Summary
و
Abstract
وظيفة الدماغ طبيعي يعتمد ليس فقط على التطور الجنيني عندما يتم تأسيس المسارات العصبية الرئيسية ، ولكن أيضا على التنمية ما بعد الولادة عندما نضجت الدوائر العصبية وصقلها. قد Misregulation في هذه المرحلة يؤدي إلى اضطرابات عصبية ونفسية مثل التوحد وانفصام الشخصية 1،2. وقد تم دراسة العديد من الجينات في الدماغ قبل الولادة وجدت حاسمة لكثير من العمليات التنموية 3-5. ومع ذلك ، فإن وظيفتها في الدماغ بعد الولادة غير معروف إلى حد كبير ، ويرجع ذلك جزئيا الحذف في الفئران غالبا ما يؤدي إلى الفتك التنمية خلال حديثي الولادة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى ما يتطلبه المبكر يعيق التنمية في تحليل ما بعد الولادة. للتغلب على هذه العقبات ، ويتم حاليا الأليلات floxed من هذه الجينات في الفئران التي يتم توليدها 6. عندما يقترن الأليلات المعدلة وراثيا التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية recombinase في أنواع معينة من الخلايا ، ويمكن تحقيق الحذف مشروط لدراسة وظائف الجينات في الدماغ بعد الولادة. ومع ذلك ، يتطلب هذا الأسلوب الأليلات إضافية والوقت الاضافي (3-6 أشهر) لتوليد الفئران مع المورثات المناسبة ، مما يحد من التوسع في التحليل الوراثي على نطاق واسع في مخ الفأر.
نحن هنا يبرهن على وجود نهج متكامل يستخدم لجنة المساواة العرقية فيروسي ، وأعرب لدراسة هذه الأليلات floxed بسرعة وبشكل منهجي في تطور الدماغ بعد الولادة. عن طريق حقن الغدة المؤتلف المرتبطة الفيروسات (rAAVs) 7،8 الترميز لجنة المساواة العرقية في الدماغ حديثي الولادة ، ونحن قادرون على حذف هذا الجين من الاهتمام في مناطق مختلفة من الدماغ. من خلال التحكم في عيار الفيروسية وcoexpressing علامة بروتين فلوري ، في وقت واحد يمكن أن نحقق الفسيفساء تعطيل الجينات ووضع العلامات العصبية متفرق. هذا الأسلوب يتجاوز متطلبات التنمية في العديد من الجينات في وقت مبكر ، ويسمح لنا لدراسة الخلايا وظيفتها الحكم الذاتي في العديد من العمليات الحرجة في نمو المخ بعد الولادة ، بما في ذلك النمو محواري والجذعية ، والمتفرعة ، والتبليط ، وكذلك تشكيل المشبك والصقل. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح في المختبر منطقتنا (نتائج غير منشورة) وغيرهم 8،9 ، ويمكن أن تمتد إلى غيرها من الفيروسات ، مثل الفيروسة البطيئة 9 ، فضلا عن التعبير عن shRNA أو البروتينات النشطة المهيمن 10. علاوة على ذلك ، من خلال الجمع بين هذه التقنية مع الكهربية وكذلك في الآونة الأخيرة نموا أدوات التصوير الضوئي 11 ، هذا الأسلوب يقدم استراتيجية جديدة لدراسة كيفية تأثير العصبية الوراثية مسارات التنمية الدوائر وظيفة في الفئران والجرذان.
Protocol
1. التحضير للحقن الفيروسات
- تم شراؤها من بائع rAAVs التجارية الموصى بها ، ولكن يمكن أيضا أنها لن تنتج في معمل المرء (انظر المناقشة أدناه). وينتج عادة الفيروس في حل من عيار 1x10 ~ 12 نسخ الجينوم في الملليمتر الواحد (GC / مل) ، ويمكن استخدامه في عيار الكامل لمعالجة عدد كبير من الخلايا. بدلا من ذلك ، قد تكون مخففة عليهم تنتج المستوى المطلوب لوضع العلامات متفرق. يجب أن يتحدد في تخفيف مناسبة من قبل المستخدم ، ولكن ينصح المخفف 01:10 لبدء.
