Summary
Lentivírus são um valioso instrumento de pesquisa para explorar a função do gene, no entanto, os pesquisadores podem querer evitar a produção de codificação lentivírus pantropic conhecida ou suspeita de oncogenes. Como alternativa, apresentamos um protocolo mais seguro para o uso de lentivírus ecotropic em células humanas modificadas para expressar o receptor mSlc7a1 ecotropic.
Abstract
Caule e tumor estudos de biologia celular muitas vezes exigem transdução viral das células humanas com oncogenes conhecidos ou suspeitos, levantando questões importantes de segurança para o pessoal de laboratório. Lentivírus Pantropic, como o comumente usado VSV-G pseudotype, são uma ferramenta valiosa para estudar a função do gene porque pode converter muitos tipos de células, incluindo células não-divisão. No entanto, os pesquisadores podem querer evitar a produção de vírus e centrifugação pantropic codificação oncogenes devido ao maior nível de biossegurança requisitos manuseio e segurança. Vários oncogenes potentes, incluindo c-Myc e SV40 antígeno T grande, são conhecidos por aumentar a produção de células-tronco pluripotentes induzidas (IPSC). Todos os outros conhecidos iPSC-induzir mudanças genéticas (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, p53 e perda da função) também têm ligações ao câncer, tornando-os relativos à segurança relativamente alta também.
Embora estes vírus relacionados ao câncer são úteis no estudo de reprogramação celular e pluripotência, eles devem ser usados com segurança. Para tratar dessas questões de biossegurança, demonstramos um método para a transdução de células humanas com lentivírus ecotropic, com ênfase adicional sobre o custo reduzido e fácil manuseamento. Nós produzimos lentivírus ecotropic com título suficientemente elevado para transduzir superior a 90% do receptor-expressando células humanas expostas ao vírus, validando a eficácia desta abordagem.
Lentivírus é frequentemente concentrada por ultracentrifugação, no entanto, este processo leva várias horas e pode produzir aerossóis infecciosos para humanos pesquisadores biomédicos. Como alternativa, as partículas virais podem ser mais segura sedimentada em células por complexação com sulfato de condroitina e polibrene (CS / PB). Esta técnica aumenta a título funcional viral até 3 vezes nas células que expressam o receptor de forma estável retrovirus murino, com o tempo e custo insignificante acrescentou. Transdução de fibroblastos dérmicos humanos (HDFS) é maximamente melhorada usando CS / PB concentrações aproximadamente 4 vezes menor que o valor ideal relatado anteriormente para linhas celulares de cancro, sugerindo que a concentração de polímero deve ser ajustada para o tipo de célula-alvo de interesse. Nós, portanto, descrever o uso de brometo de tetrazólio-metiltiazolildifenil (MTT) para ensaio de toxicidade do polímero em um novo tipo de célula. Observamos viabilidade equivalente a HDFS após a transdução viral usando complexação de polímeros ou a dose padrão de polibrene (PB, 6 mg / ml), indicando toxicidade aguda mínima.
Neste protocolo, descrevemos o uso de lentivírus ecotropic para superexpressão de oncogenes em células humanas, reduzindo os riscos de biossegurança e aumentar a taxa de transdução. Nós também demonstrar o uso de complexação de polímeros para aumentar a transdução, evitando aerossol de formação de centrifugação das partículas virais.
Discussion
Recombinante gammaretrovirus ecotropic baseado em Moloney vírus da leucemia murina (MLV) e seu receptor mSlc7a1 são bem estudadas e amplamente disponível, tendo sido utilizada por mais de 20 anos para entregar transgenes em células de camundongos. Gammaretrovirus Ecotropic também tem sido usado mais recentemente para entregar oncogenes às células humanas;. No contexto da reprogramação celular, o uso de mSlc7a1 para evitar a geração de vírus amphotropic abrigar oncogenes humanos está bem estabelecida 4,5 No entanto, lentivírus oferece vantagens significativas sobre gammaretrovirus na transdução de populações de células refratário, 6, incluindo células primárias que muitas vezes são alvos desejáveis para a reprogramação, porque o complexo de pré-integração lentiviral permite transdução de não-divisão das células. 7
Lentivírus têm sido produzidos com dezenas de pseudotipos diferentes, incluindo MLV, em um esforço para alterar o tropismo do vírus, toxicidade e outras propriedades. 8 lentivírus ecotropic MLV-pseudotyped tem sido usado para a transdução de células mouse, 9, mas raramente tem sido utilizado em células humanas . 10 Por isso, propomos o uso de MLV-pseudotyped lentivírus ecotropic como um veículo de custo, seguro e eficaz, e altamente eficiente para entregar oncogenes conhecidos ou suspeitos, incluindo celulares fatores de reprogramação, para as células humanas.
É fundamental notar que este protocolo não eliminar totalmente a necessidade de produzir e utilizar lentivírus pantropic, mas sim, este protocolo separa o oncogene (s) de que o vírus pantropic, isolando pesquisadores do potencial de auto-inoculação com câncer relacionados com o vírus. O mSlc7a1 proteína e sua hSlc7a1 homólogo humano são expressos ubiquitously transportadores de aminoácidos sem tumorigenicidade conhecidos ou capacidade de conferir uma vantagem seletiva em células de crescimento destinatário, 11 mSlc7a1 realização de um risco relativamente baixo para incorporação vírus amphotropic. Esta etapa adicional pode ser particularmente útil em laboratórios de vírus falta dedicado ou a cultura de tecidos do nível de biossegurança exigido.
