Summary
Oncolytic 바이러스는 암 치료제에 대한 약속입니다. 치료하기 전에 환자에서 얻은 살아있는 조직의 표본의 infectability을 확인하는 기능이 치료 접근의 독특한 장점이라고 생각합니다. 이 프로토콜은을 위해 조직을 처리하는 방법에 대해 설명합니다
Abstract
Oncolytic 바이러스 (OVs)는 선택의 복제 및 종양 세포 1을 죽일 소설 치료제입니다. HSV, Reovirus, 그리고 암 치료로 우두의 OVs 포함한 oncolytic 다양한 플랫폼의 효과를 평가하는 몇 가지 임상 실험이 현재 진행 2~5아르. oncolytic 바이러스 중 하나는 주요 특성들은 유전이 가능한 현미경이나 생체 발광 이미징 6,7하여 조직의 감염을 시각화 수 있습니다 기자 transgenes을 표현하는 수정할 수있다는 것입니다. 그것이 성공 oncolytic virotherapy 8 가능성을 확인하기 위해서는 이전 치료 환자의 생체내 전에서 조직을 감염시킬 수 있기 때문에 이것은 독특한 장점을 제공합니다. 이를 위해서는 적절하게 조직 이질에 대한 보상 및 감염 9 특히 전에 조직 생존을 평가하기 위해 조직을 샘플하는 것이 중요합니다. oncolytic 플랫폼에서뿐만 아니라 불임 생산 감염 구별하기 위해서는 균질에 따라 조직의 직접 적정하여 표현하는 경우 기자 transgenes를 사용하여 바이러스 복제를 수행하는 것도 중요하다. 이 프로토콜의 목표는 이러한 문제를 해결할 수 있으며, 본 1 설명합니다. 세포 배양 2 종양 조직의 샘플링 및 준비. 신진 대사 염료 알라마 블루 3. GFP 또는 반딧불 루시페라제 4 중 하나를 표현하는 우두 바이러스와 교양 조직의 전 생체내 감염을 사용하여 조직 생존의 평가. 형광 현미경 또는 생체내 이미징 시스템 (IVIS) 5에서를 사용하여 transgene 표현의 검색. 플라크의 분석에 의해 바이러스의 부량. 이 포괄적인 방법은 조직 처리의 용이성, 조직 이질에 대한 보상, 조직 생존의 제어 및 불임 감염 및 뼈 진지하게 바이러스성 복제 사이의 차별 등 여러 가지 장점을 제공합니다.
Protocol
1. 조직 처리
- 최상의 결과를 얻으려면,이 프로토콜은 신선하게 고립 조직 10 % 이전 처리하기 위해 수술 다음 FBS, 1 %의 Pennicilin / 스트렙토 마이신 솔루션, 즉시 0.1 % Amphothericin B 솔루션을 포함하는 DMEM 매체로 입금을 사용하여야한다. 이것이 불가 능할 경우, 조직은 사전 처리 4 정도에서이 중간에 밤새 남아있을 수 있습니다.
- 전에 샘플을 처리하기 위해 적어도 5 분 70 % 에탄올 용액에서 그들을 입금하여 금속 집게와 일회용 블레이드를 검사. 또한 10 %를 포함하는 DMEM 매체 2 ML FBS, 1 %의 Pennicilin / 스트렙토 마이신 솔루션, 그리고 0.1 % Amphothericin B.있는 24 잘 플레이트를 준비
- 소독 집게를 사용하여 층류 유동 세포 배양 후드에서 조직 샘플을 수집하고, 측면에 멸균 쪽 뚜껑을 유지, 빈 15cm 배양 접시에있는 조직을 입금.
- 세포 배양 후드에서, 그림 1에서와 같이 조직 내의 지역의 다양한 다른 코어를 얻기 위해 2mm 생검 펀치를 사용합니다. 그들은 쉽게 수평 축을 따라자를 수 있도록 각각의 코어 사이에 충분한 공간을두고, 집게의 도움으로 15cm의 배양의 뚜껑에있는 코어를 입금.
- 그림 1에서와 같이 소독 면도날을 사용하여 4 분기에도 각각의 코어를 분할.
- pipet 팁을 사용하여 이미 DMEM 10 % FBS, 1 % Pennicilin / 스트렙토 마이신 솔루션, 그리고 0.1 % Amphothericin B 솔루션을 포함하는 1.5 ML를 포함, 그림 1과 같이 A4로 A1에서 다른 우물에 주어진 핵심에서 각 코어 분기하다 . 각각의 코어에 대해 반복합니다. 주어진 잘 / 상태 편견을 최소화하면서 이것은 종양의 대표적인 표본 추출을 허용해야합니다. 더 나은 표현을 위해, 코어의 개수를 증가시킵니다.
