Summary
نقدم طريقة للمناعي لونين من الجذر الظهراني الأنسجة العقد التالي محواري إصابة. ويمكن استخدام النهج لتحديد مواقع محددة ملزمة عامل النسخ والتعديل اللاجينية الهامة هيستون والحمض النووي للتجديد المحاوير بجروح في كل من الجهاز العصبي المحيطي والمركزي.
Abstract
المحاوير في الجهاز العصبي المركزي (CNS) لا تجديد في حين أن أولئك في الجهاز العصبي المحيطي (PNS) لا تتجدد على نطاق محدود بعد الاصابه (تنغ وآخرون ، 2006). فمن المسلم به أن يتم تنشيط البرامج الترانسكربتي ضرورية لنمو وneurite محواري عند الاصابة في الجهاز العصبي المحيطي (Makwana وآخرون ، 2005). إلا أن الأدوات المتاحة لتحليل الخلايا العصبية في الجسم الحي تنظيم الجينات محدودة وصعبة في كثير من الأحيان.
في العقد الجذرية الظهرية (DRG) تقدم نموذجا ممتازا إصابة النظام لأن معصب كلا من الجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي من محوار متشعبة مصدره سوما نفسه. والعقد يمثل مجموعة متميزة من الهيئات الخلية حيث تحدث عن الأحداث النسخي ، وبالتالي توفير منطقة محددة بوضوح من النشاط الترانسكربتي التي يمكن بسهولة وإزالته من بتكاثر الحيوانات. وينبغي أن إصابة الألياف العصبية في الجهاز العصبي المحيطي (مثل العصب الوركي) ، حيث تجدد المحاور لم يحدث ، تكشف عن وجود مجموعة من برامج النسخ التي تختلف عن تلك الاستجابة لاصابة مماثلة في الجهاز العصبي المركزي ، حيث التجديد لا يأخذ مكانه (الحبل الشوكي على سبيل المثال ). ويمكن وصف مواقع لعامل النسخ ملزمة ، وتعديل هيستون الحمض النووي الناجم عن إصابة الجهاز العصبي المركزي أو الجهاز العصبي المحيطي إما باستخدام لونين مناعي (رقاقة).
هنا ، نحن تصف بروتوكول الشذرة الثابتة باستخدام الأنسجة DRG الماوس التالية محواري إصابة. هذا المزيج يوفر وسيلة قوية لتحديد خصائص بيئة لونين المؤيدة للتجديد اللازمة لتعزيز تجدد المحاور.
Protocol
1. الوركي واصابة في العمود الظهري العصبية
- يتم وضع الحيوان على منشفة الجراحية وتحت عليه thermopad موجود في جميع أنحاء الإجراء الحفاظ على درجة حرارة الجسم من الماوس عند 37 درجة مئوية. جميع الحيوانات هي تخدير للجراحة مع إدارة مستمرة isoflurane 2 / الإخراج. يتم تعقيمها الأدوات الجراحية قبل الإجراء.
- لإصابة الوركي ، وحلق كل من الخلف بعناية ، واكتمال إزالة الشعر مع مزيل الشعر عامة قبل تطهير الجلد بالكحول تليها 3 مرات Betadyne.
- ما يتعرض له العصب الوركي من خلال جعل شق 4 ملم والخلفي الموازي للعظم الفخذ في منتصف الفخذ خلال الجلد والعضلات من خلال نشر وبصرف النظر عن الفخذية ذات الرأسين مع ملقط الغرامة.
- العصب الوركي يتعرض المصاب بعد ذلك ، ويتم إغلاق الجلد مع مقاطع خياطة اثنين.
ملاحظة : يتم إجراء شق نفسه لفضح العصب الوركي ، ولكن مغلقة خياطة الجرح ترك العصب سليما للضرر صورية.
- لاصابة في العمود الظهري ، وحلق ذقنه بعناية الجزء الخلفي من الماوس ، والانتهاء من إزالة الشعر مع مزيل الشعر عامة قبل تطهير الجلد مع رذاذ الكحول / ممغنطة.
