Summary
جرى التحقق من طريقة للحفاظ على ، والكشف عن تسلسل الحمض النووي الريبي ومن فيروسات أنفلونزا الطيور وباستخدام عينات البراز مدد الطبيعي من الطيور. يزيل هذا الأسلوب على ضرورة الحفاظ على سلسلة التبريد ومعالجة الفيروسات المعدية ويمكن تطبيقها في إعداد عالية الإنتاجية 96 - جيدا.
Abstract
فيروسات أنفلونزا الطيور (AIVs) تصيب العديد من الثدييات ، بما في ذلك البشر 1. هذه AIVs متنوعة في مضيفيهم الطبيعية ، وإيواء ما يقرب من جميع الأنواع الفرعية ممكن الفيروسية 2. الأوبئة البشرية بانفلونزا الجذعية أصلا من AIVs 3. وأبلغ العديد من حالات الوفاة البشرية خلال تفشي فيروس H5N1 في السنوات الأخيرة. في الآونة الأخيرة ، سلالة جديدة تتعلق AIV اجتاحت البشر ، مما تسبب في (4) ، "وباء انفلونزا الخنازير. على الرغم من أن تجارة البشر ونشاط النقل ويبدو أن المسؤولين عن انتشار سلالات شديدة العدوى 5 ، ويمكن أيضا نثر يمكن أن يعزى ذلك جزئيا إلى الطيور البرية 6 ، 7. ومع ذلك ، فإن الخزان الفعلي لجميع سلالات AIV والطيور البرية.
في رد فعل على هذا ، وفي مواجهة الخسائر التجارية الشديدة في صناعة الدواجن ، وقد تم تنفيذ برامج للمراقبة واسعة على مستوى العالم لجمع معلومات عن البيئة من AIVs ، وتركيب أنظمة الإنذار المبكر للكشف عن بعض السلالات الشديدة الإمراض 8-12. الأساليب التقليدية تتطلب الفيروسي الفيروسات لتكون سليمة وزراعتها قبل التحليل. هذا يتطلب سلاسل باردة صارمة مع التجميد العميق والثقيلة إجراءات السلامة البيولوجية ليكون في المكان أثناء عملية النقل. ولذلك فإن المراقبة على المدى الطويل يقتصر عادة على محطات قليلة على مقربة من حقل مختبرات مجهزة تجهيزا جيدا. لا يمكن أخذ عينات المناطق النائية ما لم يتم تنفيذ إجراءات معقدة لوجستيا. وقد اعترفت هذه المشاكل 13 و 14 ، واستخدام التخزين والاستراتيجيات البديلة للنقل التحقيق (الكحول أو الجوانيدين) 15-17. مؤخرا ، قدمت كراوس وآخرون 18 وسيلة لجمع وتخزين ونقل عينات AIV ، استنادا إلى ورقة مرشح خاص. اتفاقية التجارة الحرة بين الحفاظ على بطاقات 19 RNA على أساس التخزين الجاف 20 وتجعل مسببات الأمراض غير نشط عند الاتصال 21. وأظهرت هذه الدراسة أنه يمكن استخدام بطاقات اتفاقية التجارة الحرة للكشف عن الحمض النووي الريبي في AIV عكس النسخ PCR والتي يمكن أن تكون متسلسلة والناتجة [كدنا] والجينات وتحديد الفيروس.
في دراسة كراوس وآخرون (18). مختبر عزل من كان يستخدم AIV ، وجرى التعامل مع عينات بشكل فردي. في ملحق المعروضة هنا ، تم اختبار عينات البراز من الطيور البرية من فخ بطة في مرصد الطيور Ottenby (SE السويد) مباشرة لتوضيح جدوى الأساليب في الظروف الميدانية. اصطياد البط وجمع عينة من مسحات المذرقية يتجلى. البروتوكول الحالي يتضمن الارتقاء في التعامل مع تدفق العمل من أنبوب واحد لتصميم 96 - جيدا. وإن كانت أقل حساسية من الطرق التقليدية ، وطريقة تشفير البطاقات توفر تكملة ممتازة لمراقبة خطط كبيرة. أنها تسمح لجمع وتحليل عينات من أي مكان في العالم ، دون الحاجة إلى الحفاظ على سلسلة تبريد أو أنظمة السلامة فيما يتعلق شحن الكواشف الخطرة مثل الكحول أو الجوانيدين.
