Summary
鳥インフルエンザウイルスから守るための方法、検出し、シーケンスのRNAは、検証され、鳥類から自然な糞便サンプルを用いて延長された。この手法は、クールチェーンと感染性ウイルスの取り扱いを維持する必要性を除去し、96ウェルハイスループットセットアップに適用することができます。
Abstract
鳥インフルエンザウイルス（AIVs）は、ヒト1を含む多くの哺乳動物に、感染。これらAIVsは、ほとんどすべてのウイルスのサブタイプ2を抱いて、彼らの自然宿主では多種多様です。インフルエンザの人間のパンデミックとは、もともとAIVs 3から幹。近年のH5N1発生時に多くの致命的なヒト症例が報告された。最近、新しいAIV関連株は、"豚インフルエンザの流行'4を引き起こし、人間の人口を襲った。人間の売買および輸送活動は、高病原性の菌株5の広がりの原因であると思われますが、分散は、部分的に野鳥6,7に起因することができます。しかし、すべてのAIVの株の実際の貯水池は野鳥です。
このと養鶏産業の厳しい商業的損失の面での反応では、大規模なサーベイランスプログラムは、AIVsの生態に関する情報を収集するために、グローバルに実装されており、一定の高病原性の菌株8-12を検出するための早期警戒システムをインストールする。伝統的なウイルス学的方法は、ウイルスを調べて、分析する前に栽培される必要があります。これは、輸送時のように深い冷凍庫と重いバイオセーフティの手続きに厳格なコールドチェーンを必要とする。長期的なサーベイランスは、したがって、通常、設備の整った実験室の近くにいくつかのフィールドステーションに制限されています。ロジスティック面倒な手続きが実施されていない限り、遠隔地をサンプリングすることができます。これらの問題は、13を認識し、14および代替ストレージと交通戦略の使用は、（アルコールまたはグアニジン）15-17検討されている。最近、クラウスら 18は、特殊なろ紙に基づいて収集する方法、店舗と輸送AIVのサンプルを、導入しました。 FTAカード19は、乾式貯蔵の基準20にRNAを保持し、接点21に不活性な病原体をレンダリングします。本研究では、FTAカードが逆転写PCRでと得られたcDNAを配列決定し、ウイルスの遺伝子と決定できるようAIV RNAを検出するために使用することができることを示した。
クラウスらの研究。18に実験室AIVの分離を使用した、サンプルは個別に処理されていました。ここで紹介する拡張では、Ottenbyバード天文台（SEスウェーデン）で、アヒルのトラップから野生鳥類から糞便サンプルは野外条件下での手法の有用性を説明するために直接試験した。総排泄腔スワブでアヒルとサンプルの収集からキャッチすることが示されている。現在のプロトコルは、単一のチューブの処理から96ウェル設計への作業の流れのアップスケーリングが含まれています。従来の方法よりも感度が低いものの、FTAカードの方法は、大規模な監視スキームに優れたサプリメントを提供します。それは、アルコールやグアニジンのような危険な試薬、の出荷に関してクールなチェーンや安全規制を維持することなく、世界のどこからでもサンプルの収集と分析が可能になります。
Protocol
1。ダックのトラッピングと総排泄腔スワブ
- ルアーのアヒルや食物と一緒にそれらを誘致することでケージの属アナス （または他の鳥）の手を染めて鴨をトラップして、個々のカードボードボックスに入れます。ボックス内の輸送時間がトラップへの短い距離にフィールドステーションをインストールすることによって、例えば、最小限に抑える必要があります。ロジスティックの状況は、各試験で異なる場合があります。適切な動物倫理委員会の助言と承認は、セットアップごとに新しいのために追求する必要があります。別の方法として、またハンターショットの鳥をサンプリングすることができます。
- そのボディにタイトなその翼を保持することによってボックスのアヒルアウトを取る。直接ボックスの底から、ほとんどの場合に存在すると新鮮な落下を、お試しください。滅菌綿棒でそれらをピックアップし、ワットマンFTAカードに液体を適用する。されていない場合は、総排泄腔スワブを行います。
- その背中にアヒルをオンにします。これは、排出腔へのアクセスを許可し、サンプリングを容易にします。排出腔は、尾の付け根に近い腹部、下に位置する突出構造です。経験者は、ホールドとサンプル鳥を同時に、または他の二人目は、支援することができます可能性があります。
