Summary
アン
Abstract
神経回路が成熟し、洗練されているときに正常な脳の機能は、生後発達にだけでなく、主要な神経経路が確立されている胚発生に依存していますが、。この段階での制御ミスは、自閉症や統合失調症の1,2などの神経および精神疾患につながる可能性があります。多くの遺伝子は出生前の脳で勉強し、多くの発達過程3-5重要な発見されている。しかし、出生後の脳におけるそれらの機能は、マウスでそれらの欠失はしばしば新生児の開発中に致死性につながることもあり、あまり知られていない、と開発の初期段階でそれらの要件は、出生後の分析を阻害する一因。これらの障害を克服するために、これらの遺伝子のfloxed対立遺伝子は、現在マウス6で生成されています。するときは、特定の細胞型で発現するCreリコンビナーゼ、条件付きの削除は生後脳における遺伝子機能を研究するために達成することができることをトランスジェニック対立遺伝子と組み合わせる。しかし、この方法では、それによってマウスの脳内で大規模に遺伝子解析の拡大を制限し、追加の対立遺伝子と適切な遺伝子型を有するマウスを作製するために余分な時間（3〜6ヵ月）が必要です。
ここでは、生後脳の発達で急速にかつ体系的にこれらのfloxed対立遺伝子を研究するためにウイルスにより発現するCreを使用して補完的なアプローチを示しています。新生児の脳の中に組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVs）7,8エンコーディングCreを注入することにより、我々は脳の異なる領域に目的の遺伝子を削除することができます。ウイルス力価を制御し、蛍光タンパク質マーカーを共発現することにより、我々は同時にモザイクの遺伝子の不活性化とスパース神経ラベリングを実現することができます。このメソッドは、分岐、およびタイルだけでなく、シナプス形成と洗練された、開発の初期段階で多くの遺伝子の要件をバイパスし、私たちは軸索と樹状突起の成長を含む生後脳の発達の多くの重要なプロセスでそれらの細胞自律的な機能を、勉強することができます。このメソッドは、我々自身の研究室（未発表の結果）など8,9で正常に使用されており、このようなレンチウイルス9など他のウイルス、、するだけでなく、shRNAまたは支配的に活性なタンパク質10の表現に拡張することができます。さらに、電気生理学でこのテクニックを組み合わせるだけでなく、最近開発した光イメージングツール11で、この方法では、遺伝的経路はマウスとラットにおける神経回路の発達と機能にどのように影響するかを研究する新たな戦略を提供します。
Protocol
1。注射の準備ウィルス
- rAAVsは推奨商用ベンダーから購入したが、彼らはまた、（下の説明を参照）自分の研究室で製造することができる。ウイルス溶液は、typicallyミリリットル当たり〜1 × 10 12ゲノムコピー（GC / ml）の力価で産生され、多数のセルを操作する完全な力価で使用することができる。また、彼らは疎ラベリングの必要なレベルを生成するために希釈することができる。適切な希釈は、ユーザによって決定される必要がありますが、1:10希釈液を開始することをお勧めします。
- 使用直前に氷の上でウイルスを解凍。小（〜250μlの）のPCRチューブにウイルス液を所望の予備希釈量を転送する。組織培養フードに滅菌DPBSの適切な量を使用してウイルス溶液を希釈する。それが必要になるまで氷上に希釈したウイルス溶液を保管してください。
注記：すべてのウイルスの処理は、あなたの機関によって承認されたバイオ安全議定書に従って実施されるべきである
2。注射器の負荷と機器の組立
- 静かにプランジャーを引いて、ガラスの注射器に装填針を接続し、PCRチューブからウイルスソリューションを策定する。空気の非常に小さな気泡が注射器で見ることができるまで、プランジャーを引いて、これは、ソリューションのすべてが注射器になっているとローディング針に残されていないことを示します。また、不活性少量の染料は、それが表示されるように溶液に添加することができます。
注：負荷の針は、通常、他のほとんどのチューブの底に到達する十分な長さではないとして、小さなPCRチューブを使用する必要があります。 - ローディング針を外し、シリンジの保持とそれを固定して、シリンジポンプのシリンジブロックに注射器を置きます。
- ゆっくりとシリンジに結合チューブの一端を挿入し、ニードルホルダーにもう一方の端を差し込みます。ニードルホルダに注射針を挿入します。注射針の端が直接ニードルホルダーの結合チューブの内側の端にお問い合わせください。
- 徐々に結合チューブを介してソリューションをプッシュするために手動でプランジャーを押し下げる。ソリューションの小さな滴が注射針の先端に表示されるまで押し込みます。