- يتعرض الحبل الشوكي عن طريق شق 2.5 سم من حوالي T7 إلى T13. وتنتشر على الجلد على حدة ، ويتم إزالة النسيج الضام على طول فقرة من T9 إلى T11.
- يتم تنفيذ استئصال الصفيحه على مستوى T10
ملاحظة : بالنسبة لمعظم التجارب ، يعتبر استئصال الصفيحه الاصابة الشام.
- تضاف بضع قطرات من Xylocain للأنسجة الحبل لتخدير ، وإزالة جافية ، مع إيلاء اهتمام لا للمس الحبل الشوكي.
- يصاب الأعمدة الظهرية وخياطة العضلات وثيق ، مع إيلاء الانتباه مرة أخرى على عدم لمس الحبل الشوكي. أخيرا ، يتم خياطة الجلد مغلقة مع مقاطع خياطة. وينبغي أن تدار البوبرينورفين (0.1 وزن الجسم ملغ / كلغ) مرتين يوميا لمدة 48 ساعة أو حتى لم تعد هناك حاجة.
2. عبر ربط
- تشريح DRG L4 L5 من الفئران والجرحى بعد euthanization. جمع ما مجموعه 16 DRG في الجليد الباردة HBSS مثبطات الأنزيم البروتيني + كوكتيل (2 و 2 DRG جرح الشام من كل حيوان لما مجموعه 4 الحيوانات).
- DRG الطرد المركزي لفترة وجيزة ، ثم إزالة بعناية HBSS وإضافة 500 ميكرولتر من الفورمالدهيد + 1 ٪ في برنامج تلفزيوني الكوكتيل ومثبطات الأنزيم البروتيني احتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
خطوة حاسمة. استخدام الطازجة والبيولوجيا الجزيئية الصف الفورمالديهايد.
- إضافة 125 ملم من جليكاين لوقف التثبيت واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة ، نضح قبالة العازلة ، ويغسل النسيج مرتين مع 500 ميكرولتر الجليد الباردة + كوكتيل PBS مثبطات الأنزيم البروتيني.
3. إعداد نواة لونين والقص
- نضح قبالة PBS ، إضافة 400 ميكرولتر من تحلل SDS العازلة ، ونقل إلى أنبوب microcentrifuge قبل المبردة ، وتعطيل الأنسجة مع ما يقرب من 30 جلدة مع micropestle.
خطوة حاسمة. انحلال واختلال النسيج حيوية لتحقيق عائد جيد من لونين crosslinked.
- يصوتن العينة مع 8 البقول ، كل 10 ثانية في الانتاج بنسبة 70 ٪ (Bandelin ، Sonoplus GM70).
تحذير ، ويجب أن يكون الأمثل والقص من لونين للصوتنة معينة إعداد ويجب أن يتم التحقق السليم للتجزئة لونين قبل تشغيل التجربة الفعلية للملكية الفكرية (انظر القسم 3).
ويمكن أيضا ملاحظة. تجزؤ من لونين ستؤديها الهضم micrococcal (MNase) nuclease. وكقاعدة عامة ، يفضل تجزئة للأنسجة التي صوتنة الثابتة ، في حين يفضل الهضم MNase الأصلي للأنسجة مناعي لونين. عبر ربط ، ويمكن تخزينها لونين في المنفصمة -80 درجة مئوية لتصل إلى 2 أشهر ، ولكن تجنب تكرار تجميد / الذوبان دورات.
4. تحليل الهضم لونين (مستحسن)
- إزالة 10 ميكروليتر من عينتك لونين المنفصمة لتحليلها. إضافة 200 ملم من كلوريد الصوديوم في العينة وعكس عبر الارتباط يحتضنها عند 65 درجة مئوية لمدة 2H.
- تنقية الحمض النووي (انظر القسم 8) وتشغيل agarose هلام 1 ٪. وينبغي أن تكون مجزأة الحمض النووي يصل طولها إلى حوالي 200-1000 سنة مضت (الشكل 1).