2. 조직 생존 능력 평가
- 그림 1에 표시된와 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에서 37 도로 1 시간 동안 품어으로 다음과 같은 조직 처리, 잘 # A1과 A2에 25μl # 알라마 파란색을 추가합니다.
- 알라마과 청색에 따라 부화는 각 A1과 A2 우물에서 3 회 100 μl를 제거하고 96 - 웰 플레이트에 6 개의 우물을 전송할 수 있습니다. 형광 플레이트 리더 (530 여기, 590 방출)를 사용하여 신호를 읽고 기록에 대한 데이터를 보관.
- 알라마 푸른 신호가 읽은 후에는 DMEM 10 % FBS + PS + AmphoB 포함되어 C1에 잘 A1에서 pipet 팁을 사용하여 조직의 모든 조각을 전송합니다. 잘 A1에서 미디어의 과도한 금액을 전송하지 않도록주의하십시오.
- GFP - 표현과 우두 바이러스 미디어 25 μl에 희석 루시페라제 - 표현 10 6 PFU와 각각 우물 A3와 A4를 감염. 음 A2는 눈꼽만치도를 포함하지 주어진 transgene을 표현하는 바이러스에 감염된 수 있습니다.
- 72시간 후, 우물 C1 및 D1 25 μl 알라마 파란색을 추가하고 2.2 단계 반복
3. 개화 현미경에 의해 GFP transgene 표현의 시각화
- 좋은 형광 사진을 찍는하기 위해 조직 조각을 다루는 모든 세포 배양 미디어를 제거합니다.
- 형광 가능 해부 현미경을 사용하면, 먼저 적절한 해상도 위상 콘트라스트 이미지를 받아
- 형광 모드로 전환이 경우 GFP에 대한 관심의 transgene을 시각화하기 위해 적절한 필터를 사용하여 사진을 찍었.
- 배경 형광의 사진을 찍을 관심 transgene (예 : RFP 등)의로부터 멀리 가능한 다른 파장의 형광 필터를 사용
4. 루시페라제 표현의 시각화는 생체내 이미징 시스템 (IVIS)에서 사용하여
- 당신이 시작하기 전에 IVIS이 초기화되어 있는지 확인합니다.
- 웰스 A4와 B4에 MG / ML, 잘 섞어 실온에서 5 분 품어 luciferin 기판 10 5 μl를 추가합니다.
- 오초에 IVIS 노출 시간을 설정하고 웰스의 사진을 찍을. 이미지가 포화되면, 낮은 노출 시간 반복하십시오. 신호가없는 경우에는 노출 시간을 향상시킬 수 있습니다.
- IVIS 이미징 소프트웨어를 사용하면 잘 B4의 신호를 사용하여 배경을 제거하고 발광 신호를 수치 관심의 영역을 선택할 수 있습니다.
5. 플라크의 분석에 의해 바이러스 titers 평가
- 전에 바이러스 titers을 quantifying하기 위해 조직이 처음 바이러스 입자를 공개 균질해야합니다. -80에 저장되며 이것은 감염된 조직 샘플에서 여러 달 후에 할 수 있습니다
- 분석 척도를 사용하여 균질해야 샘플을 달다. 이 경우, 우리는 잘 A2에서 수집한 샘플을 사용합니다.
- 조직은 5 ML의 폴리스티렌 왕복 아래 팔콘 튜브에 플레이스와 PBS 1 ML를 추가합니다. 조직 균 질기를 사용하여 조직을 균질. 필요한 경우, 나중에 바이러스 titers 평가를위한 -80에서 homogenate를 저장합니다.
- , titer 우두 바이러스 먼저 판 6 판에 잘 1,000,000 U2OS 세포와 37 정도에 하룻밤 품어 5 % CO 2 습기그들이 confluency 다음날 약 95 %에 도달 이러한 ified 보육.
- 각 희석 단계 사이의 조언을 변경해야하고, 바이러스의 시리얼 dilutions 할 혈청 무료로 미디어를 사용합니다. 일반적으로 우리는 10 dilutions 1을 900 μl로 전송 100 μl를 사용합니다. 얼마나 많은 dilutions 만들어진 것이 예상 바이러스 수율에 따라 달라집니다.
- dilutions 만들기에 따라, 도금 U20S 세포는 다음 U2OS 세포를 감염하는 바이러스 희석 주식 500 μl (각 희석)을 추가 덮고있는 미디어를 제거합니다. 5 % CO 2 배양기에서 humidified 섭씨 37도 1 시간 분 동안 세포를 품어.