- ذوبان الجليد وجود فيروسات على الفور قبل استخدامه. نقل المطلوب قبل تخفيف حجم الفيروس إلى حل صغيرة (~ 250μl) أنبوب PCR. تمييع الحل الفيروس باستخدام حجم مناسب لDPBS العقيمة في نسيج الثقافة هود. مخزن المخفف حل فيروس على الجليد حتى الحاجة إليه.
ملاحظة : يجب أن تتم معالجة جميع الفيروسات وفقا لبروتوكول السلامة الأحيائية التي وافقت عليها مؤسستكم
2. تحميل المحاقن ومعدات التجميع
- الاتصال الإبرة التحميل لالمحقنة الزجاج ، ووضع حل الفيروس من أنبوب PCR عن طريق سحب المكبس برفق. سحب المكبس حتى يمكن رؤية فقاعة صغيرة جدا من الهواء في الحقنة ، وهذا يدل على أن جميع من الحل هو في المحاقن وليس اليسار في الإبرة التحميل. بدلا من ذلك ، يمكن إضافة كمية صغيرة من الصبغة الخاملة إلى حل لجعله مرئيا.
ملاحظة : يجب استخدام أنبوب PCR صغيرة مثل الإبرة التحميل هو عادة ليست طويلة بما يكفي للوصول إلى الجزء السفلي من الأنابيب معظم الدول الأخرى. - إزالة الإبرة التحميل ومكان الحقنة على كتلة حقنة من مضخة الحقن ، وتأمين فإنه مع التجنيب المحاقن.
- إدراج بلطف واحدة من نهاية الأنبوب الضام في المحقنة ؛ إدراج الطرف الآخر في ماسك الإبرة. إدراج إبرة الحقن في ماسك الإبرة. وينبغي في نهاية إبرة الحقن الاتصال مباشرة نهاية داخل أنابيب يربط بين حامل الإبرة.
- خفض ببطء المكبس يدويا لدفع حل عن طريق الأنبوب الضام. دفع حتى قطرة صغيرة جدا من الحل واضح في رأس الإبرة الحقن.
- الموقف بعناية الغطاس بجانب كتلة انتهازي وضمان الحصول عليها في مكان مع انتهازي قوس كتلة.
- تعيين المعلمات حقن : معدل الحقن ينبغي 8μl/min حوالي (~ 130nl / ث) ؛ حجم الحقن هو عادة 1 - 2ul ، واختيار القطر المناسب للحقنة حقنة حجم تستخدمه (راجع دليل ضخ حقنة لمبادئ توجيهية).
- تعيين موقد إلى ~ 38 درجة مئوية ، وتغطي مع منشفة ورقية أو حاجز رقيق أخرى لحماية الصغار في مرحلة الانتعاش.
3. الحقن الداخلي والانتعاش الجرو
- إعداد الجراء أو الماوس P0 P1 للحقن عن طريق إخضاعهم لتخدير الباردة بعد بروتوكول IACUC المعتمدة. بلل قطعة مناشف ورقية قليلة من الماء وتوضع على الجليد. ضع العدد المرغوب فيه من الجراء (4-5) على منشفة ورقية (ابقائهم يفصل جيدا) وأضعاف بلطف المناشف الورقية أكثر من الجراء حتى يتم تغطيتها بواسطة منشفة ورقية مبللة. المكان برفق على كمية صغيرة من الثلج المجروش على رأس المناشف الورقية واحتضان الجراء لنحو 5 دقائق. يمكن أن تبقى الجراء على الجليد لمدة تصل إلى 15 دقيقة وبعد ذلك استرداد غرامة.
- بعد الجرو هو تخدير بما فيه الكفاية ، ووضعه على كتلة تركيب (نستخدم كتلة الستايروفوم الذي يحمل عادة 15ml أنابيب) وضعه للحصول على أفضل الوصول إلى موقع الحقن. لأنها أسهل القشرة لوضع مسطح على بطن الحيوان ، في حين لالمخيخ فإنه مفيد لوضع رأس الجرو على مدى حافة كتلة لتوفير وصول أفضل إلى الجزء الخلفي من الجمجمة. قد يكون حصل على الجرو في مكان مع المعونة الفرقة ، اذا شئت.
