Summary
Denne artikkelen beskriver en
Abstract
Metastatisk spredning av ondartede celler krever nedbrytning av basalmembran, festing av tumorceller til vaskulært endotelium, inntrekking av endoteliale veikryss og endelig invasjon og migrering av tumorceller gjennom det endoteliale sjikt for å gå inn i blodstrømmen som et middel for transport til fjerntliggende steder i verts 1-3. En gang i sirkulasjonssystemet, kreftceller overholde kapillærveggene og extravasate til omkringliggende vev for å danne metastatisk svulster 4,5. De ulike delene av svulst celle-endotelceller interaksjon kan replikeres in vitro ved å utfordre en monolayer av menneskelige navlestrengsvenen endotelceller (HUVEC) med kreftceller. Studier som er utført med elektron-og fase-kontrast mikroskop tyder på at in vitro-sekvens av hendelser nokså vise in vivo metastatisk prosess 6.. Her beskriver vi en elektrisk impedans basert teknikk som overvåker og kvantifiserer i sanntid de invasion av endotelceller ved maligne tumorceller.
Giæver og Keeses først beskrevet en teknikk for å måle fluktuasjoner i impedans når en populasjon av celler som vokser på overflaten av elektrodene 7,8. Den xCELLigence instrument, produsert av Roche, benytter en lignende teknikk for å måle endringer i elektrisk impedans som celler feste og spredt i en kultur tallerken dekket med et gull microelectrode matrise som dekker omtrent 80% av arealet på bunnen av en brønn. Ettersom cellene feste og spredt på elektrodeoverflaten, det fører til en økning i elektrisk impedans 9-12. Impedansen blir vist som en dimensjonsløs parameter betegnet celle-indeksen, som er direkte proporsjonal med det totale areal av vev-kulturen godt som omfattes av celler. Derfor kan den celle-indeksen brukes til å overvåke celle adhesjon, spredning, morfologi og celletetthet.
Invasjonen analysen beskrevet i denne artikkelen er basert på endringeri elektrisk impedans ved elektroden / celle interfase, som en populasjon av maligne celler invaderer gjennom en HUVEC monolaget (figur 1). Avbrudd av endotelceller veikryss, tilbaketrekking av endotelial monolag og utskifting av kreftceller føre til store endringer i impedans. Disse endringene direkte korrelerer med invasiv kapasitet av kreftceller, dvs. invasjon av høyt aggressive celler vil føre til store endringer i celle impedans og vice versa. Denne teknikken gir en dobbel fordel i forhold til eksisterende metoder for måling av invasjon, slik som Boyden kammer og Matrigel assays: 1) endotelcelle-tumor celle interaksjon nærmere etterligner in vivo prosess, og 2) den data som er oppnådd i den virkelige tid og er mer lett å kvantifisere, i motsetning til slutt-punkt-analyse etter andre metoder.
Protocol
En. Forberedelse
- Alle trinn bør utføres under sterile betingelser i en vevskultur hette.
- Den xCELLigence stasjon er plassert i en 37 ° C inkubator i nærvær av 5% CO2.
- Bruk lav passasje HUVEC celler, helst ikke mer enn passasje 6. Sørg også for at cellene er ikke mer enn 75% konfluent på tidspunktet for innhøsting.
- HUVEC celler dyrkes i EGM-2-medier rekonstitueres med EGM-2 bullet kit (Lonza biovitenskap) inneholder vekstfaktorer, kosttilskudd og 5% fetal bovine serum.
- Alle spor av trypsin bør fjernes fra cellesuspensjoner ved å spinne cellene ved 200xg, vasking en gang med PBS, og resuspendering av dem til indikert celletetthet.
- Coat xCELLigence E-plate 16 med 0,1% gelatin i 1 time ved 37 ° C eller over natten ved 4 ° C. Vask plate med PBS og tilsett 100 pl rekonstituert EGM-2-medier. Utfør en blank lesing på xCELLigence system for å måle bakgrunnenimpedans i fravær av celler.
2. Genererer HUVEC monolag
- Høste en sub-konfluent kolbe HUVEC celler ved trypsinering. Resuspender celler i rekonstituert EGM-2-medier til en endelig tetthet på 2,5 x 10 5 celler / ml.
- Til hver brønn av en bakgrunn kalibrert E-plate som inneholder 100 pl EGM-2-medier, legger 100 pl av HUVEC celle suspensjon (2,5 x 10 4 HUVEC celler).