قد تنبيه. الإفراط في تفتيت لونين يؤدي إلى انخفاض إشارة ، في حين أن تجزئة غير مكتملة سوف يؤدي إلى تقلص القرار وخلفية ازدياد.
5. مناعي
- تحديد عدد من ردود الفعل مناعي (انظر الملاحظة أدناه) ، ويقسم بالتساوي في أنابيب عينات جديدة. جعل حجم كلما يصل إلى 500 ميكرولتر مع العازلة الشذرة مثبطات الأنزيم البروتيني + كوكتيل.
- إزالة 5 ميكرولتر من عينتك المخفف ونقل في أنبوب جديد. هذا هو نموذج الإدخال 1 ٪ ، وسيتم تخزينها في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها (المادة 7).
- لكل مناعي ، إضافة الأجسام المضادة المناسبة أو العادي السيطرة على احتضان IgG و 4 درجات مئوية خلال الليل مع التناوب.
ملاحظة. متى يجب تحديد عدد مناعي ، ومراقبة إيجابية (مثل الأجسام المضادة هيستون H3) والسيطرة السلبية (مفتش عادي) ينبغي النظر فيها. كمية من الأجسام المضادة المستخدمة لكل الملكية الفكرية يتفاوت بين الأضداد ، ويجب أن تحدد تجريبيا. ومع ذلك ، فإنه عادة ما يكون ضمن مجموعة من 2-10؟ ز / مناعي.
- على الضد الخاص immunoprecipitate / بروتين / الحمض النووي معقد ، إضافة 30 ميكرولتر من رقاقة الخرز الصف بروتين G المغناطيسي واحتضان لمدة 2 ساعة بمعدل 4 درجات مئوية مع التناوب.
6. غسل
- لالمنسدلة معقدة الكروماتين حبة محدد ، وضع على الرف الأنبوب المغناطيسي. انتظر حتى حل واضح وإزالة بعناية ثم طاف بك.
- إضافة 1 مل من يغسل الملح منخفضة (العازلة CHIP) إلى الخرز واحتضان عند 4 لمدة 3-5 دقائق مع دوران درجة مئوية ، ثم المنسدلة الخرز ونضح قبالة يغسل كما في الخطوة 6.1. كرر هذه الخطوة من أجل ما مجموعه 3 يغسل.
- إضافة 1 مل من الملح العالية العازلة يغسل (العازلة CHIP + 350 مم كلوريد الصوديوم) إلى الخرز واحتضان لمدة 3-5 دقائق مع التناوب ، ثم المنسدلة الخرز ونضح قبالة يغسل كما في الخطوة 6.1.
7. شطف والتراجع عبر ربط
- أخذ عينات المدخلات الخاصة بك من -20 درجة مئوية ، إضافة 150 ميكرولتر من شطف العازلة الشذرة وتوضع جانبا في درجة حرارة الغرفة حتى الخطوة 7.5.
- إضافة 150 ميكرولتر من 1X الشذرة العازلة شطف IP لكل عينة من الخطوة 6.3.
- وضع الأنابيب في thermomixer وأزل لونين من الخرز التي يحتضنها العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع vortexing لطيف.
- المنسدلة الخرز على الرف المغناطيسي ، ونقل بعناية لونين eluted (طاف) في أنابيب جديدة.
- على جميع الأنابيب ، بما في ذلك نماذج الإدخال ، إضافة 200MM من كلوريد الصوديوم و 40 ميكروغرام / رد فعل K بروتين واحتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
ملاحظة يمكن تنفيذ الخطوة شطف في درجة حرارة الغرفة ، أيضا ، لكنها قد لا تكون فعالة قدر.
8. الحمض النووي الانتعاش
- إضافة 1 حجم الكلوروفورم الفينول / لعينات من الخطوة الخاص 7.5 و دوامة لمدة 30 ثانية.
- الطرد المركزي في السرعة القصوى في microcentrifuge في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- استعادة بعناية مائي (العلوي) في المرحلة أنابيب جديدة ، إضافة 1 حجم كلوروفورم إلى المرحلة المائية ، ودوامة لمدة 30 ثانية.
