Summary
Une méthode pour préserver, de détecter et de séquence d'ARN à partir des virus grippaux aviaires a été validé et étendu en utilisant des échantillons de fèces naturelle des oiseaux. Cette technique élimine la nécessité de maintenir une chaîne du froid et la manipulation des virus infectieux et peuvent être appliquées dans un de 96 puits à haut débit de configuration.
Abstract
Virus de l'influenza aviaire (AIVs) infectent de nombreux mammifères, y compris les humains 1. Ces AIVs sont divers dans leurs hôtes naturels, abritant presque tous les sous-types viraux possibles 2. Pandémies de grippe humaine à l'origine proviennent AIVs 3. Beaucoup de cas humains mortels au cours des flambées de H5N1 dans ces dernières années ont été signalés. Dernièrement, une souche nouvelle AIV liées balayé la population humaine, provoquant quatre «l'épidémie de grippe porcine». Bien que les échanges humains et de l'activité de transport semble être responsable de la propagation de souches hautement pathogènes 5, la dispersion peut également être attribuée en partie aux oiseaux sauvages 6, 7. Toutefois, le réservoir réel de toutes les souches AIV oiseaux sauvages.
En réaction à cela et face à de graves pertes commerciales dans l'industrie de la volaille, les programmes de surveillance ont été mises en œuvre de grandes globalement de recueillir des informations sur l'écologie des AIVs, et d'installer des systèmes d'alerte précoce pour détecter certaines souches hautement pathogènes 8-12. Les méthodes traditionnelles nécessitent virologiques des virus à être intact et cultivées avant l'analyse. Cela nécessite stricte des chaînes de froid avec des congélateurs et lourdes procédures de biosécurité à mettre en place pendant le transport. Surveillance à long terme est donc généralement limitée à une des stations de terrain proche de quelques laboratoires bien équipés. Les régions éloignées ne peuvent être prélevés si des procédures sont mises en œuvre logistique lourde. Ces problèmes ont été reconnus 13, 14 et l'utilisation du stockage et de stratégies alternatives de transport étudiés (alcools ou guanidine) 15-17. Récemment, Kraus et al. 18 a introduit une méthode pour collecter, stocker et transporter des échantillons AIV, basé sur un papier spécial filtre. ALE cartes 19 préserver l'ARN sur une base de stockage à sec 20 et rendre inactifs les agents pathogènes au contact 21. Cette étude a montré que les cartes FTA peut être utilisé pour détecter l'ARN dans AIV transcription inverse PCR et que l'ADNc résultant pourrait être séquencé les gènes du virus et déterminé.
Dans l'étude de Kraus et al. 18 un laboratoire d'isoler de l'AIV a été utilisé, et des échantillons ont été traités individuellement. Dans le prolongement présentées ici, des échantillons fécaux provenant d'oiseaux sauvages de la trappe de canard à l'Observatoire Ottenby Bird (SE Suède) ont été testés directement à illustrer l'utilité des méthodes sur le terrain. Attraper des canards et la collecte de l'échantillon par écouvillonnage cloacal est démontrée. Le protocole actuel comprend up-scaling du flux de travail d'une manipulation simple tube à une conception de 96 puits. Bien que moins sensible que les méthodes traditionnelles, la méthode de l'ALE cartes fournit un excellent complément aux régimes de surveillance important. Il permet la collecte et l'analyse des échantillons provenant de partout dans le monde, sans la nécessité de maintenir une chaîne du froid ou de règles de sécurité à l'égard de l'expédition des réactifs dangereux, comme l'alcool ou la guanidine.
Protocol
1. Le piégeage de canard et d'écouvillonnage cloacal
- Piège canards barboteurs de l'Anas genre (ou d'autres oiseaux) dans une cage en les attirant avec des canards leurre ou la nourriture, et les mettre dans des boîtes individuelles en carton. Le temps de transport dans la boîte devrait être maintenu au minimum, par exemple, en installant une station de terrain à une courte distance vers le piège. Logistique circonstances peuvent varier dans chaque étude. Les conseils et l'approbation du comité d'éthique pertinents animaux doit être recherchée pour chaque nouveau set-up. Alternativement, également chasseur de tir des oiseaux peuvent être échantillonnés.
- Sortez le canard de la boîte en tenant ses ailes serrées à son corps. Goûtez à une chute frais, qui seront présents dans la plupart des cas, directement à partir du bas de la boîte. Ramassez-les avec un tampon stérile et appliquer le liquide à une carte de Whatman FTA. Si non, effectuer des écouvillonnage cloacal.
