. Esta regeneração se inicia com a libertação de todos os trans-retinal do pigmento fotoativados, deixando para trás a opsina apo-proteína. O lançado all-trans retinal é rapidamente reduzida em uma reação utilizando NADPH para all-trans retinol e opsina combina com 11 fresco - cis retinal trazidos para o segmento externo para reformar o pigmento visual. All-trans retinol é então transferido para fora do segmento externo e para as células vizinhas pela transportadora especializada Protein Retinoid Interphotoreceptor Binding (IRBP).
Imagens de fluorescência de células fotorreceptoras único pode ser usado para estudar sua fisiologia e biologia celular. Ca 2 + sensíveis à corantes fluorescentes podem ser usados para analisar em pormenor a interacção entre o segmento externo Ca 2 + mudanças e resposta à luz 12/08, bem como o papel de interior segmento de Ca 2 + lojas em Ca 2 + homeostase 13,14 . Corantes fluorescentes também podem ser usados para medir a concentração de Mg 2 + 15, pH, e como marcadores de aquoso e compartimentos da membrana 16. Finalmente, a fluorescência intrínseca de all-trans retinol (vitamina A) pode ser usado para monitorar a cinética de sua formação e remoção das células fotorreceptoras única 17-19.
Protocol
1. Preparação de Sylgard cobertas de pratos, câmaras experimental, e lâminas de barbear
- 35 milímetros pratos Petri Falcon revestido com elastômero Sylgard são necessários para o corte adequado de uma retina isolada para obter células fotorreceptoras único. O elastômero é preparado de acordo com as instruções do fornecedor e uma pequena quantidade é derramado em cada prato para cobrir seu fundo com uma camada. Substitua o prato cobre após o revestimento e armazená-los. No tempo de alguns dias o elastômero endurece e os pratos estão prontos.
- Fotorreceptores isolado necessidade de aderir ao fundo da câmara experimental para que sejam imobilizados durante o curso de um experimento de imagem. Isto é conseguido através do revestimento do fundo das câmaras com poli-L-lisina ou poli-L-ornitina. Adicionar 200 mL de solução 0,01% de qualquer um por câmara, e cobrir as câmaras com um papel toalha para protegê-los do pó. Depois que a solução secar, lavar as câmaras com água destilada e guarde em uma caixa fechada. Use dentro de 2 semanas.
- Para limpar as câmaras no final de um experimento, lavá-los com 100% de etanol para remover todo o óleo da lente de imersão em óleo e detritos celulares. Para remover os restos celulares, use com ponta de algodão aplicadores e cuidadosamente esfregue o fundo da câmara. Depois, lave com água destilada e deixe secar antes de as câmaras de re-revestimento.
- Cortar lâminas de dois gumes navalha em pedaços pequenos (8 a partir de uma lâmina) com um cortador de metal.
2. Preparação de soluções
- A composição das soluções depende da espécie. Para os anfíbios, o da campainha tem (em mmol / L): 110 NaCl, 2,5 KCl, 1,6 MgCl 2, 1 CaCl 2, 5 HEPES, pH = 7,55. O pH deve ser ajustado para o valor final com NaOH. Para os mamíferos, o da campainha tem (em mmol / L): 130 NaCl, KCl 5, 0,5 MgCl 2, 2 CaCl 2, 25 hemisodium-HEPES, pH = 7,40. A solução de Ringer podem ser mantidos bem fechados à temperatura ambiente por alguns meses.
- Solução estoque de glicose, 1 mol / L, mantidas a -20 ° C para evitar o crescimento bacteriano.
- No dia do experimento, adicione glucose para a solução de Ringer para uma concentração final de 5 mmol / L. No final do dia, descarte o da campainha que contém glicose, pois ela pode crescer bactérias.
3. Isolamento de retinas
- Para a excisão adequada de uma retina, é importante que o animal será de adaptação ao escuro por pelo menos 2-3 horas antes do sacrifício. Os animais devem ser adaptados à escuridão em um recipiente adequado ventilado na sala escura.
