Summary
आंशिक रूप से अलग प्रांतस्था ("काटकर अलग कर देना") posttraumatic epileptogenesis के एक कुशल पशु मॉडल है. यहाँ हम प्रदर्शन कैसे एक उपन्यास शल्य चिकित्सा उपकरण बनाने के लिए और इसे का उपयोग करने के लिए और अधिक सटीक और लगातार घावों को बनाने के लिए इस मॉडल उत्पन्न.
Abstract
आंशिक रूप से अलग प्रांतस्था ("काटकर अलग कर देना") posttraumatic epileptogenesis के एक पशु मॉडल है. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के माध्यम से काटने ज्ञानेन्द्रिय प्रांतस्था और सफेद (काटकर अलग कर देना) बात है ताकि प्रमस्तिष्क प्रांतस्था का एक विशिष्ट क्षेत्र मोटे तौर पर पड़ोसी प्रांतस्था और subcortical 1-3 क्षेत्रों से अलग है नीचे. शामिल सर्जरी के बाद दो या दो से अधिक सप्ताह के एक विलंबता के बाद, epileptiform निर्वहन 1 कृन्तकों से मस्तिष्क स्लाइसें में दर्ज किया जा सकता है है, और बिजली या व्यवहार बरामदगी बिल्ली और बंदर 4-6 जैसे अन्य प्रजातियों से vivo में मनाया जा सकता है है. यह अच्छी तरह से स्थापित पशु मॉडल उत्पन्न करने के लिए कुशल है और अभिघातजन्य मस्तिष्क चोट के कई महत्वपूर्ण विशेषताओं mimics. हालांकि, यह तकनीकी एक मुक्त हाथ के साथ छोटे कृंतक मस्तिष्क में सटीक cortical घावों बनाने के प्रयास में चुनौती दे रहा है. शुरू में स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय में 1 डॉ. डेविड राजकुमार प्रयोगशाला में स्थापित की प्रक्रिया के आधार पर, हम यहाँ एक बेहतर तकनीक चूहों और चूहों में इस मॉडल की तैयारी के लिए सर्जरी प्रदर्शन मौजूद है. हम प्रदर्शन कैसे एक साधारण शल्य चिकित्सा उपकरण बनाने के लिए और इसे का उपयोग करने के लिए गहराई और कोण में कटौती करने के लिए और अधिक सटीक और अनुरूप परिणाम उत्पन्न करने की एक बेहतर नियंत्रण पाने के. डिवाइस करना आसान है, और प्रक्रिया को जानने के लिए जल्दी है. इस पशु मॉडल की पीढ़ी posttraumatic epileptogenesis के तंत्र पर अध्ययन के लिए एक कुशल प्रणाली उपलब्ध कराता है.
Protocol
1. काटकर अलग कर देना सर्जरी के लिए एक सरल युक्ति बनाना
- काटकर अलग कर देना डिवाइस हम बनाया तीन भागों (1 छवि) के होते हैं: (1) एक का समर्थन स्टेनलेस स्टील या प्लास्टिक कि एक मार्गदर्शक ट्यूब के लगाव और एक सुई की अनुमति देता है, और सर्जरी के दौरान कपाल खिड़की के पार बैठता है के बने प्लेट, (2) एक मार्गदर्शक ट्यूब है कि स्थिति में एक सुई रखती है और सुई रोटेशन परमिट, और (3) एक सुई कि ~ नोक से 3 मिमी पर 90 डिग्री पर तुला हुआ है, और रोटेशन और सम्मिलन द्वारा जंगम है.