- عقد رئيس والجرو في مكان واحد بينما يتم إدخال اليد يدويا الإبرة من خلال الجمجمة في الموقع المطلوب مع جهة أخرى. ومن المفيد لسحب الجلد مشددة لمنعها من التحرك خلال الحقن. لقشرة من المفيد لجعل حقن نسبة إلى المعالم التشريحية واضحة المعالم ، مثل خياطة امدا من الجمجمة ، وهذا سيساعد في المستقبل الحقن. ويمكن أن ينظر إليه من خلال الجمجمة المخيخ كما الشريط رقيقة من نسيج الكذب الذيلية مباشرة إلى الأكيمة. العمق الذي ينبغي أن تدرج الإبرة يختلف قليلا بين الفرد وسلالات الحيوانات ، ويمكن قياسه من خلال مؤشرات محددة سلفا على الإبرة ، ولكن لقشرة المخيخ ونجد أن عمق ~ 0.5 -- 1MM من على سطح الأرض هو مناسبة عادة. وينبغي أن تحدد عمق الإدراج لمواقع أخرى تجريبيا من قبل المستخدم النهائي.
ملاحظة : يجب أن تخترق بسهولة إبرة الجمجمة ، وإذا لم يحدث ذلك ، لا يدفع من الصعب جدا لأن هذا يمكن أن تصيب الحيوان. إعادة الإبرة وحاول مرة أخرى برفق. - حقن محلول الفيروس. الحقن هو بدايةاد عن طريق الضغط على زر ابدأ على المضخة أو الاكتئاب دواسة القدم ، واعتمادا على نموذج من الضغط محقن مستخدمة. في حالة عدم وجود دواسة القدم فمن المستحسن أن يكون له زميل مساعدة في الضغط على الزر لتقليل حركات اليد غير الضرورية التي قد تؤثر على الحقن.
- بعد أن تم حقنها وحدة التخزين المحددة ، والحفاظ على الإبرة في المكان لبضع ثوان ثم قم بإزالة الإبرة برفق عن طريق تحريك بها بسلاسة. لا شك أن تعقد رأس الجرو في المكان المناسب للحد من تحركات غريبة. منذ يتم تنظيف معدات الحقن المعقمة وبين التجارب مع الإيثانول وجرح صغير ، واستخدام مطهر غير ضرورية.
- ضع الجرو على موقد مغطاة مجموعة درجة الحرارة في ~ 38 درجة مئوية لتدفئتها للانتعاش ، 5-10 دقائق عادة. خلال هذا الوقت قد يستمر ضخ الجراء الأخرى.
- بعد كل من الجراء قد تعافى (ينبغي أن تكون وردية والانتقال) يأخذ جزء من منزل الأسرة وفرك بلطف الجراء معها. عودة إلى الأم الجراء كمجموعة.
ملاحظة : من المهم جدا للتأكد من الجراء الحارة وتتعرض لمنزل الأسرة قبل إعادتها إلى الأم وإعادتهم كمجموعة. قد فشل في القيام بذلك يؤدي إلى إصابة الأم أو قتل الجراء.
4. معدات التنظيف
- بعد حقن كاملة وأعيد الجراء إلى أمهم ، وتنظيف حقن الإعداد عن طريق تحميل كاملا المحاقن مع الأسيتون أو الايثانول 70 ٪. تدفق حل من خلال الحقن عدة مرات الإعداد ، وذلك باستخدام حلول جديدة في كل مرة. سيؤدي هذا إلى إزالة أي حل الفيروس المتبقية والرواسب. سوف الاسيتون ثم تتبخر أو الايثانول.
ملاحظة : يفضل الأسيتون لتنظيف ، ولكن إذا كان الإعداد الخاص بك يستخدم أية مكونات الأسيتون حساسة ، مثل مواد لاصقة cyanoacrylate ، ثم استخدام الإيثانول بنسبة 70 ٪ لهذه الخطوات. - تطهير منطقة عمل مع النفايات والتخلص التبييض في حاوية an اقية مناسبة.
5. تحليل
- التضحية الحيوانات في سن المطلوب باستخدام أسلوب القتل الرحيم IACUC المعتمدة. فمن المستحسن تثبيت نضح للمساعدة في التصور في وقت لاحق من الخلايا العصبية المصابة ، وخاصة في الحيوانات البالغة.