- Tournez le canard sur son dos. Cela permet l'accès au cloaque et facilite l'échantillonnage. Le cloaque est une structure saillante située au-dessous de l'abdomen, près de la base de la queue. Une personne expérimentée peut tenir et l'échantillon de l'oiseau dans le même temps, ou bien une deuxième personne peut aider.
- Insérez soigneusement le plastique stérile de rayonne-tige (Copan, Italie) environ 1 cm et faire un tourbillon douceur du cloaque. Rouler l'écouvillon avec les fluides du cloaque sur la surface d'une carte de Whatman FTA. Après l'échantillonnage a été effectué libération immédiate de l'animal est souhaitable.
- Sécher les cartes FTA à la température ambiante pendant au moins 1 heure, puis stocker chaque échantillon séparément dans des sacs en papier (enveloppes, par exemple). Le stockage est possible à température ambiante, éventuellement avec des billes de silice dans les climats humides. L'envoi et la réception des agents des institutions de biosécurité peut permettre d'envoyer des cartes FTA par courrier ordinaire, puisque les agents pathogènes deviennent inactifs au contact avec la surface de la carte FTA.
2. Isolement viral RNA
- Extrait du matériel, y compris les matières fécales carte FTA / fluide cloacaux. Punch trois disques avec un perforateur Harris mm 2 et placer tous ceux dans un puits d'une plaque de 96 puits sans RNase. Entre chaque nouvel échantillon, nettoyer le puncheur soigneusement avec de l'alcool et une précision Kim essuyer (Kimtech). Toujours utiliser des contrôles positifs et négatifs. Un contrôle positif peut consister en une souche de laboratoire fraîchement appliqué à une carte FTA, ou un échantillon naturel qui est connu pour donner un résultat positif. Comme contrôle négatif, punch out disques à partir d'une carte vide ALE. De plus, laisser un autre puits libre pour un contrôle PCR tard dans votre expérience (avec de l'eau en tant que modèle).
- Ajouter 70μl ARN solution d'extraction rapide (Ambion) et la chaleur de la plaque d'étanchéité (ABgene Thermo-Scelleur). Incuber 5 minutes sur un agitateur plaque à température ambiante avec la vitesse déterminée qui ne cause pas de débordement (cela dépend du modèle de plaque agitateur utilisé, test à l'avance).
- Carry virale isolement d'ARN conformément aux protocoles du fabricant avec le Magmax-96 virale isolement d'ARN kit (Ambion). En bref: Ajouter 130μl préparés lyse / solution de liaison (à partir du kit) à chaque puits. Transfert du matériel extrait 50 pl carte FTA à chaque puits. Agiter la plaque pendant 1 minute.
- Ajouter 20 pi mélange préparé billes (à partir du kit) pour chaque échantillon et mélanger par pipetage de haut en bas. Agiter vitesse déterminée pendant 5 minutes. Molécules d'ARN se lient à des billes magnétiques.
- Déplacer la plaque à un champ magnétique de 96 puits pour capter tenir les perles. Selon le modèle du support magnétique utilisé, cela peut prendre plus de 5 minutes. Quand la solution est devenue complètement clair, retirer et jeter le surnageant. Ensuite, retirer la plaque du socle magnétique.
- Laver les billes à deux reprises avec une solution de lavage et deux fois avec la solution de lavage 2 (à partir du kit). Pour chacune des 4 étapes de lavage ajouter 150μl de solution de lavage préparée à chaque échantillon, agiter pendant 1 minute à vitesse déterminée, déplacer la plaque au support magnétique, la capture des billes pendant environ 5 minutes (ou jusqu'à ce que la solution est complètement clair), retirer et jeter le surnageant. Ensuite, retirer la plaque du socle magnétique, ajouter la solution de lavage suivant, et effectuer les étapes de lavage comme précédemment. Après la dernière étape de lavage, enlever la solution de lavage autant que possible et l'air sec des perles à la température ambiante dans le shaker la plaque pendant 2 minutes.
- Ajouter 50 pl de tampon d'élution (à partir du kit) pour libérer l'ARN à partir des perles et secouer pendant 4 minutes sur l'agitateur assiette. Capturez des perles comme décrit précédemment. Le surnageant contient maintenant l'ARN isolé, qui est prête pour les applications en aval.