Protocol
1. اصطياد البط وينظف المذرقية
- فخ تجريب البط من جنس أنس (أو غيرها من الطيور) في قفص من خلال جذب لهم البط إغراء أو الطعام ، ووضعها في صناديق متن بطاقة فردية. يجب أن تبقى وسائل النقل في الوقت مربع إلى الحد الأدنى ، على سبيل المثال ، عن طريق تركيب محطة حقل على مسافة قصيرة إلى الفخ. قد تختلف الظروف اللوجستية في كل دراسة. مشورة وموافقة لجنة أخلاقيات الحيوان ذات الصلة يجب أن يكون سعى لكل جديد انشاء. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا أن تكون عينات صياد الطيور بالرصاص.
- تتخذ من البط من مربع من خلال عقد اجنحته مشددة لجسمها. عينة اسقاط الطازجة ، والتي سوف تكون حاضرة في معظم الحالات ، مباشرة من الجزء السفلي من مربع. يلتقطها مع مسحة معقمة وسائل تطبيق اتفاقية التجارة الحرة إلى بطاقة Whatman. إذا لم يكن كذلك ، إجراء مسح لالمذرقية.
- بدوره البطة على ظهرها. هذا يسمح بالوصول إلى مجرور ويسهل أخذ العينات. مجرور هو بنية جاحظ تقع أسفل البطن ، على مقربة من قاعدة الذيل. يمكن لشخص من ذوي الخبرة والاستمرار عينة من الطيور في نفس الوقت ، وإلا شخص ثان يمكن أن تساعد.
- إدراج بلاستيكية معقمة بعناية الرايون المسحة (كوبان ، إيطاليا) 1 سم تقريبا واجري دوامة طيف من مجرور. لفة المسحة مع السوائل من مجرور على سطح بطاقة Whatman اتفاقية التجارة الحرة. بعد الإفراج قد تم تنفيذ عينات فورية من الحيوان هو مرغوب فيه.
- تجفيف بطاقات اتفاقية التجارة الحرة في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 1 ساعة ، ثم تخزين كل عينة على حدة في أكياس من ورق (مثل المغلفات). من الممكن تخزين في درجة حرارة الغرفة ، وربما مع حبات السيليكا في المناخات الرطبة. يمكن إرسال واستقبال المؤسسات ضباط السلامة الأحيائية تصريح لإرسال بطاقات اتفاقية التجارة الحرة عن طريق البريد العادي ، لأن العوامل الممرضة تصبح خاملة على اتصال مع سطح البطاقة اتفاقية التجارة الحرة.
2. عزل الحمض النووي الريبي الفيروسي
- استخراج المواد بما في ذلك اتفاقية التجارة الحرة بطاقة البراز / المذرقية السائل. ثلاثة أقراص لكمة مع هاريس الناخس 2 ملم ومكان كل تلك في بئر لوحة ريبونوكلياز 96well الحرة. بين كل عينة جديدة ونظيفة والناخس بعناية مع الكحول ، ودقة مسح كيم (Kimtech). دائما استخدام الضوابط الإيجابية والسلبية. ويمكن لمراقبة إيجابية تتألف من سلالة المختبرات تطبيقها حديثا إلى بطاقة اتفاقية التجارة الحرة ، أو عينة الطبيعية التي تعرف أن تسفر عن نتيجة إيجابية. كما سيطرة سلبية ، لكمة من أصل أقراص من اتفاقية التجارة الحرة بطاقة فارغة. بالإضافة إلى ذلك ، يغادر آخر مجانا بشكل جيد لمكافحة PCR في وقت لاحق تجربتك (مع المياه كقالب).
- إضافة 70μl استخراج الحمض النووي الريبي حل سريع (Ambion) والحرارة الختم لوحة (AbGene الحرارية السدادة). احتضان 5 دقائق على لوحة شاكر في درجة حرارة الغرفة مع سرعة قرر أن لا يسبب امتداد (وهذا يعتمد على نموذج لوحة شاكر المستخدمة ؛ اختبار مقدما).
- حمل الفيروسي RNA العزلة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة مع MagMAX - 96 طقم العزل الفيروسي RNA (Ambion). في سطور : أضف 130μl أعد تحلل / حل ملزم (من مجموعة) إلى كل بئر. 50μl نقل المواد المستخرجة اتفاقية التجارة الحرة إلى كل بطاقة جيدا. هزة لوحة 1 دقيقة.
