Summary
正常细胞在其三维背景的文化代表了一种替代方法研究所需的细胞转化和肿瘤的早期事件。这种方法是用来种植正常的卵巢和输卵管细胞研究在卵巢癌的形成早期事件。
Abstract
卵巢癌是导致妇女因癌症死亡的第五,并已在美国的1 63%的死亡率。卵巢癌的起源的细胞类型仍然是有问题的,可能是卵巢表面上皮(OSE),或输卵管纤毛2,3远端上皮。培养原代培养的正常细胞在体外将帮助科学家模型的具体变化可能导致卵巢癌,在不同的上皮细胞,从而明确地确定起源的细胞类型。这将允许更精确的生物标志物,具有组织特异性基因的变化的动物模型,并针对本病的更好的预防策略的发展。
保持在海藻酸钠水凝胶中的正常细胞,促进细胞的体外培养中短期内其三维的背景下,允许引进的质粒DNA,RNA干扰,小分子。培养机关,从战略的削减使用手术刀,几种文化,从单一的器官可以产生,从单一的动物实验次数增加派生件。这些削减导致扩散的OSE,这是与卵巢癌的形成相关的排卵模型的各个方面。使用此方法可以培养的细胞类型,如OSE中不生长在塑料表面,并促进正常细胞过程中或在癌症形成4的最早事件进行调查。
海藻酸钠水凝胶可用于支持许多类型的组织5增长。海藻酸钠是一种线性多糖的重复单位,对β- D - mannuronic酸和α- L - guluronic酸可与钙离子交联,导致在一个温和的凝胶行动,不破坏组织6,7组成。像其他三维细胞,如基质胶文化矩阵,海藻酸钠为组织提供机械支持;但是,蛋白质不与海藻酸钠矩阵反应,并因此作为一种人工合成的细胞外基质,不会启动细胞信号5的海藻酸钠功能。海藻酸钠水凝胶漂浮在标准细胞培养液中中, 并支持在体外培养的组织生长的体系结构。
一种方法是提交到海藻酸钠水凝胶,可以在长达两个星期的文化保持的卵巢和输卵管器官件的制备,分离,嵌入。器官培养的蛋白质和RNA样品分析细胞酶的释放,也被描述。最后,主要的细胞类型增长是可能的,没有从小鼠遗传永生,并允许使用基因敲除和转基因小鼠的调查。
Protocol
1。卵巢解剖和组织隔离
- 准备的海藻酸钠0.5%(W / V)的解决方案,准备从该协议的修改后的版本,描述以前5,使用无菌PBS和加热到37 ° C。混合倒置或摇晃,但不旋涡。绘制成1 ml注射器,海藻酸钠与25 G针,并保持在37 ° C。
- 10mm的无菌氯化钙溶液准备组织封装后交联海藻酸钠和温暖至37 ° C。
- 准备1毫升培养液(αMEM+ 5个单位的青霉素和5微克/ ml链霉素),每口井在每个实验24孔板。包括各种药物,多肽,在培养液中或病毒。器官封装前进行转染,2000年与脂质体和质粒DNA四个小时孵化组织在37 ° C
- 解剖动物的器官,删除任何脂肪或残留组织,轻轻一拉,卵巢周围的滑囊膜,切成四大块平分的器官,卵巢或输卵管。动物安乐死的CO 2窒息颈椎脱位。对于输卵管,轻轻地解开组织拉除连接膜和扩展,在相反的方向之前,使用切割钳管的两端。
- 放置到一个单一的海藻酸钠液滴(〜1-3μL),消毒的网状纤维。
- 用无菌镊子,海藻酸钠液滴和中心的液滴,使用产钳或消毒针头移动到一块的器官。
- 反转的雾滴含有网状纤维,用无菌镊子抓,把它倒过来,让重力力成悬滴海藻酸钠器官件(类器官)。
- 塔上的一个10厘米培养皿含有10MM 氯化钙溶液,使溶液放入菜边缘的镊子。
- 孵育2分钟,取出用无菌含有毛孔释放到培养基中额外的10毫米氯化钙2,转让的勺子。多达4个海藻酸凝胶可以被转移到一个含有培养基中板24井的单井。文化部规定的时间内。
2。海藻酸钠降解和细胞集合
- 海藻酸钙凝胶的增溶,孵化中的褐藻胶裂解酶(3.4毫克/毫升)溶解在37 ° C为30分钟或直到凝胶完全溶解在莱博维茨的L - 15媒体的文化。
- 删除从褐藻胶裂解酶的组织。
- 收集的OSE,孵化Leibovitz的L - 15的1小时8媒体与500单位的胶原酶类器官。涡在2个脉冲(2秒涡和2秒休息),中等功率为1分钟1秒脉冲(1秒涡和1秒休息1分钟)。让器官件落入新鲜无菌的离心管底部的离心管和移液器上清。在3000转颗粒卵巢表面上皮离心3分钟。
- 收集的输卵管上皮,切管纵向和地方组织的DMEM培养液的塑料与5个单位青霉素和5微克/ ml链霉素和4%(V / V)FBS的。 3-5天,细胞就会“爬”出来的输卵管间质和组织培养plastic9增长。
3。固定石蜡切片封装机关文化海藻酸钠
- 收集在选定的时间点的培养基从封装珠海藻酸钠。
- Recrosslink海藻酸钠凝胶变硬两分钟,放入无菌10mm 的氯化钙溶液文化。
- 修复器官在含有2%多聚甲醛50毫米蔗糖,10毫米氯化钙2和50毫米的钠cacodylate的海藻酸钠封装,以确保凝胶保持牢固和完全封装在固定的组织。