3. RT-PCR du gène AIV Matrice
Effectuer la transcription inverse PCR (RT-PCR) avec le One-Step RT-PCR d'accès système (Promega) dans 25 réactions ul (ajusté de Kraus et al 18 et Fouchier et al 22..):
| Eau sans nucléase | 1.5μl |
| AMV / Tfl5 tampon 5uL | |
| dNTP | 0.5μl |
| apprêt M52C 22 (10 uM) | 2.5μl |
| apprêt M253R 22 (10 uM) | 2.5μl |
| MgSO 4 (25 mM) | 7μl |
| Transcriptase inverse AMV (5u/μl) | 0.5μl |
| Polymérase TfL (5u/μl) | 0.5μl |
| Échantillon d'ARN | 5uL |
Les conditions de PCR dans un thermocycleur Biometra T1 sont: première transcription inverse de 45 minutes à 45 ° C, suivi par 2 minutes dénaturation initiale à 94 ° C et 40 cycles de: 94 ° C pendant 1 minute, 56 ° C pendant 1 minute, et 68 ° C pendant 2 minutes. Un allongement supplémentaire de 7 minutes à 68 ° C conclut l'amplification.
4. Le dépistage de l'IA et les échantillons positifs pour la purification de fragments ciblés à partir de gel
- Charge 2μl du produit de PCR mélangés avec de la teinture de chargement 2μl 5x (BioRad) et de l'eau 6μl sur un gel d'agarose 1% (Roche) coloré au bromure d'éthidium à 1% (2.5μl par 100 ml de gel) pour un examen préalable.
- Exécutez le gel pendant 1 heure à 120 V, avec un standard de taille d'ADN (BioRad EZ charge de 100 pb échelle), de visualiser avec un système de documentation de gel. Voir un exemple dans la figure 1.
- Sélectionner des échantillons avec des fragments amplifiés dans la gamme de taille attendue (entre 200 pb et 300 pb (fragment cible est de 244 pb). Chargez le volume de réaction PCR entière (dont ~ 23μl sont à gauche) de ces candidats avec le colorant de chargement 6μl 5x sur un 2 bromure d'éthidium% gel d'agarose coloré et courir pendant 2 heures.
- Placer le gel sur un transilluminateur UV (Bioblock Scientific) et inspectés visuellement. Voir un exemple dans la Figure 2. Des bandes d'accise de la taille correcte du gel avec un scalpel et placées dans des tubes de réaction individuelle 1,5 ml. Purifier fragments de gel, par exemple avec le Kit Gel Zymoclean récupération de l'ADN (Zymo Research).
5. Séquencement et identification des produits de PCR
- Effectuer séquençage Sanger des fragments cibles, par exemple sur un ABI 3730 séquenceur capillaire ABI avec Big Dye 3,1 chimie (Applied Biosystems). Préparer des réactions de séquençage dans des volumes 10 ul contenant 10-20 ng purifié sur gel matrice d'ADNc, tampon de dilution 1.75μl 5x, 0.5μl Big Dye V3.1 prémélange, une primaire ul avant (M52C 20, 10 mM), et ddH2O. Cyclisme conditions sont: 1 min de dénaturation initiale, suivie par 25 cycles de: 10 s à 96 ° C, 5 s à 45 ° C et 4 min à 60 ° C. Purifier et préparer la réaction de séquençage selon vos protocoles internes.
- Identifier les séquences d'ADNc résultant des bases de données de nucléotides tels que GenBank23, par exemple en outils du web tels que BLAST au Centre national d'information sur la biotechnologie (NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
6. Les résultats représentatifs:
Canard colvert (Anas platyrhynchos) ont été échantillonnées à Ottenby Bird Observatory en Décembre 2007. De chaque colverts un échantillon sur la carte FTA a été prise comme décrit dans ce protocole. Après l'expédition, les cartes FTA ont été conservés dans un congélateur à -20 ° C pendant deux ans. L'échantillon même carte FTA du laboratoire d'isoler testé dans Kraus et al. 18 a été inclus comme contrôle positif, ainsi que neuf dilutions décuplé série d'elle. Deux contrôles négatifs ont été i) l'extraction à partir d'une carte vide ALE, pour tester si il y avait report de la perforatrice, et ii) RT-PCR dans laquelle l'eau sans nucléase a été utilisé comme modèle, afin de tester si la contamination s'est produite pendant ou en préparation de la réaction PCR.