- 慎重にプッシャーブロックの隣にあるプランジャーを配置し、プッシャーブロックのブラケットで固定します。
- 注入パラメータを設定します。注入速度は、約8μl/min（〜130nl /秒）でなければなりません;注入量は、通常、1 2ulであり、使用するシリンジのサイズに適したシリンジの直径を（ガイドラインについては、シリンジポンプの取扱説明書を参照してください）]を選択します。
- 〜38 ° Cにホットプレートを設定し、回復期に子犬を保護するためにペーパータオルなどの薄いバリアでカバー。
3。注射の手順と子犬の回復
- IACUC承認されたプロトコールに従って、寒冷麻酔にそれらを施すことにより注射用P0またはP1仔マウスを準備します。氷の上で水と場所でいくつかのペーパータオルを湿らせます。子犬の希望数（4-5）ペーパータオルの上を（それらをうまく避けて保管すること）に置き、軽くそれらは湿らせたペーパータオルでカバーされるように子犬を介して、紙タオルを折りなさい。ゆっくりと紙タオルの上に砕いた氷を少量置き、約5分間子犬をインキュベートする。子犬は、最大15分間氷上に置き、その後、細かい回復することができます。
- 子犬が十分に麻酔した後に、取り付けブロックの上に置いてください（私たちは通常は15ミリリットルチューブを保持している発泡スチロールのブロックを使用）し、注射部位への最適なアクセスのためにそれを配置します。皮質のためにそれは小脳のためにそれが頭蓋骨の後部へのよりよいアクセスを提供するために、ブロックの端の上の子犬の頭を配置するために有用である一方、その腹に動物のフラットをレイアウトするのが最も簡単です。必要に応じて子犬は、バンドエイドと所定の場所に固定されることがあります。
- 針を手動でもう一方の手で、目的のサイトで頭蓋骨を介して挿入されている間片手での子犬の頭をホールド。注入時に動かないようにしっかり肌を引っ張っておくと便利です。皮質の場合、これは将来の注射に役立つので、このような頭蓋骨のラムダ縫合と同様に定義された解剖学的ランドマークの相対的な注射を、作るのに便利です。小脳は上丘へ直接尾横たわって組織の薄いストリップとして頭蓋骨を通して見ることができます。針を挿入するための深さは、個々の動物と系統間で若干異なりますし、針上の所定のマーカーによって測られることができる、しかし、皮質と小脳のために我々は、〜0.5の深さがわかります - 表面から1ミリメートルが通常適している。他のサイトのための挿入深さは、エンドユーザーが実験的に決定されるべきである。
注意：針は簡単に頭蓋骨を貫通してください。そうでない場合、これは動物を傷つけることができるようにむちゃするなよ。針の位置を変え、静かに再試行してください。 - ウイルス溶液を注入する。注入は開始です。ポンプのSTARTボタンを押すか、または使用される圧力インジェクタのモデルに応じて、フットペダルを押すことによってED。フットペダルのない状態で、それは注射に影響を与える可能性のある不必要な手の動きを最小限に抑えるためにボタンを押すと同僚を支援していることをお勧めします。
- 選択したボリュームが注入された後、数秒間の場所に針を保持し、軽くスムーズにスライドさせて針を取り除く。余分な動きを最小限にする場所での子犬の頭を持つようにしてください。注入装置は、エタノールと傷と実験の間に洗浄し、滅菌されているので小さい場合、防腐剤の使用は不要です。
- ° Cの回復、通常、5〜10分間ウォームアップ〜38で設定された温度で覆われたホットプレート上で子犬を置きます。この期間中に、他の子犬を注入し続けることができます。
- 子犬のすべてが回復した後に（彼らはピンクと動くはずです）自宅のベッドの部分を取り、そっとして子犬をこする。グループとして母親に子犬を返します。
注意：これは子犬が母にそれらを戻すために、グループとしてそれらを返す前に、暖かみのある家庭の寝具にさらされていることを確認する非常に重要です。これを怠ると、仔事故または殺害の母親になることがあります。
4。洗浄装置
- 注入が完了し、子犬が自分の母親に返された後は、完全にアセトンまたは70％エタノールで注射器をロードすることによって、注射のセットアップを清掃してください。新鮮な溶液を毎回使用して、注射のセットアップを数回通過ソリューションをフラッシュします。これは、残りのウイルス液を除去し、沈殿になります。アセトンやエタノールは、蒸発する。
注意：アセトンを洗浄には望ましい、しかし、セットアップが等シアノアクリレート接着のようなあらゆるアセトンに敏感なコンポーネントを、使用している場合は、これらステップについては、70％エタノールを使用している。 - 適切なバイオハザード容器に漂白剤と廃棄物と作業エリアを消毒する。
5。分析