- ~ 10 x 30 मिमी आयताकार स्टेनलेस स्टील या पारदर्शी प्लास्टिक (1) का समर्थन प्लेट बनाने के लिए 1-1.5 मिमी मोटी, 7 का एक टुकड़ा कट. एक 1.5 इंच और 22 गेज (बी कंपनी, 305,156 #) और एक 1.5 इंच 25 गेज (बी कंपनी, 305,127 #) सिरिंज सुई तैयार है. एक मार्गदर्शक ट्यूब बनाने के लिए, बंद प्लास्टिक अंत में कटौती और कम 22 गेज सिरिंज सुई की सुई टिप है ताकि इसकी कुल लंबाई 31-32 मिमी (2) के बारे में है. धातु अंत रेत यह फ्लैट और चिकनी बनाने के लिए. इस मार्गदर्शक ट्यूब के अंतिम लंबाई 5-6 मिमी की तुलना में कम 25 गेज सुई सिरिंज के बारे में होना चाहिए.
- Cyanoacrylate गोंद का उपयोग समर्थन थाली पर मार्गदर्शन ट्यूब तय है, सुनिश्चित करें कि सुई धातु के किनारे करने के लिए सीधा है.
- मार्गदर्शन ट्यूब में सिरिंज 25 गेज सुई डालें, और टिप (1 छवि) से 2.5-3 मिमी पर सुई 90 डिग्री के मोड़.
- सुई के अंत (1 छवि, सुई रोक) पर एक छोटे से प्लास्टिक ट्यूब gluing द्वारा सुई के ऊर्ध्वाधर चलती रेंज को समायोजित करें. सुई की अंतिम चलती सीमा निर्धारित कैसे गहरी सुई प्रांतस्था में डाला जा सकता है, और के लिए 1.6-1.8 मिमी p21 चूहों और p21 चूहों के लिए 1.3-1.5 मिमी होना चाहिए. इस लंबाई के विभिन्न जानवरों की प्रजातियों और उम्र के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.
- सुई के ऊपरी छोर पर तुला टिप (Fig.1 सुई सूचक) के रूप में एक ही दिशा में एक छोटे से तांबे के तार या टेप का एक छोटा सा टुकड़ा संलग्न. तार या टेप काटकर अलग कर देना सर्जरी के दौरान सुई के मोड़ कोण (छवि 1) इंगित करता है.
2. पशु तैयारी
- सभी सर्जिकल उपकरणों autoclaved, एक ग्लास मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ, या 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित साथ निष्फल की जरूरत है.
- 22 (P20-22) दिन या एक ही उम्र में CD1 चूहों - हम प्रसव के बाद 20 साल की उम्र में / Sprague Dawley चूहों का उपयोग करें. चूहों या चूहों के विभिन्न प्रकारों के विशिष्ट परियोजनाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- Ketamine के एक आईपी इंजेक्शन के साथ माउस anesthetize 80 मिलीग्राम / किग्रा और xylazine 8 मिलीग्राम / किग्रा. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया शुरू होता है के बाद पशु पूंछ चुटकी का जवाब नहीं. शल्य चिकित्सा के दौरान, यदि आवश्यक हो, एक तिहाई की एक बूस्टर खुराक संवेदनाहारी कॉकटेल के मूल खुराक मूल संवेदनाहारी राज्य बहाल दिया जा सकता है.
- जानवर के सिर पर एक बिजली के बाल trimmer के साथ बाल कट. सूखापन से संज्ञाहरण के दौरान सुरक्षा के लिए जानवरों की आंखों पर नेत्र मरहम की एक छोटी राशि लागू करें. एक 10% समाधान povidone आयोडीन, 70% इथेनॉल के बाद का उपयोग खोपड़ी कीटाणुरहित.
- Stereotaxic तंत्र पर पशु पर्वत के लिए एक स्थिर निश्चित स्थिति में सिर रखने के लिए. सर्जरी के दौरान, हम हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए एक हीटिंग पैड पर जानवर रहते हैं.
- सिर पर एक स्केलपेल का उपयोग midline चीरा पूर्वकाल पीछे, लैम्ब्डा से आंखों के बीच का विस्तार करें. Hemostats प्रयोग त्वचा तरफ खींचने के लिए और बाईं खोपड़ी पर्याप्त बेनकाब.
- बाईं खोपड़ी पर एक आयताकार कटौती करें, और स्केलपेल का उपयोग करने के लिए बंद periosteum परिमार्जन. इस कदम से खून बह रहा कम और खोपड़ी पर ड्रिलिंग की सुविधा होगी.