- إضافة 20μl مزيج حبة أعدت (من مجموعة) لكل عينة وتخلط بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. هزة على سرعة تحديد مدة 5 دقائق. وسوف تربط جزيئات الحمض النووي الريبي لحبات المغناطيسي.
- الانتقال إلى لوحة مغناطيسي 96 - جيدا تقف لالتقاط الخرز. اعتمادا على نموذج من الوقوف المغناطيسية المستخدمة ، وهذا يمكن أن يستغرق أكثر من 5 دقائق. عندما تحولت الحل واضحة تماما ، وإزالة وتجاهل طاف. ثم إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
- تغسل حبات مرتين مع الحل (1) وتغسل بمحلول غسيل مرتين 2 (من المجموعة). لكل من خطوات غسل 4 إضافة 150μl الحل على استعداد لغسل كل عينة ، يهز لمدة 1 دقيقة على سرعة تحديد ، نقل إلى لوحة الحامل المغناطيسي ، والتقاط حبات لمدة 5 دقائق (أو حتى حل واضح تماما) ، وإزالة تجاهل طاف. ثم إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي ، إضافة محلول الغسيل المقبل ، وتنفيذ الخطوات غسل سابقا. بعد الخطوة غسل الماضي ، وإزالة ما يصل إلى حل غسل الممكن والهواء الجاف الخرز في درجة حرارة الغرفة في لوحة شاكر 2 دقيقة.
- إضافة 50μl العازلة للشطف (من المجموعة) للافراج عن الحمض النووي الريبي من الخرز ويهز لمدة 4 دقائق على لوحة شاكر. التقاط حبات كما هو موضح سابقا. وطاف الآن يحتوي على الحمض النووي الريبي المعزولة التي هي على استعداد لتقديم الطلبات النهائية.
3. RT - PCR من الجينات مصفوفة AIV
تنفيذ عكس النسخ PCR (RT - PCR) مع نظام من خطوة واحدة RT - PCR الوصول (Promega) في 25 ميكرولتر ردود الفعل (معدلة من كراوس وآخرون Fouchier 18 و 22 آخرون.) :
| Nuclease المياه مجانا | 1.5μl |
| AMV / Tfl5 العازلة 5μl | |
| dNTPs | 0.5μl |
| M52C التمهيدي 22 (10 ميكرومتر) | 2.5μl |
| M253R التمهيدي 22 (10 ميكرومتر) | 2.5μl |
| MgSO 4 (25 ملم) | 7μl |
| AMV عكس الناسخ (5u/μl) | 0.5μl |
| TFL بوليميريز (5u/μl) | 0.5μl |
| عينة الحمض النووي الريبي | 5μl |
PCR في ظروف thermocycler Biometra T1 هي : عكس النسخ الأولية من 45 دقيقة عند 45 درجة مئوية ، تليها تمسخ دقيقة 2 الأولية في 94 و 40 درجة مئوية دورات : 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 56 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، و 68 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. استطالة 7 دقائق إضافية عند 68 درجة مئوية يختتم التضخيم.
4. الكشف عن منظمة العفو الدولية إيجابية العينات وتنقية شظايا المستهدفة من جل
- تحميل 2μl للمنتج PCR مختلطة مع 2μl صبغ التحميل 5X (BioRad) والمياه 6μl على agarose هلام ٪ 1 (روش) ملطخة بروميد إيثيديوم 1 ٪ (2.5μl في جل 100 مل) من أجل الفحص المسبق.
- تشغيل هلام لمدة 1 ساعة على 120V ، جنبا إلى جنب مع الحمض النووي معيار الحجم (100 تحميل EZ BioRad غليان سلم) ، وتصور مع هلام نظام التوثيق. انظر على سبيل المثال في الشكل 1.
- اختيار العينات مع شظايا تتضخم في نطاق الحجم المتوقع (ما بين 200 و 300 سنة مضت بي بي (تفتيت الهدف هو 244 سنة مضت). تحميل كامل حجم تفاعل PCR (التي هي 23μl ~ اليسار) من هؤلاء المرشحين مع 6μl صبغ التحميل 5X على 2 بروميد ٪ إيثيديوم agarose هلام ملون وتشغيله لمدة 2 ساعة.