- Umiddelbart installere E-Plate i xCELLigence instrument.
- Program xCELLigence programvare for å utføre impedans målinger med 10 minutters intervaller.
- La de endoteliale cellene vokse i 18-21 timer før de danner et monolag, som vist ved en utflating av celle indeks (figur 2).
3. Tilsetting av invaderende celler og data normalisering.
- Når en stabil HUVEC monolag har dannet, høste kreftceller ved trypsinization og resuspender til en endelig hitet av en 5 x 10 celler / ml i mediet som brukes for å dyrke tumorceller (for eksempel RPMI eller DMEM medium som inneholder 10% FBS)
- Pause impedans målingene på xCELLigence programvare og fjerne E-Plate fra stasjonen.
- Fjern EGM-2 media ved aspirasjon. Legg 100 ul tumor cellesuspensjon inneholdende 1 x 10 4 celler. Vanligvis et forhold på 1:2,5 tumorceller: fungerer endoteliale celler utsådd, best for analysen. Imidlertid kan forholdet være optimalisert for individuelle cellelinjer.
- Plasser E-plate på xCELLigence system i inkubatoren og fortsette impedans avlesninger ved 10 minutters intervaller.
- Invasjon kan overvåkes i sanntid over de neste 6-12 timer som et fall i celle indeks på grunn av tilbaketrekningen av endoteliale veikryss og gjennomtrenging av invaderende tumorceller.
- Normalisere resultater til tidspunktet for tillegg av invaderende kreftceller. Den xCELLigence programvaren tillater normalisering til enhver tid punkt og resultaterkan være direkte sett i programvarevinduet.
4. Representant Resultater:
Et eksempel på HUVEC monolaget invasjon av metastatiske og ikke-metastaserende celler er vist i figur 3.. K7M2 er en metastatisk osteosarkom cellelinje. Disse cellene uttrykker høye nivåer av cytoskeletal linker protein ezrin, som står for de invasive egenskapene til denne cellelinje 13,14. Når HUVEC celler blir utfordret med K7M2 celler, er det en reduksjon i elektrisk motstand i løpet av 6 timer. Denne nedgangen i elektrisk motstand representerer invasjonen av HUVEC monolag av de invaderende kreftceller. Den K12 celle-linje, på den annen side uttrykker mye lavere nivåer av ezrin, og er følgelig mindre metastatisk 13.. Utfordrer HUVEC monolag med K12 celler resulterer i en mindre bratt nedgang i motstanden som cellene ikke klarer å forholde seg til eller invadere gjennom HUVEC monolag (figur 3).
Figur 2. HUVEC monolag formasjon. Endringer i celle-indeksen som HUVEC celler feste til og spredt på gelatin-belagte gull elektroder. Dannelsen av et konfluent monolag er representert av en stabilisering av celle indeks etter 18 timer.
Figur 3. Invasjon av HUVEC celler ved K7M2 og K12 osteosarkom celler. En bratt nedgang i cell-indeks oppstår innen noen få timer etter innføringen av høyt metastatiske K7M2 celler. K12-celler, på den annen side, er mindre metastatisk og er ikke i stand til å trenge gjennom den endoteliske monolag så effektivt som K7M2 celler. Dette er representert ved en mindre bratt nedgang i celle indeksen når HUVEC monolag utfordret med K12 celler. Kontroll representerer impedans av HUVEC monolaget i fravær av kreftceller. Eksperimentene ble utført i triplikat.
Discussion
The real-time HUVEC invasjon analysen er en enkel, men kraftig metode for overvåking invasjon. Det gir resultater i sanntid, som er en betydelig fordel i forhold til andre tradisjonelle teknikker som er avhengige av ende-punkt-analyse. Analysen kan bli endret for å teste narkotika, antistoffer, ligander og proteiner som hemmer eller stimulatorer av metastaser. Effekten av ulike agenter på endotelial / kreftcelle cross-talk kan vurderes i tillegg. Ved innføring av eksogene agenter, for eksempel vekstfaktorer og narkotika i kultur media, er det viktig å sikre at de ikke påvirker integriteten til HUVEC monolayer. Forstyrrelse av den HUVEC monolaget kan testes ved å innføre eksogene middel i fravær av invaderende celler, og å sikre at det ikke er noen forandring i celle-indeksen. Således bør egnede kontroller inkluderes som en del av den eksperimentelle design.