- ويمكن استخدام إجراءات immunostaining القياسية لتضخيم إشارة الفلورسنت. باختصار ، هي permeabilized 100 ميكرون العائمة المقاطع vibratome مع PBS +1 ٪ تريتون X - 100 وسدت في برنامج تلفزيوني +1 ٪ تريتون X - 100 +10 ٪ مصل الماعز العادية. يتم تحضين المقاطع في عرقلة الحل مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ، تليها إضافية الغسيل والحجب. ثم يتم تحضين المقاطع في عرقلة الحل مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، وغسلها جيدا ، التي شنت على الشرائح وcoverslipped تتلاشى مع وسائل الإعلام المعادية للتصاعد. يمكن أن تستخدم أيضا لCryosections تصور الخلايا العصبية المسمى ، ولكن قد تكون فقدت مضان الذاتية.
6. ممثل النتائج :
وإجراء الحقن ناجحة تنتج العدوى قوية من الخلايا العصبية في منطقة في موقع الحقن مع عدم وجود تلف الأنسجة يمكن ملاحظتها أو غيرها من الآثار السيئة على الحيوان. كما هو موضح في الشكل 1 ، يمكن ملاحظة انتشار العدوى في لجنة المساواة العرقية ، مراسل الفئران (ROSA26R) 12 حقنوا لجنة المساواة العرقية ، rAAV8 في مواقع التشريحية المختلفة. الحقن في مناطق معينة ، مثل القشرة وأكيمة متفوقة ، وتولد عادة مع انتشار العدوى المحلية إلى الحد الأدنى من المناطق المجاورة (الشكل 1A - B). استخدام عالية عيار حل الفيروس يجعل إصابة المناطق المتاخمة لها ، مثل الحصين ، على الأرجح (الشكل 1A). الحقن مع انخفاض النتائج عيار حل عدوى الفيروس في متفرق ، التي لا تزال عادة قرب موقع الحقن ، كما هو موضح في حقن مخيخي من لجنة المساواة العرقية ، rAAV8 في خط الوسط من الفئران مراسل ROSA26R (الشكل 1C - D). وقد لاحظنا في الفئران تأشب مراسل ROSA26R داخل 2 يوما بعد الحقن من لجنة المساواة العرقية ، rAAV8 ، مما يوحي بأن العدوى ، وإعادة التركيب ، والتعبير عن الجينات يمكن أن تحدث المراسل عن بسرعة نسبيا. بالإضافة إلى ذلك ، ونحن قد استخدمت هذه التقنية بنجاح لدراسة الآثار المترتبة على حذف الجينات في مكان غير ROSA باستخدام أليل floxed المشروطة ، وسوف تنشر نتائجها في أماكن أخرى.
يجب أن يكون عدد الخلايا المصابة ترتبط من عيار الحل حقن الفيروسية. على سبيل المثال ، عن طريق الحقن مزيج من الحلول عالية من عيار الفيروسات rAAV8 two معربا عن البروتينات الفلورية مختلفة في العديد من خلايا المخيخ يصيب بركينيي التي وصفت تفاضلي (الشكل 2A). على العكس ، يمكن حقن الفيروس عيار منخفض حل يؤدي إلى الإصابة متفرق للمساعدة في وضع تصور لخلايا واحد (الشكل 2B). ويمكن ملاحظة الخلايا العصبية fluorescently المسمى مباشرة في المقطوفة ، والأنسجة الحية (الشكل 2B) أو يمكن أن يتعرضوا لimmunostaining لتعزيز الإشارات الذاتية الفلورسنت لالتقاط صور في وقت لاحق في الميدان واسعة أو تشاركفلوري nfocal المجهري (الشكل 2A ، الشكل 3A - C). أخيرا ، rAAV8 قادر على إصابة أنواع مختلفة من الخلايا العصبية في القشرة مع وضع العلامات قوية من العمليات الدقيقة (الشكل 3A - C).
الشكل 1 : LacZ تلطيخ في دماغ الفئران مراسل ROSA26R أن حقنوا لجنة المساواة العرقية في P0 - rAAV8 يوضح نشاط لجنة المساواة العرقية ومكان الإصابة.
- حقل واسع من الرأي السهمي في الدماغ يظهر P14 عيار عالية (1x10 12 GC / مل) والحقن في القشرة أكيمة متفوقة. استخدام فيروس عيار عالية يجعل من المحتمل أن تكون أيضا المناطق المجاورة المصابة.