Em algumas situações pode ser possível eliminar completamente o uso de vírus pantropic por transfecting o Slc7a1 plasmídeo diretamente em células-alvo, no entanto, muitas células que seriam alvos úteis desta técnica também são refratários a transfecção. Como alternativa, a capacidade de isolar Slc7a1-transduzidas células pela seleção blasticidin significa que VSV-G lentivírus pseudotyped pode ser usado uma vez para gerar um estoque de células que expressam receptores, após o qual o vírus ecotropic pode ser usada rotineiramente para transduzir essas células para muitos experimentos. Pesquisadores devem sempre seguir as suas orientações de segurança institucional para trabalhar com qualquer lentivírus, independentemente do seu tropismo.
Os títulos de vírus ecotropic alcançado com este protocolo são moderadamente inferiores VSV-pseudotyped vírus, geralmente 10-20% do título de vírus pantropic, de acordo com estudos anteriores. 9 Estes títulos foram medidos em células humanas de maneira estável transduzidas com Slc7a1, de modo a diminuir título observado para o vírus ecotropic pode ser em parte devido a expressão variada do gene do receptor em células-alvo. No entanto, os títulos virais obtidas em nosso protocolo são mais do que suficiente para a maioria das aplicações e levar a transdução de a maioria das células, em alguns casos> 90% das células.
Centrifugação técnicas baseadas são comumente usados para concentrar as partículas virais. No entanto, requer várias horas de centrifugação, gera aerossóis infecciosos, e pode resultar em perda significativa de partículas virais. 12 Como alternativa, a complexação com CS / PB pode ser usado para melhorar a transdução sem alterar tropismo viral. 3 Este método é rápido (5 minutos ) e barato (US $ 0,03 por 10 ml de vírus), enquanto cerca de triplicar o título observados. Nenhum equipamento especial ou reagentes de propriedade são necessários, e observou-se toxicidade aguda após a exposição mínima de HDFS para CS / PB, de acordo com trabalhos anteriores em outras linhagens celulares. 13 Uma desvantagem potencial deste protocolo é que alguns complexos microscopicamente visível polímero aderir as células durante vários dias em cultura. Não podemos descartar a possibilidade de que estes complexos, embora não abertamente tóxicos para as células, pode ter efeitos mais sutis sobre os processos celulares.
Aqui nós descrevemos uma metodologia para a segurança e eficiência transdução de células humanas com fatores oncogênicos. Esta abordagem deve ser de grande utilidade para pesquisadores que estudam oncogenes e biologia de células-tronco, incluindo as células iPS.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Financiamento para este projeto foi fornecido pelo Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pLenti6/UbC/mSlc7a1 | Addgene | 17224 | Murine MLV receptor |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | VSV-G envelope |
| pCMV-dR8.91 | Addgene | D. Trono lab14
Packaging plasmid (equivalent plasmid psPax2 is available from Addgene, Cat. Number 12260) |
|
| pHCMV-Ec–nv | Addgene | 15802 | Ecotropic envelope |
| FUGW | Addgene | 14883 | GFP control plasmid |
| OptiMEM | Invitrogen | 31985 | |
| Fugene HD | Roche Group | 04 709 705 001 | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma-Aldrich | C4384 | |
| Blasticidin S | Fisher Scientific | BP 2647100 | |
| Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | I3021 |
References
- Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation. Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).
- Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. Small- to large-scale production of lentivirus vectors. Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).
- Landazuri, N., LeDoux, J. M. Complexation of retroviruses with charged polymers enhances gene transfer by increasing the rate that viruses are delivered to cells. J Gene Med. 6, 1304-1319 (2004).
- Ohnuki, M., Takahashi, K., Yamanaka, S. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 4, 4A.2-4A.2 (2009).
- Hotta, A. EOS lentiviral vector selection system for human induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 4, 1828-1844 (2009).
- Reiser, J. Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 15266-15271 (1996).
- Cullen, B. R.
- Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).
- Schambach, A. Lentiviral vectors pseudotyped with murine ecotropic envelope: increased biosafety and convenience in preclinical research. Exp Hematol. 34, 588-592 (2006).
- Koch, P., Siemen, H., Biegler, A., Itskovitz-Eldor, J., Brustle, O. Transduction of human embryonic stem cells by ecotropic retroviral vectors. Nucleic Acids Res. 34, e120-e120 (2006).
- Yoshimoto, T., Yoshimoto, E., Meruelo, D. Molecular cloning and characterization of a novel human gene homologous to the murine ecotropic retroviral receptor. Virology. 185, 10-17 (1991).
- Cepko, C. Large-scale preparation and concentration of retrovirus stocks. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.12-Unit 9.12 (2001).
- Doux, J. M. L. e, Landazuri, N., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer. Hum Gene Ther. 12, 1611-1621 (2001).
- Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol. 72, 9873-9880 (1998).