3. Undercuts बनाना
- उजागर खोपड़ी क्षेत्र पर बाँझ खारा की एक छोटी राशि जोड़ें, और तब कई क्यू युक्तियों का उपयोग करने के लिए रक्त स्वच्छ और क्षेत्र सूखे.
- एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत, बाएँ खोपड़ी के केंद्र पर एक आयताकार (~ चूहों में x 7 मिमी 5, 4 x चूहों में 5 मिमी) नाली (लगभग छोड़ दिया ज्ञानेन्द्रिय प्रांतस्था ऊपर) ड्रिलिंग शुरू करते हैं. खोपड़ी पर खारा की एक बूंद लागू ड्रिलिंग और dissipates गर्मी की सुविधा. हड्डी की गहराई के बाद लगभग 2 / 3 drilled है, अतिरिक्त खारा हटाने और एक क्यू की नोक के साथ ड्रिलिंग के क्षेत्र को साफ. धीरे धीरे और ध्यान से गहरी ड्रिल जब तक हड्डी के केंद्र टुकड़ा एक संदंश के कोमल स्पर्श पर जंगम है.
- ध्यान से हड्डी के किनारे पर एक संदंश के एक तेज टिप डालने और धीरे धीरे संदंश उठाने बाएँ गोलार्द्ध बेनकाब करके हड्डी के मध्य टुकड़ा हटा दें.
- सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत, काटकर अलग कर देना डिवाइस पकड़ और एक parasagittal दिशा में सुई और समर्थन प्लेट midline, झुकाव डिवाइस थोड़ा दुमदारी से इतना सीधा सुई टिप और लक्ष्य cortical क्षेत्र के दृश्य के रूप में बनाए रखने के लिए उन्मुख. सुई की नोक एक क्षेत्र 1-2 मिमी बेहतर बाण के समान सीवन के लिए पार्श्व के लिए लक्ष्य, कपाल विंडो के बीच में, और बड़े जहाजों के सीधे प्रवेश से बचने.
- Dura के माध्यम से और पिया के तहत सुई एक क्षैतिज दिशा में इतनी के रूप में रक्त वाहिकाओं को छोड़ करने के लिए सम्मिलित है. काटकर अलग कर देना डिवाइस के नीचे बैठोकपाल खिड़की के दोनों किनारों पर इतना है कि सुई cortical सतह (छवि 1) के लिए सामान्य में तैनात है. कपाल खिड़की के दोनों किनारों पर हाथ से डिवाइस आराम काफी कम या निम्न प्रक्रिया के दौरान मिलाते हुए हाथ को खत्म करने. पिया के नीचे सुई लिफ्ट करने के लिए, तो धीरे धीरे यह एक transcortical कट बनाने के लिए जब तक सुई गहरा नहीं जा सकते हैं कम. एक आधा सर्कल सफेद बात / छठी काटकर गहरी परत बनाने के midline से दूर ° 135 ~ घुमाएँ. तब सुई फिर बढ़ा पिया के नीचे है. डिवाइस पिछड़े झुकाएँ और सुई वापस लेने.
- वैकल्पिक रूप से, एक (2.5 कदम) उपरोक्त प्रक्रिया दोहराने लेकिन बिना सुई मोड़ के रूप में इतनी बनाने के लिए खिड़की के पार्श्व किनारों पर एक अतिरिक्त transcortical कटौती कर सकते हैं. यह एक और अधिक पूर्ण cortical अलगाव पैदा करेगा.
- संरक्षण के लिए कपाल विंडो पर प्लास्टिक की फिल्म का एक टुकड़ा (मिमी x 6 6) प्लेस, और खोपड़ी सिवनी. एक गर्म पैड पर पशु प्लेस जब तक पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
कोरोनल cortical स्लाइस काटकर अलग कर देना सर्जरी की सफलता की पुष्टि करने के लिए तैयार किया जा सकता है है. सर्जरी के बाद> 2 सप्ताह तैयार स्लाइस में, transcortical और काटकर अलग कर देना कटौती एक खुर्दबीन के कम बिजली उद्देश्य (छवि 2) के तहत प्रत्यक्ष कर रहे हैं. आंशिक रूप से अलग प्रांतस्था आमतौर पर थोड़ा पतली हो जाती है, और epileptiform गतिविधि संभावित क्षेत्र रिकॉर्डिंग (3 छवि) के साथ cortical स्लाइस के बहुमत में पाया जा सकता है.