- IACUC承認された安楽死の方法を用いて所望の年齢で動物を生け贄に捧げる。灌流固定は、特に成人の動物で、感染した神経細胞の後の可視化を支援するために推奨されます。
- 標準的な免疫染色の手順は、蛍光シグナルを増幅するために使用することができます。簡単に言えば、ビブラトームセクションをフローティングさ100μmのPBS +1％トリトンX - 100で透過処理し、PBS +1％トリトンX - 100を10パーセント正常ヤギ血清でブロックされます。セクションは4℃で一晩一次抗体℃で、洗濯、ブロッキングの追加が続くとのブロッキング溶液中でインキュベートする。セクションは、その後、室温で2時間二次抗体でブロッキング溶液中でインキュベートし徹底的に洗浄し、スライド上にマウントし、耐フェードマウントメディアで封入されています。凍結切片にもラベルが付いたニューロンを可視化するために使用することができます、しかし、内因性の蛍光が失われる可能性があります。
6。代表的な結果：
成功した注射の手順では、観察可能な組織の損傷や動物の他の悪影響と、注射部位の領域の神経細胞の堅牢な感染を生成します。図1に示すように、感染の広がりは、様々な解剖学的部位にrAAV8 - Creリコンビナーゼを注射のCre -レポーターマウス（ROSA26R）12で観察することができます。このような皮質と上丘のような特定の地域、への注射は、一般的に隣接する領域（図1A - B）に最小限の拡散と局所感染を生成する。高力価のウイルス液を使用すると、この海馬のような隣接領域の感染症、、可能性が高い（図1A）を発行します。 ROSA26Rのレポーターマウス（図1C - D）の正中線でrAAV8 - Creの小脳注射に示すように典型的に、注射部位の近くに残っているまばらな感染症の低力価のウイルス液の結果、と注射。我々は、その感染を示唆し、rAAV8 - Creの注入後2日以内にROSA26Rレポーターマウスに組換えを再結合を観察している、とレポーター遺伝子の発現は、すべて比較的急速に発生する可能性があります。さらに、我々は正常にfloxed条件対立遺伝子を用いて非ROSA遺伝子座に遺伝子の欠失の効果を研究するためにこのテクニックを使用している、の結果が他の場所で公開されます。
感染した細胞の数は、注入されたウイルス液の力価と相関するはずである。例えば、小脳に異なる蛍光タンパク質を発現two rAAV8ウイルスの高力価のソリューションの組み合わせを注入すると、差動（図2A）ラベルが付いている多くのプルキンエ細胞に感染する。逆に、低力価のウイルス液を注入すると、単一の細胞（図2B）の可視化を支援するために疎な感染症になる可能性があります。蛍光標識されたニューロンは、新鮮なカット、生きている組織（図2B）で直接観察することができますまたはワイドフィールドまたは共同して、後で画像取得のための内因性蛍光シグナルを強化するために免疫染色を行うことができるnfocal蛍光顕微鏡（図2A、図3A - C）。最後に、rAAV8は細かいプロセスの強いラベル（図3A - C）と皮質でのニューロンの様々なタイプのに感染する能力です。
図1：P0でrAAV8 - Creを注入したROSA26Rのレポーターマウスの脳におけるLacZ染色は、Creの活性と感染の場所を示しています。
- 高力価（1 × 10 12 GC / ml）を大脳皮質と上丘への注射を示すP14脳の広い分野矢ビュー。高力価のウイルスを使用すると、隣接する領域にも感染する可能性が高くなります。
- P14皮質の矢状断面では、ウイルスが拡散少ないとローカル感染を示して低力価（1 × 10 11 GC / ml）で注入。
- 低力価との正中線（1 × 10 9 GC / ml）のウイルス液に注入P28の小脳のwholemountビューには、感染がスパースであると一般的に注射部位の近くに残っていることを示しています。
- C言語における小脳の正中矢状図）。一般的にプルキンエ細胞がrAAV8に感染していることに注意してください。
図2：蛍光タンパク質を発現rAAV8の高と低力価で注入によって小脳ラベリング。
- EGFP（緑）とDsRed（赤色）を発現する2つのウイルスの混合感染したP21cerebellumの矢状断面。ウイルスの高力価のミックスは、プルキンエ細胞の多数に感染させた。
- 非常に低力価のウイルス感染からのライブP14小脳のプルキンエ細胞は、解剖直後に撮像。
図3：rAAV8 - DsRedタンパク質によって皮質ラベリング。
rAAV8 - DsRedのP0に感染していたP21皮質の冠状セクションで皮質ニューロンの様々な型の例。
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Discussion