- وضع الجل على transilluminator الأشعة فوق البنفسجية (Bioblock العلمية) وتفقد البصر. انظر على سبيل المثال في الشكل 2. استئصال عصابات من الحجم الصحيح من هلام مع مشرط وضعها في أنابيب تفاعل الفرد 1.5 مل. تنقية شظايا من هلام ، على سبيل المثال مع Zymoclean جل DNA كيت الاسترداد (الإنزيم للبحوث).
5. التسلسل وتحديد المنتجات PCR
- تنفيذ سانجر تسلسل شظايا الهدف ، على سبيل المثال على التسلسل 3730 ABI ABI الشعري الكبير مع 3.1 صبغ الكيمياء التطبيقية (النظم البيولوجية). إعداد ردود الفعل التسلسل في وحدات التخزين التي تحتوي على 10-20 نانوغرام 10μl هلام تنقية قالب ، [كدنا] 1.75μl العازلة تخفيف 5X ، 0.5μl الكبير بريميكس V3.1 صبغ ، 1 التمهيدي قدما ميكرولتر (M52C 20 ، 10 مم) ، وddH2O. الشروط الدراجات هي : 1 تمسخ دقيقة الأولي ، تليها 25 دورة من 10 ثانية في 96 درجة مئوية ، و 5 درجات مئوية في ليالي 45 و 4 دقائق عند 60 درجة مئوية. تنقية وإعداد رد فعل التسلسل وفقا لبروتوكولات الاتصال الداخلية.
- تحديد متواليات [كدنا] الناتجة ضد قواعد البيانات مثل النوكليوتيدات GenBank23 ، على سبيل المثال من خلال الأدوات القائمة على شبكة الإنترنت مثل الانفجار الذي وقع في المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI ، http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
6. ممثل النتائج :
وأخذت عينات من البط البري (أنس platyrhynchos) في مرصد Ottenby الطيور في ديسمبر كانون الاول عام 2007. من كل البري أجري على عينة على بطاقة اتفاقية التجارة الحرة على النحو المبين في هذا البروتوكول. بعد الشحن ، وأبقي على بطاقات اتفاقية التجارة الحرة في الثلاجة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة سنتين. عزل اختبار بطاقة اتفاقية التجارة الحرة عينة من نفس المختبر في كراوس وآخرون تم تضمين 18 عاما السيطرة الإيجابية ، فضلا عن تسع عشرة أضعاف التخفيفات المتسلسلة منه. اثنان ضوابط السلبية ط) من استخراج بطاقة فارغة اتفاقية التجارة الحرة ، لمعرفة ما إذا كان هناك المرحل من الناخس ، والثاني) RT - PCR التفاعل الذي تم استخدامه في nuclease الماء الخالي كقالب ، لاختبار إذا حدث تلوث أثناء أو استعدادا للتفاعل PCR.
وقد تم تحليل 84 عينة. يمكن العثور على صورة هلام المنتجات PCR من هذه العينات 84 في الشكل 1. ويمكن من عينات طبيعية يمكن ملاحظة العديد من العصابات غير محددة بسبب وجود الملوثات الميكروبية المختلفة في البراز. ومع ذلك ، فإن الهدف جزء من الزوج التمهيدي هو 244 سنة مضت فترة طويلة. تم تحميل كامل PCR للرد حجم مجموعة فرعية من العينات التي تنتج ما يقرب من شظايا في نطاق حجم الصحيح (بين 200 شركة بريتيش بتروليوم و BP 300) على هلام (الشكل 1). يمكن العثور على مثال على أي من العصابات وقطعت من هلام التكميلية في الشكل 1. بالإضافة إلى السيطرة الإيجابية ، واثنين من هذه العينات (69899 و69912) إيجابية من جانب بروتوكول جديد. وكشف البحث BLAST ضد قاعدة بيانات NCBI النوكليوتيدات هويتهم ومنظمة العفو الدولية الجينات مصفوفة (الشكل 3) ، في حين أن جميع الفرق الأخرى تشبه سلاسل الجرثومي الأكثر تطابقا ، أو لم تسفر عن تسلسل للقراءة على الإطلاق.