- 注意深く滅菌したプラスチック製レーヨン綿棒（コパン、イタリア）約1cmを挿入して、総排出腔の穏やかな渦を作る。ワットマンFTAカードの表面上の総排泄腔からの液体で綿棒を転がし。動物のサンプリングが行われた後、即時釈放することが望ましい。
- 少なくとも1時間室温でFTAカードを乾燥させ、その後、紙の袋（例えば封筒）で個別に各サンプルを格納する。ストレージは、おそらく湿潤気候にシリカビーズに、室温で可能です。送信側と受信側の機関のバイオセーフティの役員は、病原体はFTAカードの表面と接触したときに非アクティブになるので、通常のメールでFTAカードの送信を許可することができます。
2。ウイルスRNAの分離
- 糞便/クロアカ流体を含むFTAカードの材料を抽出します。ハリス2 mmのパンチャーと場所とパンチ3枚のディスクRNaseフリー96wellプレートのウェルにそれらのすべて。各々の新しいサンプルの間に、アルコールと金の精度ワイプ（Kimtech）で慎重にパンチャーを清掃してください。常にポジティブとネガティブコントロールを使用してください。ポジティブコントロールは、新鮮なFTAカードに適用される実験室株、または肯定的な結果を得るために知っている天然のサンプルで構成することができます。ネガティブコントロールとして、空のFTAカードからディスクをパンチアウト。さらに、（テンプレートのような水と）後で実験におけるPCRのコントロールのための別のよく無料のまま。
- 70μlのRNA迅速な抽出溶液（Ambion社）とのヒートシールプレート（AbGeneサーモシーラー）を追加します。 （;事前にテストこれが使用されてプレートシェーカーのモデルによって異なります）スピルオーバーが発生しない決まる速度で、室温でプレートシェーカー上で5分間インキュベートする。
- MAGMAX - 96ウイルスRNA単離キット（Ambion社）と、製造元のプロトコールにしたがってウイルスRNAの分離を運ぶ。簡単に：追加130μl調製した溶解/結合液（キットから）各ウェルに。転送50μlの各ウェルにFTAカードの材料を抽出した。 1分間プレートを振る。
- と上下にピペッティングすることにより、各試料と混合して20μlの準備ビーズミックス（キットから）を追加します。 5分間決まる速度で振る。 RNA分子は、磁気ビーズに結合するであろう。
- 磁気にプレートを移動する96ウェルビーズを捕捉するスタンド。使用される磁気スタンドのモデルによっては、これは5分以上かかる場合があります。ソリューションが完全に明らかになっているときは、削除し、上清を捨てる。その後、磁気スタンドからプレートを外します。
- 洗浄液2（キットから）で2回溶液1を洗うとで二回ビーズを洗浄してください。 4洗浄の各ステップに対して、各サンプルに150μL準備洗浄液を追加決定した速度で1分間振とうする、磁気スタンドにプレートを移動、約5分（または解決策が完全に透明になるまで）のためにビーズを捕捉、削除して、上清を捨てる。その後、磁気スタンドからプレートを取り外す次の洗浄液を追加し、前述の洗浄工程を行う。最後の洗浄ステップの後、2分間プレートシェーカーで、室温で可能と空気乾燥したビーズと同じくらいの洗浄溶液を取り除く。
- ビーズからRNAを放出し、プレートシェーカー上で4分間振とうして溶出バッファー50μlのを（キットから）を追加します。前述のようにビーズをキャプチャします。上清は今ダウンストリームアプリケーションのための準備ができて分離されたRNAが含まれています。
3。 AIVマトリックス遺伝子のRT - PCR
25μlの反応（。。クラウスら 18とFouchier らから調整22）のワンステップにアクセスRT - PCRシステム（プロメガ）で逆転写PCR（RT - PCR）を行う。
| ヌクレアーゼフリー水 | 1.5μlずつ |
| AMV / Tfl5バッファ 5μlの | |
| dNTPの | 0.5μl |
| プライマーM52C 22（10μM） | 2.5μl |
| プライマーM253R 22（10μM） | 2.5μl |
| し、MgSO 4（25mM）を | 7μl |
| AMV逆転写酵素（5u/μl） | 0.5μl |
| TFLポリメラーゼ（5u/μl） | 0.5μl |
| RNAサンプル | 5μlの |
Biometra T1サーモサイクラーでのPCR条件は次のとおりです：45時45分の最初の逆転写° C、94℃2分の初期変性が続く° Cとの40サイクル：94℃1分、1分間56℃、および用2分間68 ° C。 68追加の7分の伸長は、° Cの増幅を終わります。