- 组织处理,嵌入到整个石蜡,用切片机产生5微米的部分节海藻酸钠 - 封装器官培养片。
- 海藻酸钠将被解散,并从幻灯片中删除,如果执行由于热量为基础的抗原修复免疫组织化学。海藻酸钠仍将站在苏木精和曙红染色,伊红染色下。
4。代表性的成果:
三维器官培养的卵巢和输卵管的一个例子是如图1所示。卵巢可切成不同大小的块,和OSE的增殖和迁移到修复的表面,用手术刀切开伤员。在这个过程中,保持正确的方向的OSE相对底层的基质,与封装卵巢的OSE。正如图2所示,削减了一半的卵巢OSE,更彻底封装卵巢相比,卵巢切成宿舍或八分。卵巢创面修复在整个卵巢的情况下,可以研究表面,并可能阐明如何排卵和表面修复诱导卵巢表面改造。
实验的终点取决于所需的信息。使用石蜡切片组织结构,细胞形态,和特定的细胞生长率很容易监测。例如,卵巢表面上皮单层观察7天(图3A),而另外5微克/毫升胰岛素7天诱导卵巢表面上皮细胞过度增殖和形成的多层次培养后在无血清αMEM细胞(图3B)。溴脱氧尿嘧啶核苷加入终浓度在10微米24小时之前,以固定的文化,可以测量细胞的增殖(插图3A和3B)。在无血清αMEM保持文化,约3-5%的OSE进行期间24小时的标签的时期(插图3A)的增殖,而比例较大的颗粒细胞增殖。除了增加胰岛素文化传媒增殖的OSE总OSE,约30%(插图3B)的百分比。 cDNA转染(图3C),可以通过海藻酸钙凝胶与标准的显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的免疫。虽然卵巢表面上皮细胞和初级卵泡的生长和分析提供海藻酸钠机关文化,应该指出的是,次级卵泡成熟,无法生存在这个文化体系(图3D)。个别卵泡成熟海藻酸钠水凝胶矩阵内的文化已在别处 10 。
从整个器官或从特定的细胞类型,用酶降解(图4),可以分析蛋白质或RNA的改变。治疗胶原酶培养卵巢organoids叶完好(图4C),同时允许在得到治疗后的细胞沉淀丰富的OSE底层基质,虽然一些基质细胞也隔离(图4D)。
图1小鼠卵巢三维培养系统,用于传播伤人后的OSE 。一)在显微镜下,布尔萨和周围的脂肪垫被拆除。二)完整的卵巢(海外)输卵管管(T)和脂肪垫(F)的。三)卵巢布尔萨和脂肪垫去除(左)和uncoiled输卵管(右)。四)卵巢或输卵管organoids放入海藻酸钠液滴。五)被投进一个氯化钙溶液交 联形成凝胶的海藻酸钠海藻酸钠包裹organoids。 F)的海藻酸钠封装卵巢类器官。 G)的海藻酸钠封装输卵管类器官。 H)褐藻胶封装organoids在培养基中培养。
图2。卵巢表面细胞角蛋白8测量面积再生。卵巢organoids封装由被削减到八分,季度,半,在BSA的培养基中培养,并用细胞角蛋白8(CK8)抗体的免疫分析测定后的OSE。
图3。海藻酸钠文化系统允许通过生长因子的基因转染到的OSE,但不支持快速增长和成熟卵泡。一)卵巢类器官,7天CK8的表达,这标志着的OSE分析的基础培养基中培养。插图,串行部分BrdU掺入染色。 B)的培养基中加入胰岛素,导致乳腺增生的OSE。插图,串行部分BrdU掺入染色。三)卵巢类器官表达绿色荧光蛋白基因转染。四)海藻酸钠文化系统支持的原始卵泡(红色箭头)的增长,但尚未成熟的次级卵泡(黑色箭头)。
图4。OSE中可以分离分析以下文化。 A)类器官培养中等至2周。二)封装类器官被视为与褐藻胶裂解酶的不完整的类器官。卵巢与CK8染色标记的OSE。三)单独的OSE从底层基质胶原酶治疗类器官。剩余的一块组织与CK8染色切除卵巢表面突出。四)治疗后收集细胞丰富的OSE CK8(红色)染色。 counterstained用DAPI标记细胞核的细胞。
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Discussion
利用海藻酸钠水凝胶立体器官培养系统的发展代表了通用的方法,从多种生物体分析许多不同的组织类型。使用三维文化,可以扩展到组织工程和再生医学等领域,因为它提供了一个支架上的细胞能够增长11。目前,我们的实验室正处于初步研究使用人类卵巢和输卵管组织,但是,人类和非人类灵长类动物的毛囊的文化已被描述12,13。
利用海藻酸钠水凝胶的文化organoids超过其他类型的凝胶,如那些结合胶原蛋白,纤维蛋白,透明质酸,提供了几个优点。海藻酸凝胶在室温和中性pH值,为组织的影响不大凝胶封装类器官 14 。海藻酸钠不与细胞蛋白发生反应,提供组织生长 5的化学惰性支持。凝胶可以被酶降解褐藻胶裂解酶,它不会降低封装的组织,允许15个培养细胞的检索。海藻酸钠水凝胶的三维组织培养使用的缺点之一是随着时间的推移,离子交联水凝胶的机械支持失去的稳定,需要有限的文化时期和再交联海藻酸钠事先固定5。这一协议的关键方面是整个文化的过程中保持不育,以及仔细解剖卵巢和输卵管组织的组织形态,以防止破坏。