الشكل 1. صورة هلام من الفحص الأولي للمنتجات PCR 2 منتج PCR ميكرولتر من السيطرة الإيجابية ، قتم تحميلها من التخفيفات يريال مراقبة إيجابية ، واثنين من عناصر التحكم السلبية و 84 عينات المذرقية. وتظهر العينات في 48 لوحة هلام العلوي ، وعينات من 48 لوحة في القاع. السهام الحمراء تشير الممرات هلام تستخدم لمدة 100 سنة مضت DNA معيار الحجم. التوضيح ، الدوائر الحمراء تبين الفرق في مجموعة والحجم المتوقع. دوائر زرقاء تشير إلى amplicon غير محددة (أعلى اليسار) أو الحرفية ديمر التمهيدي أقل من 100 سنة مضت في حجم (أسفل اليمين).
الشكل 2. وقد تم اختيار العينات مع عينات مختارة من شظايا في نطاق الحجم الصحيح. مع فرق ما بين 200 و 300 سنة مضت بي بي (BP تستهدف تفتيت 244). السهم الأخضر يشير إلى السيطرة الإيجابية ، السهمان الحمراء تشير العينات التي تم التأكد من أن تكون إيجابية AIV بمقارنة متواليات [كدنا] بهم إلى قاعدة بيانات NCBI النوكليوتيدات.
الشكل 3. القبض على الشاشة من البحث BLAST ممثل في NCBI. كان هناك تساؤل واحد من [كدنا] تسلسل تم الحصول عليها من شظايا رفعه ضد قاعدة النوكليوتيدات على موقع NCBI. يتم التعرف بشكل صحيح على عينة جزء الجينات مصفوفة منظمة العفو الدولية. لعرض النسخة الكاملة الحجم لهذه الصورة ، انقر هنا.
S1 التكميلية الشكل. وقطعت عصابات من عينات مختارة من استئصاله هلام. أخذت هذه الصورة من هلام المبين في الشكل 1 بعد ما بين 200 مرشح العصابات وغليان 300 من غليان.
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يوفر طريقة إضافية لعينات البراز الشاشة أو ما شابه ذلك لوجود AIV. وقد صممت خصيصا لجعل جمع العينات سريعة وسهلة. هذا يجعل من الممكن للأشخاص أقل المدربين ، مثل الصيادين أو مديري الحياة البرية ، والمساهمة في مراقبة منظمة العفو الدولية. لا سلاسل باردة ينبغي أن تطبق ، على الرغم من تجميد العينات ويوصى حيثما أمكن ذلك. وبعد أيام قليلة من درجة حرارة الغرفة ، على سبيل المثال أثناء النقل إلى المختبر ، لم تكن مشكلة لجزيئات الحمض النووي الريبي على بطاقات اتفاقية التجارة الحرة ، وطالما بقيت هذه البطاقات الجافة. غيرها من نظم التخزين غير المبردة التي يتم تقييمها حاليا من قبل مجتمع البحوث ، مثل الكحول أو 15 أو 16 الجوانيدين ، تتطلب ترتيبات الشحن الخاصة بسبب طبيعتها الخطرة. في المقابل ، فإن الأسلوب بطاقة اتفاقية التجارة الحرة لا تتطلب النقل البحري للمواد الخطرة. ومع ذلك ، وسيلة أخرى للتخزين للاهتمام في هذا الصدد هو RNAlater ™ التي ليست خطرة ، إما 17. يمكن أن يتم تحليل العينات في المختبرات أي الجزيئية القياسية. ليس هناك حاجة إلى معدات خاصة بخلاف المعتاد لتفاعلات PCR وتسلسلها الشعري. ويمكن تنفيذ كافة الخطوات دون مستوى السلامة الحيوية لأن فعلا في جمع العينات والمعطل في العوامل المسببة للأمراض محتملة من النشاط المضاد للبكتيريا وفيروسات من بطاقة اتفاقية التجارة الحرة.
لم تراع عبر تلوث واللاحقة عينات إيجابية كاذبة في تجاربنا مع عينات من الطيور البرية. ومع ذلك ، عند العمل مع RNA PCR وأنه من المستحسن دائما أن تولي اهتماما خاصا لتنظيف أماكن العمل وغرف منفصلة للخطوات السابقة واللاحقة PCR. العمل في غطاء الدخان يقلل من خطر تلوث الهباء الجوي في المختبر. Pipetting الاحتياجات التي يتعين الاضطلاع بها مع نصائح التصفية.