4。 AI陽性サンプルやゲルからターゲット断片の精製のためのスクリーニング
- 事前スクリーニングのための1％エチジウムブロミド（100 mlのゲル当たり2.5μl）で染色した1％アガロースゲル（Roche社）で2μlの5倍のローディング色素（BioRad社）と6μl水と混合PCR産物の2μlのをロード。
- 120Vで1時間ゲルを実行し、DNAサイズ標準（BioRad社EZの負荷100 bpのラダー）と一緒に、ゲルのドキュメンテーションシステムで可視化する。図1の例を参照してください。
- 200塩基対および300塩基対の間に予想されるサイズの範囲（（ターゲット断片は244 bpである）で増幅された断片のサンプルを選択してください。2に6μl5倍ローディング色素で、これらの候補者の全体のPCR反応液量を（23μlが残っている〜の）ロード％のエチジウムブロマイドは、アガロースゲルを染色し、2時間実行する。
- UV -トランス（Bioblockサイエンティフィック）にゲルを置き、目視検査。図2の例を参照してください。メスと個々に配置を1.5 mlの反応チューブでゲルから正しいサイズの物品のバンド。 ZymocleanジェルDNA回収キット（Zymoリサーチ）を使用してインスタンスのために、ゲルからの断片を精製する。
5。シーケンシングとPCR産物の同定
- ABIビッグダイ3.1化学（Applied Biosystems社）とABI 3730キャピラリーシークエンサー上のインスタンスのターゲットフラグメントのサンガーシーケンシングを、行う。 10月20日ngのゲル精製テンプレートcDNAを、1.75μl5倍希釈バッファー、0.5μlビッグダイV3.1プレミックス、1μLフォワードプライマー（M52C 20、10mM）を、およびddH2Oを含む10μlの量のシークエンシング反応を準備する。サイクリング条件は以下のとおりです。25サイクルに続いて1分間初期変性：96℃10秒° C、45℃および60℃4分で5秒℃の精製して、内部のプロトコルに従ってシーケンシング反応を準備する。
- このようなバイオテクノロジー情報（NCBI、国立センターでBLASTなどのWebベースのツールで、例えばそのようなGenBank23などのヌクレオチドデータベースに対して、cDNA配列を、結果として識別http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ）。
6。代表的な結果：
マガモ（マガモ）は、2007年12月Ottenby鳥類観測所でサンプリングされた。このプロトコルで説明されているようにそれぞれのマガモからFTAカード上のサンプルを採取した。出荷後に、FTAカードは2年間の-20℃の冷凍庫に保管した。実験室の同FTAカードのサンプルクラウスらでテスト分離します。18はポジティブコントロールだけでなく、それの9倍連続希釈液として含まれていた。二つのネガティブコントロール）は、空のFTAカードからの抽出、パンチャーからキャリーオーバーがあったかどうかをテストするため、およびヌクレアーゼフリー水をテンプレートとして使用されていたII）RT - PCRの反応、コンタミネーションが中に発生したかどうかをテストするために、またはiだったPCR反応の準備インチ
84試料を分析した。これらの84サンプルからのPCR産物のゲルの写真を図1に見つけることができます。天然のサンプルから非特異的バンドの多くは、糞便中に様々な微生物の汚染の存在のために観察することができます。しかし、プライマー対のターゲット断片は244 bpの長です。約正しいサイズの範囲（200 bpと300bpの間）でフラグメントを生成したサンプルのサブセットの全PCR反応の容積は、ゲル（図1）にロードされました。ゲルから切り出されたバンドのうちの図は、補足図1で見ることができます。ポジティブコントロールに加えて、これらのサンプルのうち2つ（69899と69912）は、新しいプロトコルで陽性であった。他のすべてのバンドが最も密接にbacterialシーケンスを似ている、またはすべてに読み取り可能なシーケンスを生成していない間、NCBIヌクレオチドデータベースに対して、BLASTの検索では、AIマトリックス遺伝子（図3）としてのアイデンティティを明らかにした。