84 échantillons ont été analysés. Une image de gel des produits de PCR à partir de ces 84 échantillons peuvent être trouvés dans la figure 1. A partir d'échantillons naturels d'une multitude de bandes non spécifiques peuvent être observés en raison de la présence de contaminations microbiennes différentes dans les fèces. Toutefois, le fragment cible de la paire d'amorces est de 244 pb. L'ensemble réaction PCR volume d'un sous-ensemble des échantillons qui produit des fragments dans environ la gamme de taille correcte (entre 200 pb et 300 pb) a été chargé sur gel (figure 1). Une illustration de la fourchette dans laquelle ont été coupés à partir du gel peut être trouvée dans une figure supplémentaire. En plus du contrôle positif, deux de ces échantillons (69 899 et 69 912) étaient positifs par le nouveau protocole. Une recherche BLAST contre la base de données NCBI nucléotides ont révélé leur identité en tant que matrice de l'IA du gène (figure 3), tandis que toutes les autres bandes ressemblait séquences bactériennes les plus près, ou n'ont pas donné une séquence lisible à tous.
Figure 1. Gel d'image d'une sélection préliminaire des produits de PCR. Produit 2 ul PCR de contrôle positif, sdilutions erial du contrôle positif, deux contrôles négatifs et 84 échantillons cloacaux ont été chargés. 48 échantillons sont présentés dans le panneau de gel de haut, et 48 échantillons dans le panneau inférieur. Les flèches rouges indiquent les voies de gel utilisé pour la norme 100 pb de taille d'ADN. À titre d'illustration, les cercles rouges montrent les bandes dans la gamme de taille attendue. Les cercles bleus indiquent un amplicon non spécifiques (en haut à gauche) ou d'un artefact dimère primaire inférieure à 100 pb en taille (en bas à droite).
Figure 2. Des échantillons de sélection des échantillons avec des fragments de la gamme de taille correcte. Avec des bandes entre 200 pb et 300 pb (fragment de 244 pb cibles) ont été choisis. La flèche verte indique le contrôle positif, les deux flèches rouges indiquent les échantillons qui ont été confirmés positifs à l'AIV en comparant leurs séquences d'ADNc de la base de données NCBI nucléotides.
Figure 3. Capture d'écran d'une recherche BLAST au NCBI représentatives. Une des séquences d'ADNc obtenue à partir des fragments excisés a été interrogé la base de données de nucléotides sur le site du NCBI. L'échantillon est correctement identifié en tant que fragment du gène IA Matrix. Pour voir une version pleine grandeur de cette image, cliquez ici.
Figure S1 supplémentaire. Bandes d'échantillons sélectionnés excisé du gel. Cette photo a été prise à partir du gel représenté dans la figure 1, après les bandes candidats entre 200 pb et 300 pb ont été coupés.
Discussion
Le protocole décrit ici fournit une méthode complémentaire à l'écran des échantillons fécaux ou similaires pour la présence de l'AIV. Il a été spécialement conçu pour rendre la collecte d'échantillon rapide et facile. Cela permet aux personnes de moins formés, comme les chasseurs ou les gestionnaires de la faune, de contribuer à la surveillance de l'IA. Pas de chaînes de froid doivent être appliquées, bien que la congélation des échantillons est recommandée lorsque cela est possible. A quelques jours de la température ambiante, par exemple lors du transport vers le laboratoire, ne sont pas un problème pour les molécules d'ARN sur les cartes FTA, aussi longtemps que les cartes sont restées sèches. D'autres systèmes de stockage non-refroidis qui sont actuellement évaluées par la communauté de la recherche, comme l'alcool 15 ou 16 guanidine, nécessitent des dispositions spéciales d'expédition en raison de leur caractère dangereux. En revanche, la méthode carte FTA ne nécessite pas de transport de matières dangereuses. Cependant, un autre support de stockage intéressante à cet égard est RNAlater ™ qui n'est pas dangereux, soit 17. L'analyse des échantillons peut être effectuée dans n'importe quel laboratoire moléculaire standard. Aucun équipement spécial autre que pour les réactions PCR et séquençage d'habitude capillaire a été nécessaire. Toutes les mesures qui pourraient être réalisées sans un niveau de biosécurité, car déjà à la collecte de l'échantillon des agents pathogènes potentiels ont été inactivés par l'activité antibactérienne et antivirale de la carte FTA.
Contamination croisée et ultérieures faux échantillons positifs n'ont pas été observés lors de nos essais avec des échantillons d'oiseaux sauvages. Toutefois, lorsque l'on travaille avec de l'ARN et PCR, il est toujours conseillé de porter une attention particulière à la propreté des lieux de travail et de salles séparées pour les étapes pré-et post-PCR. Travailler sous une hotte diminue le risque de contamination par aérosol dans le laboratoire. Pipetage doit être effectuée avec des conseils de filtre.