सफेद मामले में या गहरी cortical परतों, में बड़ा छेद के विपरीत गठन में lesioned प्रांतस्था, या एक गुमराह ऊपर या नीचे सफेद बात की जा रही कटौती के thinning नाटकीय मस्तिष्क आगे के प्रयोगों के लिए बेकार कर देगा.
चित्रा 1. संरचना और एक काटकर अलग कर देना डिवाइस के आवेदन एक मार्गदर्शक ट्यूब (2) एक सहायक (1) थाली है कि स्टेनलेस स्टील या पारदर्शी प्लास्टिक से बना है पर सरेस से जोड़ा हुआ है . एक सिरिंज सुई (3) मार्गदर्शक और ~ 3 टिप मिमी ट्यूब तुला के माध्यम से डाला जाता है. एक सुई प्लास्टिक ट्यूब से बना रोक इतना है कि सुई की खड़ी चलती रेंज ~ 1.2 मिमी और ~ p21 चूहों और चूहों क्रमशः में उपयोग के लिए 1.5 मिमी तक सीमित है सुई के ऊपरी छोर पर चिपके है. छोटे तांबे के तार का एक खंड तुला सुई के उन्मुखीकरण के लिए सुई सूचक के रूप में संभाल के नीचे fastened है. ध्यान दें कि डिवाइस झुका हुआ है और कपाल खिड़की के दोनों बढ़त के साथ संपर्क में इतना है कि एक कट pial सतह के समानांतर बनाया जा सकता है.
चित्रा 2. काटकर अलग कर देना टुकड़ा का एक प्रतिनिधि छवि. ए एक टुकड़ा है कि एक P48 चूहे में काटकर अलग कर देना घाव के बाद दो सप्ताह में तैयार किया गया था प्रतिदीप्त छवि. काटने घाव फ्लोरोसेंट रंजक DiI द्वारा चिह्नित किया गया. सही पर सफेद तीर transcortical कटौती से संकेत मिलता है, और तल पर तीर से काटकर अलग कर देना संकेत मिलता है कि परत चतुर्थ और सफेद पदार्थ के बीच की सीमा हालांकि पारित.
चित्रा 3. फील्ड एक काटकर अलग कर देना मस्तिष्क टुकड़ा से काटकर अलग कर देना टुकड़ा फील्ड. संभावित रिकॉर्डिंग से संभावित रिकॉर्डिंग epileptiform गतिविधि का प्रदर्शन किया, घायल cortical ऊतक के hyperexcitability सुझाव.
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Discussion
काटकर अलग कर देना मॉडल posttraumatic epileptogenesis के अध्ययन के लिए एक अत्यधिक कुशल प्रणाली है. एक ठेठ सर्जरी के बारे में केवल 20-30 मिनट लगते खत्म करने के लिए, और पैदा या सहज epileptiform गतिविधि 1-2 सर्जरी के बाद दो सप्ताह के ज्यादातर जानवरों से स्लाइस में दर्ज किया जा सकता है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस मॉडल खून बह रहा, सूजन, edema axotomy, और neuronal मौत 7 जैसे अभिघातजन्य मस्तिष्क चोट के बाद परिवर्तन के पहलुओं mimics . न केवल epileptiform गतिविधि rodents और अन्य जानवरों में देखा गया, लेकिन यह भी मिरगी दौरे मनुष्य जो तुलनीय cortical घावों पीड़ित 8 में प्रलेखित किया गया है. हाल के वर्षों में महत्वपूर्ण प्रगति के लिए अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट किया गया है. सहज और पैदा interictal epileptiform निर्वहन> 2 सप्ताह के घाव के बाद मस्तिष्क स्लाइसें में दर्ज किया गया है, और इन गतिविधियों के लिए चूहे cortical परत ध् 1 में आरंभ पाया गया. सर्किट पुनर्गठन, GABAergic interneurons और disinhibition के नुकसान neuronal झिल्ली excitability में बढ़ जाती है, और उत्तेजक synaptic युग्मन में वृद्धि के साक्ष्य भी cortical परत 2,9-13 वी में विशेष रूप से प्रदर्शन किया गया है,.