図1。 PCR産物の予備的スクリーニングのゲルの写真。陽性対照の2μlのPCR産物は、sポジティブコントロール、2つの負のコントロールと84総排泄腔検体のエリアル希釈はロードされました。 48サンプルは、下部パネルの上部ゲルのパネル、および48個のサンプルに示されています。赤い矢印は、100 bpのDNAサイズの規格で使用されるゲルのレーンを示している。説明のために、赤い円は予想されたサイズの範囲でバンドを示す。青丸は非特異的アンプリコン（左上）やサイズが100 bpの（右下）下にプライマーダイマーのアーチファクトを示している。
図2。 200塩基対および300塩基対の間にバンド（ターゲット断片244 bp）を持つ適切なサイズ範囲内のフラグメントとサンプルの選択。試料が選ばれました。緑の矢印は、陽性対照を示し、二つの赤い矢印は、NCBIヌクレオチドデータベースにそれらのcDNA配列を比較することによって、AIV正であることが確認されたサンプルを示している。
図3。 NCBIでの代表的なBLAST検索の画面キャプチャー。切り出したフラグメントから得られたcDNA配列の一つは、NCBIのウェブサイトにおけるヌクレオチドデータベースに対して照会されました。サンプルが正常にAIマトリックスの遺伝子の断片として識別されます。 この画像のフルサイズバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図のS1。ゲルから切り出し、選択したサンプルのバンド200 bpと300bpの間に候補のバンドを切り出していた後、この画像は図1に示すようにゲルから取られた。
Discussion
ここで説明するプロトコルは、AIVの存在を糞便または類似のサンプルをスクリーニングするために補助的な方法を提供する。それは、特にサンプルの収集が迅速かつ容易に行えるように設計されました。これはAIの監視に貢献するため、そのような狩猟や野生生物の管理者として以下の訓練を受け、ことが可能となります。可能であればサンプルを凍結することは推奨されていますがないクールなチェーンは、適用する必要はありません。室温の数日間は、例えば実験室に輸送中に、カードが乾いたままである限り、FTAカード上のRNA分子のために問題はなかった。このようなアルコール15またはグアニジン16などの現在の研究コミュニティによって評価される他の非冷却ストレージシステム、、彼らの危険な性質のため、特別な輸送の手配が必要です。対照的に、FTAカードの方法は、有害物質の輸送を必要としません。しかし、この点では別の興味深い記憶媒体は、17のどちらか有害ではないことRNAlaterは™です。サンプルの分析は、標準的な分子生物学実験室で行うことができる。通常のPCR反応およびキャピラリーシークエンシングのため以外の特別な機器は必要ありませんでした。すでにサンプルのコレクションで潜在的な病原体はFTAカードの抗菌および抗ウイルス活性が不活性化されたので、すべてのステップは、バイオセイフティレベルなしで行うことができます。
交差汚染とその後の偽陽性検体は、野生の鳥のサンプルと私たちの試験で観察されなかった。しかし、RNAおよびPCRを扱う場合には、常に前後のPCRステップのために働く場所と別々の部屋をきれいにする特別な注意を払うことをお勧めします。ドラフト内で作業する研究室でエアロゾル汚染の危険性を減少させる。ピペッティングは、フィルタのヒントを実施する必要があります。
我々は84サンプルの6人は伝統的なリアルタイムRT - PCR法24で陽性とリアルタイムRT - PCRからのCt値がわかっていることを知っている同じカモから同時に採取された検体について過去の研究から。 Ct値<30（ウイルスRNAの高濃度を示す）持っていたアヒルから提案手法のステムによって検出された二つの正のサンプル。従来のプロトコルで陽性であった他の4つのサンプルはCt値> 30の（少ない集中）を有していたと我々のプロトコルによって検出することができませんでした。
相対的に高いウイルス力価を持つ唯一のサンプルは、私たちのアッセイで陽性であった、それは法の感度は、すべての陽性検体の検出に失敗の原因だった可能性があります。さらに、現在の研究のサンプルサイズは非常に低く、より制御し、厳密な実験が行われている場合、メソッドは、完全に開発し、評価することができます。これらのサンプルはリモート領域から収集されていた場合は、、伝統的な分析はまったく不可能だったでしょう。さらに、これらの最初の結果は、さらなる最適化を必要とするパイロット実験に由来する。サンプルの収集後に定期的に-20℃のフリーザーで二年間の保管期間は、おそらくまた、ウイルスRNAの品質に影響を与えた。この可能性RNAの分解は、不活化ウイルスの室温のストレージを扱う重要な問題です。上記のように別の液体に保存されているサンプルは、ウイルスゲノム16の長いストレッチの分析に影響を与える重要な劣化に苦しむ。私たちの研究でテストされていないものの、FTAカードは、鳥インフルエンザウイルス25、26と非常に類似している他のRNAのシステムでインタクトなRNA分子を保持するためによく適していることが証明されている。