Partir d'une étude précédente sur des échantillons prélevés simultanément à partir des canards mêmes, nous savons que six des 84 échantillons étaient positifs par le RealTime traditionnelle méthode RT-PCR 24 et les valeurs Ct de Realtime RT-PCR sont connues. Les deux échantillons positifs détectés par notre méthode de la tige de canards qui avaient des valeurs de Ct <30 (indiquant une forte concentration de l'ARN viral). Les quatre autres échantillons qui étaient positifs avec le protocole traditionnel avait valeurs Ct> 30 (moins concentré) et ne pouvaient pas être détectés par notre protocole.
Seuls les échantillons avec des titres de virus relativement élevé ont été positifs dans notre test et il est probable que la sensibilité de la méthode a été la source de l'échec de détecter tous les échantillons positifs. En outre, la taille de l'échantillon de l'étude actuelle a été très faible et la méthode peut être entièrement développé et évalué si des expériences plus contrôlé et rigoureux sont effectués. Cependant, si ces échantillons ont été collectés dans une zone distante, l'analyse traditionnelle n'aurait pas été possible du tout. De plus, ces premiers résultats proviennent des expériences pilotes qui ont besoin d'une optimisation plus poussée. Une période de deux années de stockage dans un congélateur régulièrement -20 ° C après prélèvement probablement aussi affecté la qualité de l'ARN viral. Cette dégradation possible de l'ARN est une question importante lorsqu'il s'agit de stockage à température ambiante de virus inactivés. Les échantillons stockés dans les liquides alternatifs comme mentionné plus haut souffrent d'une dégradation importante qui a des répercussions analyse des séquences plus longues de l'génome viral 16. Bien que n'étant pas testées dans notre étude, les cartes FTA se sont avérés bien adaptés pour préserver intactes les molécules d'ARN dans les systèmes de l'ARN d'autres qui sont très similaires aux virus de la grippe aviaire 25, 26.
Disclosures
Le piégeage, la manipulation et l'échantillonnage d'oiseaux ont été faits suivants législation nationale et ont été approuvés par le Conseil suédois de l'Agriculture et de l'animal comité d'éthique.
Acknowledgments
Nous remercions Dibbits Bert pour l'assistance technique. L'élevage et du Groupe de génomique, Université de Wageningen, Pays-Bas, nous a généreusement hébergé dans leur laboratoire. Le personnel de l'Observatoire Ottenby Bird, la Suède, est remercié pour le piégeage et l'échantillonnage des colverts, en particulier Hellström Magnus, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson et Stina Andersson. Nous remercions Sanne Svensson, Jonatan Qvist et Per-Axel Gjöres pour filmer au Ottenby, et Mano Camon pour le tournage dans le laboratoire. Daniel Bengtson fourni des photographies de canard magnifique pour la partie vidéo de cette publication. En outre matériau exempt de la Bibliothèque CDC Public Image Santé (PHIL; http://phil.cdc.gov/phil/ ) a été utilisée: La microscopie électronique (n ° 280; par le Dr. Erskine Palmer) et de l'illustration (n ° 11823; par Douglas Jordanie) du virus de la grippe. Un soutien financier a été donné par le KNJV (Royal Netherlands Association des chasseurs), le ministère néerlandais de l'Agriculture, de l'Faunafonds et la Stichting de fiducies Eik (à la fois aux Pays-Bas), le Conseil de recherche suédois (subvention aucune. 2007-20774) et la CE fondée Newflubird projet. Produits chimiques d'isolement d'ARN ont été un généreux don de Ambion, Inc, la compagnie ARN. Ceci est la contribution n ° 245 de l'Observatoire Ottenby oiseaux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
| FTA card | Whatman, GE Healthcare | several options | |
| Harris micro punch 2mm with mat | Whatman, GE Healthcare | 1154409 | |
| RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
| Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
| RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
| MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
| One-Step Access RT-PCR system | Promega Corp. | A1250 | or comparable |
| Agarose MP | Roche Group | 1388991001 | multi purpose agarose |
| 5x loading buffer | Bio-Rad | delivered with DNA ladder | |
| EZ load 100 bp ladder | Bio-Rad | 170-8353 | or comparable |
| Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
| 1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
| Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research Corp. | D4001 | or comparable |
| ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |
References
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