من دراسة سابقة على عينات أخذت في وقت واحد من البط نفسه نحن نعرف أن ستة من عينات 84 كانت ايجابية من قبل الحقيقي التقليدية RT - PCR الأسلوب (24) والقيم ط الحقيقي من RT - PCR المعروفة. العينتين إيجابية الكشف عنها بواسطة القضاء لدينا وسيلة من البط التي كانت القيم ط <30 (يشير إلى وجود نسبة عالية من الحمض النووي الريبي الفيروسي). وكان الأربعة الأخرى التي كانت إيجابية العينات مع بروتوكول القيم التقليدية لا يمكن ط> 30 (أقل تركيزا) ، ويمكن الكشف عنها بواسطة بروتوكول لدينا.
وكانت عينات من الفيروس فقط مع التتر ايجابية عالية نسبيا في مقايسة لدينا وأنه من المرجح أن حساسية الأسلوب هو مصدر عدم الكشف عن عينات إيجابية. كذلك ، كان حجم العينة في الدراسة الحالية منخفضة جدا ويمكن أن تكون طريقة تم تطويرها بالكامل وتقييمها إذا نفذت تجارب أكثر صرامة للرقابة والخروج. ومع ذلك ، إذا كان من هذه العينات التي تم جمعها من مناطق نائية ، فإن التحليل التقليدي لم يكن ممكنا على الإطلاق. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذه النتائج الأولى تنبع من التجارب الرائدة التي تحتاج إلى مزيد من التحسين. فترة التخزين سنتين في الثلاجة العادية -20 درجة مئوية بعد جمع العينات ربما يؤثر أيضا على نوعية RNA الفيروسي. هذا التدهور RNA ممكن هو قضية هامة عند التعامل مع تخزين درجة حرارة الغرفة من الفيروسات المعطلة. العينات المخزنة في السوائل البديلة على النحو المذكور أعلاه تعاني من تدهور كبير مما يؤثر تحليل تمتد أطول من الجينوم الفيروسي 16. على الرغم من عدم اختباره في دراستنا ، فقد أثبتت اتفاقية التجارة الحرة لبطاقات تكون مناسبة تماما للحفاظ على سلامة جزيئات الحمض النووي الريبي RNA في النظم الأخرى التي هي مشابهة جدا لفيروسات أنفلونزا الطيور 25 و 26.
Disclosures
محاصرة والمناولة وأخذ عينات من الطيور تم القيام به بعد التشريعات الوطنية والتي وافق عليها المجلس السويدي للزراعة والأخلاق لجنة البحوث الحيوانية.
Acknowledgments
نشكر Dibbits بيرت لتقديم المساعدة التقنية. وتربية الحيوان وعلم الجينوم الفريق ، جامعة فاغينينغين ، هولندا ، استضافت بسخاء لنا في المختبرات الخاصة بهم. وشكر العاملين في مرصد الطيور Ottenby ، السويد ، لمحاصرة وأخذ عينات من البط البري ، في Hellström ماغنوس وجه الخصوص ، ماركوس دانييلسون ، ماجنوسون كريستوفر اندرسون وستينا. نشكر Sanne سفينسون ، Qvist Jonatan ولكل أكسل Gjöres للتصوير في Ottenby وCamon مانو للتصوير في المختبر. قدم دانيال Bengtson صور بطة جميلة لجزء الفيديو من هذا المنشور. ، ومواد مجانية أخرى من المكتبة العامة في مركز السيطرة على الأمراض صورة الصحة (فيل http://phil.cdc.gov/phil/ كانت تستخدم) : إن صورة مجهرية الإلكترون (رقم 280 ؛ التي كتبها الدكتور إرسكين بالمر) والتوضيح (رقم 11823 ؛ من قبل دوغلاس الأردن) من فيروس الانفلونزا. وقدم الدعم المالي من قبل KNJV (رويال هولندا جمعيه الصيادين) ، وزارة الزراعة الهولندية ، وFaunafonds ومؤسسة Stichting دي Eik صناديق (سواء في هولندا) ، ومجلس الأبحاث السويدي (منحة رقم 2007-20774) والمفوضية الأوروبية Newflubird في تأسيس المشروع. وكانت المواد الكيميائية العزلة RNA هدية سخية من Ambion ، وشركة ، وشركة رنا. هذه هي مساهمة رقم 245 من مرصد Ottenby الطيور.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
| FTA card | Whatman, GE Healthcare | several options | |
| Harris micro punch 2mm with mat | Whatman, GE Healthcare | 1154409 | |
| RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
| Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
| RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
| MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
| One-Step Access RT-PCR system | Promega Corp. | A1250 | or comparable |
| Agarose MP | Roche Group | 1388991001 | multi purpose agarose |
| 5x loading buffer | Bio-Rad | delivered with DNA ladder | |
| EZ load 100 bp ladder | Bio-Rad | 170-8353 | or comparable |
| Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
| 1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
| Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research Corp. | D4001 | or comparable |
| ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |
References
- Pulido, F. The genetics and evolution of avian migration. BioScience. 57, 165-174 (2007).