Disclosures
鳥の扱いとサンプリング、トラップすることは国の法令に続く行われ、農業と研究動物の倫理委員会のスウェーデンの理事会で承認された。
Acknowledgments
我々は技術支援のためにバートのDibbitsに感謝。動物の育種とゲノム解析グループ、ワーゲニンゲン大学、オランダは、惜しみなく実験室で私たちを開催しました。 Ottenby鳥天文台、スウェーデン、の職員は、特定のマグヌスヘルストリョーム、マーカスダニエルソン、クリストファーマグナソンとスティナアンダーソンで、マガモをトラップし、サンプリングのために感謝しています。我々は実験室での撮影のためにSanneスヴェンソン、ジョナタンQvistとOttenby TV撮影のための単位のアクセルGjöres、そして真野Camonに感謝。ダニエルBengtsonは、この出版物のビデオ部分のための美しいアヒルの写真を提供した。 CDCの公衆衛生のイメージライブラリからさらにフリー素材（PHIL、 http://phil.cdc.gov/phil/が ）使用されていました：電子顕微鏡写真（番号280、博士アースキンパーマー）とイラストを（第11823;インフルエンザウイルスのダグラスヨルダン）で。財政支援はKNJV（オランダ王立ハンター協会）、農業のオランダ省、Faunafondsと開発元：StichtingデEik信託（オランダの両方）、スウェーデン研究評議会（助成金なし。2007から20774）とECによって与えられたNewflubirdプロジェクトを設立。 RNAの分離の化学物質は、Ambion、Incは、RNAの会社の寛大な贈り物でした。これはOttenbyバード天文台からの寄与第245です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
| FTA card | Whatman, GE Healthcare | several options | |
| Harris micro punch 2mm with mat | Whatman, GE Healthcare | 1154409 | |
| RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
| Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
| RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
| MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
| One-Step Access RT-PCR system | Promega Corp. | A1250 | or comparable |
| Agarose MP | Roche Group | 1388991001 | multi purpose agarose |
| 5x loading buffer | Bio-Rad | delivered with DNA ladder | |
| EZ load 100 bp ladder | Bio-Rad | 170-8353 | or comparable |
| Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
| 1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
| Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research Corp. | D4001 | or comparable |
| ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |
References
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