- الطرد المركزي في السرعة القصوى في microcentrifuge في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- بعناية استعادة مائي (العلوي) مرحلة جديدة في أنابيب ، ثم تضاف 300mM من NaOAc ، 20 ميكروغرام / رد فعل من الجليكوجين ، و 2.5 حجم الجليد الباردة الإيثانول بنسبة 100 ٪.
هناك حاجة إلى تنبيه ، وإضافة الناقل ، مثل الجليكوجين ، لتعزيز ترسيب الحمض النووي شظايا صغيرة نسبيا الحجم.
- في احتضان -80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لترسيب الحمض النووي.
ملاحظة يمكن أيضا أن يتم تنفيذ الخطوة هطول الأمطار ليلا -20 درجة مئوية.
- الطرد المركزي العينات في السرعة القصوى في microcentrifuge لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إزالة بعناية وطاف غسل الكريات DNA عجل مع 300 ميكرولتر من الجليد الباردة الايثانول 70 ٪.
- الطرد المركزي العينات في السرعة القصوى في microcentrifuge لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إزالة بعناية أكبر قدر ممكن من طاف والسماح للالكريات الهواء الجاف.
- Resuspend في 20 ميكرولتر من العقيمة O. 2 H نماذج جاهزة الآن لPCR ، أو يمكن تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية.
9. ممثل النتائج
ويرد ممثل نتيجة تجربة رقاقة في DRGs التالية الآفة الوركي (الشكلان 1 و 2). أولا ، نعرض الحمض النووي للتجزئة يبلغ طوله حوالي 200-1000 سنة مضت (الشكل 1). ثانيا ، نحن يبرهن على وجود إشارة PCR الشذرة التالية من المروج القريبة من بروتين النمو المصاحب - 43 (GAP - 43) فقط عند إصابة العصب الوركي (4 حارات ، الشكل 2 ، 5 '). أي إشارة PCR موجود عند الحيوان يتلقى اصابة صورية فقط (حارة 3) ، وعند استخدام المصل العادي مفتش للملكية الفكرية (حارة 5 و 6). لاختبار لخصوصية من الأضداد ، قمنا بتحليل عينات من الحمض النووي نفسه ، ولكنها تستخدم مجموعة مراقبة التمهيدي الذي يكتشف في منطقة 3' - UTR من الجينات لدينا مصلحة حيث لا يتوقع حدوث الإشغال. إشارات PCR غائبة عن جميع الممرات (ممرات 3-6 و الشكل 2 ، 3 ') ، باستثناء إشارة الدخل ، تمثل عينات من الحمض النووي غير IP مثل PCR الضوابط القياسية (حارة 1-2 ، فيقوإعادة 2). يمكن تنفيذ هذا الإجراء الشذرة التالية إما اصابة في العمود الفقري الظهري أو الوركي ، الملخصة في التخطيطي (الشكل 3).
هلام Agarose الرقم 1. الحمض النووي عبر ربط عكس التي تم المنفصمة التي صوتنة إلى النطاق المناسب للأطوال شظية.
الشكل 2. نصف الكمية من الأنسجة نتائج PCR DRG التالية آفة العصب الوركي تبين أن البروتين p53 الأسيتيل بربط GAP - 43 منطقة المروج القريبة بعد 48 ساعة من الإصابة في العصب الوركي. PCR السيطرة من المعرض DRG الأنسجة نفسها التي البروتين p53 الأسيتيل لا ربط المنطقة السيطرة على الحمض النووي الموجود في المنطقة ، غير مترجمة 3' (UTR) من الجينات GAP 43 (S = الشام ، وأنا = جرحى).