- Encher dois pratos 35 milímetros Petri meio do caminho com solução de Ringer.
- Sacrifício do animal sob luz vermelha ofuscante e remover os olhos. Posteriormente, todos os procedimentos são realizados sob luz infravermelha através de um microscópio de dissecação ou uma câmera com um monitor de vídeo.
- Remover qualquer tecido que tenham ficado de fora da superfície do olho. Corte e retire a parte anterior, em seguida, transferir a ocular em uma das placas de Petri cheia de Ringer.
- Remover o vítreo e separe cuidadosamente a retina do resto da ocular por beliscar fora ou cortar quaisquer anexos. Levante cuidadosamente a retina e separá-la completamente a partir do ocular.
- Transferir a retina para a segunda placa de Petri com uma pipeta de plástico. Mantenha o prato que contém a retina em uma caixa à prova de luz.
4. Isolamento de células fotorreceptoras única
- Todos os procedimentos são realizados sob luz infravermelha. Corte um pedaço pequeno de retina e transferi-la com uma pipeta de plástico para um prato Sylgard cobertas. O volume da solução contendo a peça retina deve ser cerca de 250 mL.
- Pegue um pequeno pedaço de lâmina de barbear com a lâmina - a borda da lâmina deve estar em cerca de 45 ° para o titular. Achatar o pedaço de retina na camada Sylgard e usando a lâmina cortar o pedaço de retina finamente, mantendo-o preso para a camada de Sylgard.
- Transferir 200 mL da solução contendo as células a uma câmara experimental - deixar qualquer parte restante da retina no prato Sylgard cobertas. Mantenha a câmara com as células isoladas em uma caixa à prova de luz.
- Aguarde 10 min para as células para resolver, em seguida, adicione 2-3 mL de Ringer. Nesta fase, as células isoladas podem ser carregados com um corante fluorescente especial (por exemplo Fura-2) de acordo com o protocolo de carga de corantes.
- As células podem agora ser levado para o estágio do microscópio para experimentos.
5. Fluorescência de imagem
- Transferência da câmara para o estágio do microscópio de epifluorescência. Ajustar perfusão solução, sondas de temperatura, iluminação por infravermelhos, etc
- Feche as cortinas e começar a experimentar. Ligue a luz infravermelha dentro da gaiola microscópio, foco no fundo da câmara experimental, e mover o palco à procura de células.
6. Resultado representantes:
Fig. 1 mostra a morfologia da haste isolada saudável e cones fotorreceptores obtidas com este protocolo a partir de uma retina salamandra (Ambystoma tigrinum). Salamander células têm sido amplamente utilizadas para estudos de imagem única célula de fluorescência por causa de seu grande tamanho e sua capacidade de sobreviver por várias horas após o isolamento da retina. Além disso, a partir de uma retina salamandra pode-se obter regularmente dois haste e cones fotorreceptores.
Um critério importante para a saúde das células é a presença de um elipsóide intacta (Fig. 1), a parte da célula onde as mitocôndrias estão concentrados. Quando as células são vistas sob a óptica DAPI, esta concentração de mitocôndrias dá um forte sinal de fluorescência (Fig. 2) devido à presença de NADH. Falta de um elipsóide intacta é um sinal de uma célula danificada, geralmente impróprios para experimentar. Fig. 3 mostra uma haste danificada salamandra fotorreceptoras, com um corpo celular inchado e um núcleo condensado. Tais células mostrar muito mais baixa fluorescência sob a ótica DAPI, mas visto sob a ótica FITC mostrar um sinal FAD forte na região elipsóide (provenientes de nucleotídeos de flavina oxidada e flavoproteínas). Outro critério para a saúde dos fotorreceptores isolado é sua capacidade de gerar all-trans retinol (vitamina A) em seus segmentos externos à estimulação pela luz. A geração de vitamina A requer quantidades substanciais de NADPH, que depende de uma maquinaria metabólica intacta. Figuras 4 e 5 mostram a formação de vitamina A no segmentos externos de anfíbio intacta e os bastonetes do mouse, respectivamente.