- القسم السهمي من القشرة حقن P14 مع انخفاض عيار (1x10 11 GC / مل) يدل على عدوى فيروس المحلية مع أقل الانتشار.
- رأي wholemount من المخيخ P28 حقنه في خط الوسط مع عيار منخفض (1x10 9 GC / مل) يدل على أن حل فيروس العدوى متناثر ويبقى عادة بالقرب من موقع الحقن.
- السهمي نظرا خط الوسط من المخيخ في C). علما بأن عدد المصابين بهذا المرض خلايا بركينيي فقط rAAV8 عموما.
الشكل 2 : العلامات مخيخي عن طريق الحقن مع التتر العالية والمنخفضة من rAAV8 معربا عن البروتينات الفلورية.
- وهناك قسم من سهمي P21cerebellum المصابة مع مزيج من اثنين من الفيروسات معربا عن EGFP (الخضراء) وDsRed (الحمراء). تم استخدام مزيج من عيار عالية الفيروسات تصيب عددا كبيرا من خلايا بركينيي.
- تصوير خلية بركينيي في المخيخ P14 يعيش من العدوى الفيروسية عيار منخفض جدا مباشرة بعد تشريح.
الشكل 3 : وضع العلامات القشرية التي DsRed - rAAV8.
أمثلة على أنواع مختلفة من الخلايا العصبية في الأجزاء القشرية الاكليلية لحاء P21 أن المصابين DsRed - rAAV8 في P0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والولدان طريقة الحقن الفيروسية المعروضة هنا يوفر وسيلة بسيطة وسريعة لتوليد الفسيفساء في الجسم الحي لدراسة تطور الدماغ بعد الولادة. الأسلوب يستفيد من الأليلات floxed المتوفرة حاليا فضلا عن تلك التي تبذل من خلال الجينات إنتاجية عالية استهداف المشروع 6. بالمقارنة مع استخدام تعبير المعدلة وراثيا من لجنة المساواة العرقية ، وهذه الطريقة توفر طريقة سريعة لاختبار وظائف الجينات في مختلف أنواع الخلايا ، كما يمكن استخدام الفئران التي تحمل صبغيات floxed مباشرة للتجارب ، وإجراء حقن فيروس كامل من البداية إلى النهاية يمكن ان يكون أنجزت في أقل من ساعة. بالإضافة ، يمكن أن يكون عدد من الخلايا المصابة السيطرة عليها بسهولة عن طريق تغيير عيار للفيروس ، والذي يسمح العلامات متفرق من الخلايا العصبية الفردية. على الرغم من أننا صفها فقط مورفولوجيا الخلايا العصبية في عينة من الصور ، يمكن توسيع التحليل من الخلايا العصبية المصابة إلى العديد من العمليات التنموية الهامة ، بما في ذلك النمو محواري والجذعية ، ومتفرعة والتبليط ، فضلا عن التنمية متشابك مثل التشكل العمود الفقري.
الأجزاء الثلاثة الأكثر أهمية من هذا الإجراء هي الدقة في استهداف موقع الحقن ، والاعتماد على معدات الحقن ، والبقاء على قيد الحياة من الجراء. وعلم أفضل من خلال التجربة -- الجانب الأول -- الدقة. موثوقية معدات الحقن يشير إلى حقيقة أن واحدا يجب التأكد من عدم وجود السدادات ، والتسريبات ، أو غيرها من المشاكل مع المعدات قبل الحقن. أخيرا ، بقاء الجراء هو عادة ليست مشكلة إذا ما اتبعت النصائح المذكورة في الخطوة 3.7.