- 이 기간 동안, DMEM 20 % FBS 및 37도 물에 목욕의 3퍼센트 CMC 솔루션을 포함하는 집중 2 X를 따뜻하게.
- 1 시간 부화 후, 감염된 U2OS 세포를 덮고있는 미디어를 제거합니다. 함께 2X DMEM, 20 % FBS와 감염된 U2OS 세포의 각 우물을 충당하기 위해이 혼합물 2 ML를 사용 3% CMC의 1시 1분 볼륨을 섞는다.
- 또 다른 48 시간 37 정도 5% CO 2 humidified 인큐베이터에 다시 세포를 넣어.
- 48 시간 후, 각 우물에 CMC 오버레이 위에 메탄올 - 아세트산 정착액 2 ML을 추가하고 세포 배양 후드에서 10 분 동안 상온에서 알을 품다.
- 고정 오버레이를 취소하고 수돗물을 사용하는 우물의 나머지 부분을 씻어.
- 마다 잘 쿠매시 푸른 솔루션 2ml와 고정 U2OS 세포를 얼룩 및 플레이트 쉐이크에서 낮은 속도로 실온에서 30 분 알을 품다.
- 쿠매시이 우물에서 얼룩 및 수돗물을 사용하여 번호판을 씻어 제거합니다. 약 한시간 덮개 해제로 건조 수 있습니다.
- 그 결과 바이러스 plaques 그림 2C에서 쉽게 시각하실 수 있습니다. 번호판이 단계에서 무한정 저장할 수 있습니다.
- 10 ~ 100 plaques 볼 수있는 희석 단계에서 plaques를 계산합니다.
- 사용 희석하여 계산 plaques의 수를 곱하면 PFU / ML의 titer를 제공하기 위해 2 결과 수를 모두 곱하면됩니다. 25 plaques가 잘 만 배 희석 사용 어디에서 계산하는 경우 예를 들어, 초기 undiluted 샘플의 titer는 2 50000000 PFU / ML 곱한 1,000,000 곱한 25. 또한 PFU / g에 titers를보고 샘플에 대한 측정 처음 무게로이 번호를 나누어
6. 대표 결과 :
정확하게 수술 얻은 정상 / 종양 조직 샘플은 또는 바이러스에 infectable하지 여부를 확인하기 위해, 하나는 먼저 조직 샘플 가능한 최소한 있는지 확인해야합니다. 그림 1A는 생존이 신진 대사 염료 (알라마 파란색)과 정상과 종양 조직 모두 적어도 72h 기간 동안 metabolically 활성 상태로 유지 수를 사용하여 평가 수 있습니다 보여줍니다. 이것은 조직 교양 전직의 생체내 바이러스는 복제를 지원할 수있다하는 것이 좋습니다. oncolytic 바이러스의 중요한 이점은 그들이 치료 또는 영상 transgenes을 표현하는 설계 될 수있다는 것입니다. 그림 2D - E는 GFP 또는 루시페라제가 추가로 이러한 조직이 가능한 또한 infectable 것을 지원하는, 전직 생체내 감염 조직에서 감지 수있다는 것을 보여줍니다. 증가 transgene 표현은 일반적으로 바이러스 복제와 관련이 있지만, 그것은 반드시 치료 활동에 중요한 것으로 생각됩니다 자기 증폭과 확산에 연결 생산적인 바이러스 라이프 사이클으로 간주되지 않습니다. 이러한 이유로, 그것은 더 많은 바이러스가 처음 조직을 감염하는 데 사용했던 것보다 생산 여부를 확인하는 것이 필요합니다. 그림 2B는 플라크의 분석에 의해 바이러스 부량에 따라 더 많은 바이러스가 조직 바로 다음 감염 후 수집된 72시간 감염 후 얻은 것을 보여줍니다. 전반적으로, 이러한 데이터는 수술 excised 종양 조직은 시간이 바이러스 복제가 지원하는 수있는 동안, 적어도 72 시간 동안 세포 배양에서 가능한 남아있을 수 보여줍니다.