الشكل 3. رسم تخطيطي عامة توضح موقع من المواقع المصابة على العصب الوركي ، والعمود الظهري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول يوفر طريقة مباشرة لنسأل عن البيئة خلال لونين محواري التجديد في الجهاز العصبي الكبار التالية محواري إصابة. اشتماله على نموذج إصابة DRG مع مناعي لونين للتحقيق في بيئة النسخي وجينية لاحقة للاصابة إما إلى الجهاز العصبي المحيطي أو الجهاز العصبي المركزي. انها مفيدة بشكل خاص بالنسبة للمحققين الذين يرغبون في تميز مواقع الربط المفترضة للعامل النسخ الخاصة بهم المفضلة لديك ، وتحديد ما إذا كان شغل هذه المواقع تحدث استجابة لإصابات. ويمكن أيضا تعديل histones اللاجينية من والدنا في هذه المواقع يمكن رصدها في وقت واحد. يمكن تنفيذ بروتوكول مماثل التالية آفة العصب الوجهي ، حيث يمكن تشريح نوى العصب الوجهي من جذع الدماغ والتي تتم معالجتها بواسطة الرقاقة ، نشرنا عنها سابقا (تيديشي وآخرون ، 2009).
نموذجي بالنسبة لفحوصات مناعي لونين ، واثنين من الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي : (1) كفاءة والتشرذم solubilization مجمع الحمض النووي والبروتينات ، و (2) توفر الأجسام المضادة للبروتين مناعي جيد اهتمامك. واحد القيود التي قد اربكت هاتين الخطوتين هو تدني مستوى بدءا المادية. بالمقارنة مع الهياكل الأخرى مثل الدماغ أو النخاع الشوكي ، DRG توفير كمية صغيرة نسبيا من الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، DRG يتكون من خليط من السكان الخلايا العصبية وكذلك الخلايا الدبقية ، والتي قد يكون لونين بيئات مختلفة. وهذا قد يؤدي إلى إشارات IP غير المتجانسة ، ولكن هذا التحذير موجود في معظم العينات التي اخذت من الجهاز العصبي. وهناك حل محتمل لتنفيذ الشذرة بعد الفلورسنت تنشيط الخلايا العصبية فرز fluorescently المسمى transgenically DRG ، (انظر على سبيل المثال YFP - H الفئران ، وبوجدان وآخرون ، 2004) ، أو المناعية عزل الخلايا العصبية عبر حبات المغناطيسي (لي وآخرون. ، 2005). لكن هذين النهجين يجب التحقق من صحتها عن الشذرة في DRGs وسوف يحتاج على الارجح زيادة كمية المواد البداية.
وقد استخدمنا هذا الأسلوب بنجاح لتحديد المواقع ملزمة لعدة عوامل النسخ وcoactivators في المروج من الجينات المعروفة التجدد المرتبطة بها ، وعلينا استخدام كل نصف الكمية والأساليب الكمية PCR للكشف عن الحمض النووي immunoprecipitated. بالإضافة إلى ذلك يمكن للمرء أن المستقبل لهذا البروتوكول يمكن استخدام ميكروأرس تجانب التالية رقاقة (CHIP على رقاقة) ، بوصفها وسيلة للكشف عن الحمض النووي إشارة النهائي. والشذرة على رقاقة زيادة كبيرة في عدد من المواقع التي تم تحديدها عن طريق النسخ نهج غير متحيز عالية الإنتاجية. ويمكن أن يسمح أيضا لدراسة كيف يمكن لاثنين أو أكثر من عامل النسخ قد تتفاعل بشكل تعاوني على المستوى الجيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر اندريا تيديشي للمساعدة في تحديد التجارب الأولية الشذرة في المختبر ويندنر ريكو لمساهمته في تهذيب شروط الشذرة. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة Hertie ؛ المنحة فورتشن ، جامعة توبنغن ، ومنح دي DFG 1497/1-1 (منح جميع لسيمون دي جيوفاني).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling Technology | 7008 | |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling Technology | 7009 | |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling Technology | 9006 | |
| Magna Grip Rack (8 well) | EMD Millipore | 20-400 | |
| Chloroform | Merck & Co., Inc. | UN 1888 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth Gmbh | CP10.1 | |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling Technology | 7005 | |
| Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 10x HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14185 | |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling Technology | 2650 | |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | Carl Roth Gmbh | A156.1 | |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche Group | 04 693 116 001 | |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling Technology | 10012 | |
| SDS Lysis Buffer | Upstate, Millipore | 20-163 |
References
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y.
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