تعديلا واضح من هذا الإجراء هو لاستخدام مزيج من فيروسات التعبير عن جينات مختلفة. على سبيل المثال ، يمكن حقن مزيج من اثنين من الفيروسات ، rAAV - لجنة المساواة العرقية ، وGFP rAAV RFP ، لإنتاج لوحة فسيفسائية من خروج المغلوب المسمى قليلة (الخضراء) والخلايا التحكم (الحمراء) في حيوان واحد. وهذا يوفر ميزة واضحة على مدى بالضربة القاضية جين التقليدية لتحليل الخلايا واحدة ، مما يجعلها مفيدة بشكل خاص للتحليل الصرفي من الخلايا العصبية مع نوع البرية أو الأليلات الطافرة في مخ الفأر نفسه. هذا يمكن أيضا أن يكون الحد ، ومع ذلك ، إذا كان أحد يرغب في إجراء الدراسات السلوكية ، والتي قد تكون ضرورية لمعالجة عدد كبير من الخلايا العصبية لإنتاج تأثير ملحوظ. نجد أننا يمكن أن تؤدي عموما الحقن بعد الولادة حتى سن 3 (P3) ، ولكن من العمر وP4 على الجمجمة في كثير من الأحيان سميكة جدا لثقب الإبرة بسهولة مع الحقن. سمك الجمجمة في سن معينة يمكن أن تختلف من حيوان إلى حيوان ، ومع ذلك ، لذلك يجب أن يتم تقييم هذه المسألة من قبل المجرب.
بالإضافة إلى استخدام البروتينات الفلورية وأعرب عن لجنة المساواة العرقية ، معربا عن الفيروس ، ولدت العديد من الفئران مراسل الفلورسنت مع الأليلات loxP للتوقف وقد تم loxP 13 ، ويمكن دمجها مع أليل floxed. بما في ذلك على الرغم من أليل جديد يضيف الوقت اللازم للحصول على الفئران مع المورثات المناسبة ، يمكن لهذه الفئران مراسل مراقبة لجنة المساواة العرقية في الوقت نفسه نشاط الخلايا العصبية الفردية والتسمية.
بسبب tropism الانتقائي للrAAVs المؤتلف ، ويمكن أن توصف مختلف أنواع الخلايا العصبية في المناطق التشريحية عن طريق اختيار المصلي rAAV معينة (1D الشكل). ويمكن لخصوصية كما حققت باستخدام المروجين مختلفة. بالإضافة ، يمكن استخدام الفيروسات الأخرى ، مثل الفيروسة البطيئة ، لتصيب الخلايا العصبية 10. الميزة هنا هي أن هذه الفيروسات يمكن أن تحمل إدراج أكبر للتعبير عن الحمض النووي لجنة المساواة العرقية ، ليس فقط ولكن أيضا المواد الجينية الأخرى ، مثل shRNA والجينات النشطة المهيمنة. وعلاوة على ذلك ، يمكن أن الطريقة المستخدمة أيضا في الفئران المعدلة وراثيا وضعت حديثا على 14 ، حيث لا خطوط وأعرب مشروط لجنة المساواة العرقية راسخة. أخيرا ، حالما يتم وضع هذه التقنية في المختبر ، فإنه يمكن الجمع بين مزيد من الأدوات التحليلية الأخرى ، كما هو الحال في الجسم الحي اثنين الفوتون التصوير 11 و / أو الكهربية ، لدراسة وظيفة كل الجينات في تطوير الدوائر العصبية ووظيفتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد القومية للصحة RO1 (NINDS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed, | Vector Biolabs | #7060, #7061, custom order | http://www.vectorbiolabs.com |
| Harvard Pump 11 Plus | Harvard Apparatus | #702208 | (No foot pedal port) |
| Retinal Pigment Epithelium Injection Kit | World Precision Instruments, Inc. | RPE-KIT | Contains connective tubing, injection needles (36G), and needle holder |
| NanoFil Syringe, 100μl | World Precision Instruments, Inc. | NANOFIL-100 | Includes reusable loading needle |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP antibody | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed antibody | Clontech Laboratories | 632496 | |
| Heating Block | VWR international | 97042-610 | |
| ROSA26R mouse | Jackson Laboratory | 003309 |
References
- Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
- Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going? Neuron. 67, 728-734 (2010).
- Chedotal, A., Richards, L. J. Wiring the brain: the biology of neuronal guidance. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Shen, K., Cowan, C. W. Guidance molecules in synapse formation and plasticity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).
- Chen, S. Y., Cheng, H. J. Functions of axon guidance molecules in synapse formation. Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).
- Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. A review of current large-scale mouse knockout efforts. Genesis. 48, 73-85 (2010).
- Tenenbaum, L. Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system. J Gene Med. 6, 212-222 (2004).
- Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain. Neuroscience. 138, 501-510 (2006).
- Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain. J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).
- Szulc, J., Aebischer, P. Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA. Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-701 (1999).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).
- Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 467, 211-213 (2010).