- Bin Muzaffar, S., Ydenberg, R. C., Jones, I. L. Avian influenza: An ecological and evolutionary perspective for waterbird scientists. Waterbirds. 29, 243-257 (2006).
- Taubenberger, J. K. The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus. Proc. Am. Philos. Soc. 150, 86-112 (2006).
- Butler, D.
- Normile, D. Avian influenza. Wild birds only partly to blame in spreading H5N1. Science. 312, 1451-14 (2006).
- Si, Y. Spatio-temporal dynamics of global H5N1 outbreaks match bird migration patterns. Geospat. Health. 4, 65-78 (2009).
- Si, Y. Environmental factors influencing the spread of the highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in wild birds in Europe. Ecol. Soc. 15, 26-26 (2010).
- Chen, H. Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in Western China. J. Virol. 80, 5976-5983 (2006).
- Gaidet, N. Avian influenza viruses in water birds. Africa. Emerg. Infect. Dis. 13, 626-629 (2007).
- Krauss, S. Influenza in migratory birds and evidence of limited intercontinental virus exchange. PLoS Pathog. 3, e167-e167 (2007).
- Parmley, E. J. Wild bird influenza survey, Canada, 2005. Emerg. Infect. Dis. 14, 84-87 (2005).
- Wallensten, A. Surveillance of influenza A virus in migratory waterfowl in northern Europe. Emerg. Infect. Dis. 13, 404-411 (2007).
- Munster, V. J. Practical considerations for high-throughput influenza A virus surveillance studies of wild birds by use of molecular diagnostic tests. J. Clin. Microbiol. 47, 666-673 (2009).
- Latorre-Margalef, N. Effects of influenza A virus infection on migrating mallard ducks. Proc. R. Soc. B. 276, 1029-1036 (2009).
- Runstadler, J. A. Using RRT-PCR analysis and virus isolation to determine the prevalence of avian influenza virus infections in ducks at Minto Flats State Game Refuge, Alaska, during August 2005. Arch. Virol. 152, 1901-1910 (2007).
- Evers, D. L., Slemons, R. D., Taubenberger, J. K. Effect of preservative on recoverable RT-PCR amplicon length from influenza A virus in bird feces. Avian Dis. 51, 965-968 (2007).
- Forster, J. L., Harkin, V. B., Graham, D. A., McCullough, S. J. The effect of sample type, temperature and RNAlater (TM) on the stability of avian influenza virus RNA. J. Virol. Methods. 149, 190-194 (2008).
- Kraus, R. H. S. Avian influenza surveillance: On the usability of FTA cards to solve biosafety and transport issues. Wildfowl. , 215-223 (2009).
- Smith, L. M., Burgoyne, L. A. Collecting, archiving and processing DNA from wildlife samples using FTA databasing paper. BMC Ecol. 4, 4-4 (2004).
- Rogers, C. D. G., Burgoyne, L. A. Reverse transcription of an RNA genome from databasing paper (FTA). Biotechnol. Appl. Biochem. 31, 219-224 (2000).
- Rogers, C., Burgoyne, L. Bacterial typing: Storing and processing of stabilized reference bacteria for polymerase chain reaction without preparing DNA - An example of an automatable procedure. Anal. Biochem. 247, 223-227 (1997).
- Fouchier, R. A. M. Detection of influenza a viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene. J. Clin. Microbiol. 38, 4096-4101 (2000).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W.
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Muthukrishnan, M., Singanallur, N. B., Ralla, K., Villuppanoor, S. A. Evaluation of FTA cards as a laboratory and field sampling device for the detection of foot-and-mouth disease virus and serotyping by RT-PCR and real-time RT-PCR. J. Virol. Methods. 151, 311-316 (2008).
- Perozo, F., Villegas, P., Estevez, C., Alvarado, I., Purvis, L. B. Use of FTA filter paper for the molecular detection of Newcastle disease virus. Avian Pathol. 35, 93-98 (2006).