ここで紹介する新生児のウイルスの注射法では、生後脳の発達の研究のための生体モザイクで生成するための簡単かつ迅速な方法を提供します。方法は、プロジェクト6をターゲットに高スループットの遺伝子を介して行われているものとしてだけでなく、現在利用可能なfloxed対立遺伝子を利用しています。のCreのトランスジェニック発現の使用に比べて、このメソッドはfloxed対立遺伝子を持つマウスを実験に直接使用することができるように、種々の細胞型における遺伝子機能をテストするための迅速な方法を提供し、より全体のウイルスの注入手順が完了するまで開始することができます時間の下で行うこと。さらに、感染した細胞の数を容易に個々のニューロンのまばらなラベリングを可能にするウイルスの力価を変えることによって制御することができます。我々は唯一のサンプル画像で神経形態を説明したが、感染した神経細胞の分析は、分岐やタイル、だけでなく、脊椎の形態形成、シナプス開発、軸索と樹状突起の成長を含む多くの重要な発生過程、に拡大することができます。
手続きの三大重要な部分は、注射部位、注射の機器の信頼性、および仔の生存率をターゲットの精度です。第一の態様 - 精度は - 最高の経験を通して学習されます。注入装置の信頼性は1つがない下駄、漏れ、または注射の前に装置を持つ他の問題がないことを確認しなければならないという事実を指す。最後に、仔の生存率は、通常、手順3.7で説明したヒントに従っていれば、この問題ではありません。
この手順の明らかな変更は、異なる遺伝子を発現するウイルスの混合物を使用することです。例えば、2つのウイルス、するrAAV - CreをGFPとするrAAV - RFP、の混合物は、単一の動物でまばらに標識したノックアウト（緑）とコントロール（赤）細胞のモザイクを生成するために注入することができる。これは、同じマウス脳における野生型または変異型対立遺伝子を持つ神経細胞の形態学的解析のために特に有用に、単一細胞の分析のための伝統的な遺伝子ノックアウト上の明確な利点を提供します。保管したいが、それは観察可能な効果を生成するニューロンの大規模な数を操作するために必要となる場合がある行動の研究を、実行する場合にも、しかし、制限することができます。我々は、年齢P4からしかし、我々は一般的に生後3歳（P3）に注射を行うことができますを見つけると頭蓋骨に頻繁に注射針で容易に穿刺に厚過ぎる。特定の年齢で頭蓋骨の厚さは動物から動物に変更することができますが、、ので、この問題は、実験者によって評価される必要があります。
Creリコンビナーゼ発現ウイルスから発現蛍光タンパク質を使用することに加えて、つのloxP - STOP - loxP部位対立遺伝子を有する多くの蛍光レポーターマウスは13を生成されているとfloxed対立遺伝子を組み込むことができます。新しい対立遺伝子を含むことが適切な遺伝子型を有するマウスを得るために必要な時間が増えますが、これらのレポーターマウスは同時にCreリコンビナーゼの活性とラベルの個々のニューロンを監視することができます。
ために組換えrAAVsの選択的な親和性から、別の神経細胞の種類は、特定するrAAVの血清型（図1D）を選択して、解剖学的領域にラベルを付けることができます。特異性は、異なるプロモーターを使用することによって達成することができます。さらに、このようなレンチウイルスのような他のウイルスは、神経細胞10を感染させるために使用することができます。ここでの利点は、これらのウイルスはCreリコンビナーゼでなく、shRNAを、優性活性遺伝子のような他の遺伝物質だけではなく、を表現するために大きなDNAインサートを運ぶことができるということです。さらに、本 方法はまた、条件付きで表現されるのCreラインが十分に確立されていない新たに開発したトランスジェニックラットの14日で使用することができます。最後に、この技術は研究室で確立されると、それはさらに、神経回路の発達と機能における各遺伝子の機能を研究するために生体二光子イメージング11および/ または電気生理学、 のような他の分析ツールと組み合わせることができる。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NIH（NINDS）からRO1助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments, Inc. | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech Laboratories | 632496 | |
| Heating Block | VWR international | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
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