यहाँ हम काटकर अलग कर देना घावों बनाने के लिए एक उपन्यास साधन की शुरुआत की. जब एक एक मुक्त हाथ से काटकर अलग कर देना सर्जरी प्रदर्शन, अक्सर मिलाते हुए हाथ स्थिर और सटीक cortical घावों बनाने में कठिनाई का कारण बनता है. हालांकि अभ्यास और अनुभव शल्य चिकित्सा की गुणवत्ता में सुधार हो सकता है, और घावों की गहराई और गुणवत्ता में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता मौजूद है. डिवाइस हम यहाँ पेश किया है तीन पहलुओं में लाभप्रद है. सबसे पहले, कपाल विंडो के किनारों पर आराम से, युक्ति बड़े पैमाने पर सर्जरी के दौरान मिलाते हुए हाथ की समस्या को समाप्त, इस प्रकार यह नाजुक मस्तिष्क के ऊतकों के माध्यम से एक चिकनी कटौती करने के लिए संभव बनाने. दूसरा, सुई प्रविष्टि और रोटेशन की डिग्री की गहराई सावधानी से नियंत्रित हो सकता है, जो यह संभव अधिक ठीक से और लगातार छठी परत के नीचे सफेद बात में कटौती करने के लिए बनाता है. तीसरा, cortical गोलार्द्ध के सतह घुमावदार है: के साथ औसत दर्जे का पार्श्व (1 छवि) की ओर, जो लक्षित सफेद पदार्थ लापता पैदा कर सकता है अधिक से अधिक किया जा रहा है अगर सुई के कोण के हिसाब से समायोजित नहीं है. कपाल खिड़की डिवाइस पर आराम से, सुई पार्श्व से झुका हुआ है, और काटने कोण स्वचालित रूप से समायोजित किया जाता है कि सुई के रोटेशन हमेशा प्रांतस्था और सटीक घाव की सतह के समानांतर है प्राप्त (छवि 2). इस डिवाइस का उपयोग कर के साथ एक संभावित समस्या यह है कि यह खुर्दबीन के नीचे सुई के प्रत्यक्ष दृश्य के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. यह समस्या लांगुलिय दिशा की ओर थोड़ा झुकाव डिवाइस के द्वारा हल किया जा सकता है जब pial और प्रांतस्था मर्मज्ञ. जैसे ही के रूप में सुई सफेद बात के लिए कम है, डिवाइस के लिए cortical सतह के लिए खड़ी हो समायोजित किया जा जरूरत है, और खोपड़ी पर विश्राम किया. इस बिंदु पर, सुई सूचक को देख सुई रोटेशन की निगरानी करने के लिए पर्याप्त है. संक्षेप में, इन कई फायदे और इसके निर्माण के रिश्तेदार आसानी के साथ, काटकर अलग कर देना मॉडल और अधिक सुलभ और posttraumatic epileptogenesis के अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम NIH / NINDS अनुदान 4R00 057940 एन एस, और स्पाइनल कॉर्ड और इंडियाना राज्य स्वास्थ्य विभाग से दिमागी चोट अनुसंधान निधि से अनुदान SCBI 200-12 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Foredom micromotor kit | equipment | Foredom | K.1070 | |
| 1.5 inch 22-gauge syringe needle | material | BD Biosciences | 305156 | |
| 1.5 inch 25-gauge syringe needle | material | BD Biosciences | 305127 | |
| Cyanoacrylate glue | material | Ted Pella, Inc. | 14450 |
References
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