그림 1. 조직의 개요 샘플링 / 프로토콜을 sectioning. 조직 샘플은 이후 무작위 웰스 A1 - A4로 배포됩니다 사분의 사 나누어 여러 가지 2mm 코어를 제거하여 처리됩니다. 색상 코드는 각 우물에 사용되는 시약을 나타냅니다. 우물 안에 회색 음영 광장이 그려져 6 개별 코어에서 각 분기를 나타냅니다. 잘 A1의 조직은 초기 알라마 푸른 읽고 나면 미디어와 뉴 웰 (C1)로 전송됩니다. 두 번째 읽기는 바이러스와 함께 72 시간 보육의 끝에 이루어집니다. 웰스 A4와 B4는 72 시간 배양 후 감염 후 Luciferin과 보충 아르
그림 2. 생존과 환자의 조직 샘플 infectability. 이시간에서 알라마 푸른 신호를 72 시간 우편 수집에 의해 측정 등) 조직 생존. Y - 축은 빈이 알라마 푸른 신호를 수정 나타냅니다. B) 우두 바이러스의 Titer조직 샘플 2 72시간 후 감염. C 쿠매시의 얼룩. D 다음 U2OS 세포에 우두 바이러스 plaques의) 예) 환자 VV - 루시페라제에 감염된 조직에서 얻은 발광 신호의 g 당 수집 IVIS를 사용하여 몇 군데. E)은 형광 현미경 사진이 VV - GFP에 감염된 환자의 조직 샘플의.
Discussion
이 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 신선한 조직 샘플을 얻는 것입니다. 샘플이 부적 절한 미디어 (예 : PBS)에 수술실에서 오래 기다려야 다음 세포 배양에 투입하는 경우,이 조직 생존을 손상시키고 해당 infectability 않도록 할 수 있습니다. 음표의 정상 조직은 본질적으로 더 이상의 종양 조직이 효과를하는 경향이있다. 또 하나 중요한 포인트는 조직과 크기의 일관성을 샘플하는 데 사용되는 몇 코어입니다. 이러한 조직 hypoxia와 infectectable 표면과 같은 요인은 코어와 코어 쿼터스의 크기에 따라 변동하기 때문에 크기 불일치는 환자 샘플을 통해 변화를 가져올 것입니다. 이것은 부분적으로 조직 슬라 이서를 사용하여 해결될 수 있지만, 여기서 제시하는 방법 중 하나 장점은 쉽게 의무가 없습니다 소프트 또는 점성 조직을 포함하여, 그것이 비교적 쉽게되어 오염이 적은 경향이, 그리고 조직 유형의 다양한 널리 적용 조직도 깔끔히 수 있습니다. 특히, 코어의 숫자는 더 나은 조직 표현을하기 위해 증가 수 있습니다. 또한, 코어는 같은 DNA, RNA 또는 단백질 추출과 같은 병렬로 할 수있는 다른 잠재적인 assays을 수용하기 위해 더 많은 조각 (예 : 5-8)로 잘라 수 있습니다. 그러나, 코어가 재현할 크기로 잘라 수있는 조각의 수가 다른 크기 corers를 사용하여 수정할 수있는 코어의 실제 크기에 따라 달라집니다. 선택, reproducibly 크기의 조직 조각을 얻을 수 있도록 한 방법은 작은 조각으로 그들을 subdividing 추가하기 전에 통치자를 사용하여 코어의 길이를 더하는 것입니다. 프로토콜은 자연스럽게 다른 바이러스를 수용하도록 수정할 수 있습니다 우리는 조직이 가능한하고 최대 6 일 동안 복제를 지원할 수 것으로 나타났습니다. 프로토콜은 더욱 cytrokines 등 다른 virally - 표현 transgenes 측정하도록 확장할 수 있습니다. 다음 감염은 조직도 더욱 조직의 조직학 더욱 세련 가능하며 방법은 바이러스 감염에 관한 10-12 immunohistochemical 방법에 의해 sectioning 및 얼룩을 위해 파라핀에 박혀 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 그림 2에 표시되는 데이터에 대한 인간의 수술 표본을 제공하는 박사 Hesham Abdelbary 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| Fetal Bovine Serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Amphothericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | Use at 0.1% |
| Pennicilin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Use at 1% |
| Alamar Blue | Invitrogen | DAL1025 | |
| D-Luciferin potassium salt | Molecular Imaging Products | D-Luciferin potassium salt 1g | Resuspend in PBS at 10 mg/ml and filter on 0.22 μm filter |
| MEM powder | GIBCO, by Life Technologies | #41500018 | Make in half the suggested volume to make 2X MEM and filter on 0.22 μm filter prior to use |
| Carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C9481 | Make a 3% solution in deionized water and autoclave. Note that powder can take some time to resuspend |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| 2 mm Biopsy punch | Miltex Inc. | MX-33-31 | |
| Double Edge Prep Blades | Personna Medical Care | 74-0002 | |
| Fluorescence disection Microscope | Leica Microsystems | model M205 FA | |
| In vivo imaging system (IVIS) | Caliper Life Sciences | IVIS® 200 series | |
| Tissue Tearor | Biospec Products | model 985370-395 |
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