卵巢和输卵管,特别适合于这种方法,因为卵巢表面上皮传统的细胞培养塑料培养迅速经历了上皮间质转化,形态变化和细胞死亡,除非永生,例如表达SV40的T / T抗原或端粒酶 16, 17。穷人的经济增长,妨碍正常的OSE塑料潜在的癌前变化的分析。器官培养系统也支持的卵巢表面上皮或输卵管上皮细胞在接触底层的基质细胞,这可能发挥的作用,在正常的和恶性的生理的cells18的增长。在海藻酸钠水凝胶,这些组织类型的文化提供机械支持,以保持三个组织的三维结构,而凝胶本身不与细胞5。
使用这种方法培养卵巢表面上皮细胞或输卵管上皮,让文化的隔离操作所造成的分子和形态学变化的分析。海藻酸钠水凝胶系统,可自由通行的转基因,RNA干扰,和shRNA,以及激素,生长因子 19 。虽然瞬时转染是不特定的OSE,因为这类型的细胞相比,在卵巢内的其他类型的细胞,如颗粒细胞类器官的转染效率较高的外表面的OSE取得。溴脱氧尿嘧啶核苷团在文化时期标签除以细胞在细胞生长的监测变化反应实验条件。然后可以在RNA或蛋白质水平的分子变化决心澄清机制,导致肿瘤的变化。
虽然卵巢癌的确切病因不明,已被证明的一生排卵次数增加与增加卵巢癌的20风险相关。在体内连接排卵卵巢癌的假设分析,提出了许多挑战,在确定的促性腺激素, 增殖和癌变21-23的炎症的贡献。海藻酸钠水凝胶的卵巢和输卵管文化使孤立的,每个组件的直接比较,在卵巢表面上皮细胞和输卵管上皮,导致卵巢癌的起源和从正常细胞肿瘤的进展新信息。
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Disclosures
有没有透露。
Acknowledgments
支持这项工作是由卵巢癌研究基金赠款LT/UIC/01.2011],UIC的临床和转化科学,UIC的癌症中心,国家卫生部授予C06RR15482研究院的中心。
通过AAALAC认证的规定下批准的动物护理和使用委员会在UIC动物保健协议的准则和法规的规定进行了动物实验。这个项目的动物被安置在伊利诺伊州芝加哥大学的生物资源实验室(BRL)阻隔室。的BRL有一个充分的兽医人员,监控动物每天至少两次,并提供动物保健咨询。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Leibovitz L-15 medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
αMEM medium | GIBCO, by Life Technologies | 12000-022 | |
Sodium alginate | NovaMatrix | ||
Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
Polypropylene mesh fiber | McMaster-Carr | 45" wide roll; 0.0041" opening | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
Alginate lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | |
A1603 | Sigma-Aldrich | C9697 | From Clostridium histolyticum |
Bovine serum albumin | MP Biomedicals | 103700 | |
Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | Gibco | |
ITS solution | Roche Group | 11074547001 | Insulin/transferrin/sodium selenite |
Cytokeratin 8 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Use at 1:200 |
DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
Bromodeoxyuridine | Sigma-Aldrich | B50002-1G | Final concentration 10 μM |
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