Forskjellige cellelinjene demonstrere ulike celle-indeksen kurver som de danner en confluent monolag. Formen på kurven, så vel som den maksimale celle-indeks oppnås, er celle-typespesifikk. HUVEC-celler viser en karakteristisk forbigående utflating av celle indeks 4-6 timer etter tilsetningen, etterfulgt av en annen stabilisering ved en høyere celle indeks etter 16-18 timer. Derfor er det viktig å la cellene danne et konfluent monolag i minst 18 timer før tilsetning av tumorceller.
Siden cellen indeksen er avhengig av det ioniske miljø ved elektrode / celle interfase, forskjellige faktorer, slik som celle-morfologi og kvaliteten av celle-celle adhesjon påvirke celle-indeks, i tillegg til området av brønnbunnen dekket. Dermed er den reduksjon i celle-indeksen, som skjer ved tumorcelle-invasjon, er en funksjon av flere faktorer, som omfatter tilbaketrekking av endoteliale veikryss og påfølgende tumor celle invasjon.
Den xCELLigence instrumentet er produsert i tre forskjellige konfigurasjoner: sanntid celle analysator(RTCA) SP, RTCA MP og RTCA DP. Den RTCA SP instrumentet har en 96-brønnen E-plate mens RTCA MP instrumentet kan lagre opp til seks 96-brønnen E-plater samtidig. Dette gir høy gjennomstrømming screening av narkotika og forbindelser. Forsøkene i denne artikkelen er utført ved hjelp av RTCA DP instrument, som kan holde tre 16-brønners E-plater. Hver E-plate beholdning stasjon kan være uavhengig operert, noe som gjør at flere brukere å kjøre eksperimenter samtidig. Den RTCA DP Apparatet kan også brukes til å studere migrering CIM-plates. Disse er 16-brønners plater med øvre og nedre kammere adskilt av en polyetylentereftalat (PET)-membran med en gjennomsnittlig porestørrelse på 8um. De elektroniske sensorer er plassert på undersiden av den porøse membran i det øvre kammer. Det nedre kammeret tjener som et reservoar for kjemoattraktant for cellene i det øvre kammer. Imidlertid er en stor fordel med den HUVEC invasjon analysen over CIM-platene som tumor celle invasjon i det tidligere jegr ikke begrenset av porestørrelse, som endotelcelle invasjon avhenger av krysstale mellom de tumor-og endotelceller.
Den HUVEC invasjon Målingen kan også utføres på ECIS Z instrument, fremstilt av Applied Biofysikk (Troy, NY). Den ECIS Z instrument benytter en teknologi som ligner på xCELLigence instrument, med forskjeller i matrisen og elektrode konfigurasjoner. Vi har vellykket utført HUVEC invasjon analyser ved hjelp av de åtte-brønners ECIS arrays. Det er viktig å merke seg at den vel-bunn overflateareal er større i de ECIS matriser, som krever et større antall av endotelceller og tumor celler som skal pletteres: 2,5 x 10 5 og 1 x 10 5 celler hhv.
Disclosures
Publikasjonen kostnaden for dette manuskriptet var vennlig levert av Roche Applied Science.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble sjenerøst støttet av midler fra Barnas Cancer Foundation (Baltimore, MD), Brandon Carrington Lee Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) og NIH (R01CA108641).
Vi vil gjerne takke Dr. Anton Wellstein og medlemmer av hans laboratorium for å dele sine erfaringer og hjelpe oss til å optimalisere presentert metoder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP station |  Roche Group |
05469759001 | |
| RTCA control unit | Roche Group |
05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
| E-Plate 16 | Roche Group |
05469830001 | |
| HUVEC cells | Lonza Inc. | CC-2517 | |
| EGM-2 media | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza Inc. | CC-4176 | |
| 0.1% Gelatin in sterile H2O | EMD Millipore | MCPROTO045 |
References
- Klein, C. A. Cancer. The metastasis cascade. Science. 321, 1785-1787 (2008).
- Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).
- Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis. J Pathol. 190, 310-329 (2000).
- Bacac, M., Stamenkovic, I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).
- Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature. 441, 444-450 (2006).
- Kramer, R. H., Nicolson, G. L. Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
- Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).
- Whipple, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement. Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).
- Boyd, J. M. A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals. Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).
- Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).
- Ren, L. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene. 28, 792-802 (2009).