Figura 1. Saudável fotorreceptores única haste e cone. As células foram isoladas a partir de uma retina salamandra tigre. Fototransdução ocorre no segmento externo eo elipsóide é densamente embalado com mitocôndrias. Bastonetes são responsáveis pela visão luz fraca, cones para a visão de luz brilhante.
Figura 2. Fluorescência de vida salamandra haste e cone. Estes são células de adaptação ao escuro, mostrando fluorescência NADH forte em seus respectivos elipsóides e não significativa de vitamina A fluorescência em seus segmentos exterior. A captura da imagem de fluorescência representa sua primeira exposição à luz visível após o período de adaptação ao escuro.
Figura 3. Danificado salamandra vara fotorreceptoras. O corpo da célula inchada eo núcleo condensado são indicativos de danos. A célula é oxidado e não há sinal de NADH mínima (DAPI óptica), mas muito mais forte sinal de FAD (FITC óptica).
Figura 4. Sapo haste com NADH e retinol. Este é um fotorreceptor da haste saudáveis sapo mostrando fluorescência NADH forte na região elipsóide. Antes de exposição à luz há fluorescência mínima no segmento externo. Após a exposição à luz, há um aumento significativo na fluorescência segmento externo, devido à formação de vitamina A.
Figura 5. Rato haste com retinol. Este é um fotorreceptor da haste saudáveis rato mostrando fluorescência segmento significativo exterior após a exposição à luz, devido à formação de vitamina A. As regiões elipsóide de bastonetes mouse não mostrar um forte sinal de fluorescência.
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Discussion
Se saudável células isoladas não são obtidas, o problema estará, ou com o isolamento ou a saúde da retina ou com a sua corte. Normalmente, após a remoção da parte frontal do olho e do vítreo, a retina prontamente decola do epitélio pigmentar. Se não, tente retire-a a partir da periferia da ocular. Se ainda é difícil separar, uma possibilidade provável é que o animal não tenha sido de adaptação ao escuro por um período de tempo adequado, ou a luz vermelha é muito brilhante. Assegurar a adaptação escura apropriada para o animal, e obscurecer a luz vermelha. A presença de bastonetes na retina podem ser facilmente verificados, verificando a cor da retina isolada: corte um pedaço pequeno de retina e transferir para uma placa de Petri separadas, que podem então ser visto sob luzes da sala. Um pedaço de fotorreceptores da retina com vara tem uma cor vermelho brilhante (devido a rodopsina) que desaparece rapidamente. Uma parte incolor que indicaria a ausência de rodopsina, e, portanto, os bastonetes. Isso pode ser devido tanto à separação inadequada da retina do epitélio pigmentar da retina ou a um insalubres. Nesse caso, você deve assegurar a saúde dos animais e sua adaptação adequada escuro. Se uma retina saudável é obtido, mas não saudável células isoladas, então o problema é mais provável com o corte. Um corte fino é fundamental: se o corte for muito grossa, ou a retina torna-se unstuck, resulta na maior parte em pedaços de retina em vez de células isoladas. Chopping boa normalmente resulta em uma "nuvem" de células que aparecem na solução.
Imagens de fluorescência de células individuais fotorreceptores pode usar fluoróforos endógena, como NADH, FAD ou vitamina A, bem como corantes fluorescentes sensíveis a diferentes fatores, para investigar uma ampla gama de processos fisiológicos em tempo real. O método pode ser aplicado a muitas espécies diferentes, incluindo anfíbios, como salamandras (Ambystoma tigrinum) 17,18 e rã (Rana pipiens) 20, lagartos (Gecko gecko) 21, de peixe (peixe-zebra, Danio rerio) 11, e rato (Mus musculus) 22. A extensão do método para as células do rato permite o estudo de diferentes tipos de animais geneticamente modificados.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Suportado pelo NEI conceder EY014850.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources andinfrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools(scissors, forceps, blade holder) | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
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