Summary
Внутрипросветный средней мозговой артерии (MCAO) модель является наиболее часто используемой моделью среди экспериментальных моделях ишемического инсульта. Здесь мы покажем всей модели в деталях с проводником лазерной доплеровской флоуметрии, и результаты ее представитель.
Abstract
Инсульт является третьей ведущей причиной смерти и ведущей причиной инвалидности в мире, по оценкам, стоимость около $ 70 млрд. в Соединенных Штатах в 2009 году 1,2. Внутрипросветный средней мозговой артерии (MCAO) модель была разработана Коидзуми 4 в 1986 году для имитации этого впечатляющие патологии человека в крысу. Модификация метода MCAO позже представленных Лонга 3. Оба метода широко используются для определения молекулярных механизмов повреждения мозга в результате ишемического инсульта и потенциальные терапевтические методы 5. Этот относительно неинвазивный метод у крыс был расширен для использования на мышах, чтобы воспользоваться трансгенных и нокаут штаммов 6,7. Для моделирования координационного церебральная ишемия, внутрипросветного шов с помощью передовых внутренней сонной артерии, чтобы закупорить базе MCA. Втягивания шва после определенного периода времени имитирует спонтанной реперфузии, но шов может также быть постоянно сохранена. Это видео будет демонстрировать двух основных подходов к проведению процедуры внутрипросветный MCAO у мышей в ступенчато, а также предоставляет информацию для потенциальных недостатков и ошибок. Ишемический мозговой ткани впоследствии будет запятнана 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорида (ТТК), чтобы оценить степень инфаркт мозга 8.
Protocol
Этот протокол был одобрен Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) при университете Флориды и в соответствии с "принципом ухода животных Лаборатория" (NIH публикация № 86-23, пересмотренная 1985).
1. Материалы
- Животные: Мужской мышей C57BL / 6 (Харлан Laboratories, Индианаполис, Индиана, США) весом 20-26 граммов на время операции.
- Анестезия:
- Анестезия машины: VetEquip ингаляционной анестезии системы (VetEquip Inc, Плезантон, Калифорния, США).
- Вдыхание анестезии: изофлюрана (Baxter Фармацевтика, Дирфилд, штат Иллинойс).
- Хирургические инструменты: ножницы SuperCut Ирис, прямая (инструменты Всемирного Precision, Inc Сарасоте, штат Флорида, США); Vannas микро-ножницы, прямые (Всемирный инструменты Precision, Inc Сарасоте, штат Флорида, США), Дюмон щипцы (штраф наконечник, 45 ° изогнутые советы, инструменты Всемирного Precision, Inc Сарасоте, штат Флорида, США); Биполярный коагуляции единицы (High Эксикатор частот 900, инструменты Всемирного Precision, Inc Сарасоте, штат Флорида, США), микро-клип судна (инструменты Всемирного Precision, Inc, Сарасоте, штат Флорида, США)
- Хирургические расходные материалы: Стерильные советы хлопка, салфетки, марлевые губки; Шовный (7-0 шелковый шов, Ethicon, Inc Сомервилл, Нью-Джерси, США), ткани клей (Vetbond, 3M Компания, Санкт-Пол, Миннесота, США); Хирургическое скраб : Bethadine, 70% этанола и стерильным 0,9% физиологического раствора; глаз мазь (Puralube Vet Мазь, Pharmaderm, Мелвилл, штат Нью-Йорк, США).
- Окклюзия шва подготовки к MCAO:
- Накаливания для MCA окклюзии: 7-0 хирургических шовных мононити Нейлон (Ethicon, Inc Сомервилл, Нью-Джерси, США).
- Источник тепла для притупления шва наконечник (тепловая единица Прижигание, Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасоте, штат Флорида).
- Жидкий силиконовый каучук (силиконовый клей RTV, Всемирный Precision Instruments, Inc, Сарасоте, штат Флорида, США).
- Хирургическое / Пройдя микроскопа (Leica Стереомикроскоп MZ6).
- Волоконно-оптический осветитель (волоконно-оптический осветитель FO1-150, TechniQuip Corp, Ливермор, Калифорния, США).
- Лазерной допплеровской флоуметрии (PeriFlux System 5000, Perimed, Стокгольм, Швеция).
- Гибкая микроострийных (MT B500-0 Прямо микроострийных, Perimed, Стокгольм, Швеция)
- Температура параметров:
- Ректальные мониторинга температурных показателей (BAT-12, инструменты Всемирного Precision, Inc Сарасоте, штат Флорида).
- Тепловая одеяло (Т / НАСОС, TP600, Гаймар, Нью-Йорк, США).
- Окрашивание и количественного измерения объема инфаркта:
- 2% раствор 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорида (2% TTC, Sigma-Aldrich Ко, Сент-Луис, штат Миссури, США).
- Мыши мозга матрицы слайсер (Живич-Миллер Lab., Inc, Эллисон-Парк, Пенсильвания, США).
- Цифровая камера (V1253, Kodak Ко, Рочестер, штат Нью-Йорк, США).
- Изображение J программное обеспечение (ImageJ 1.42q программного обеспечения, американского Национального Института Здоровья, Bethesda, штат Массачусетс, США).
2. Предоперационная шаги
- До операции, мыши расположены под 12:12 светлый / темный цикл со свободным доступом к воде и грызунов чау.
- Швы для MCAO готовятся притупление 1-2мм от шва наконечник с тепло-и покрытие 3-4мм шовного вал из его кончик с жидкого силиконового каучука, что позволяет ему высохнуть (7-0; диаметр кончика, 0.20-0.25 мм; покрытие длины, 3-4мм; шов длиной 11-13мм). Стерильность должна быть сохранена во всех вышеупомянутых шагов.
- После взвешивания мыши, анестезия индуцирована с 4% в изофлуран индукции камера и поддерживается во время процедуры с 1,5-2% изофлуран в 30% O 2 и 70% N 2 O газовой смеси через маску.
- Мышь находится в положении лежа на марлевую прокладку лежал на контролируемой температурой рабочей поверхности (тепловое одеяло); голова бритая мех.
- Мазь Смазка офтальмологического наносится на оба глаза и веки закрыты, чтобы предотвратить высыхание глаза во время хирургического процесса.
- Средней линии разреза (1 см) производится на кожного покрова черепа вышестоящими затылочной линии Насьон и кожа натягивается сбоку, чтобы прикрепить гибкой микроострийных (MT B500-0 Прямо микроострийных; 0,5 мм в диаметре). Микроострийных находится перпендикулярно к поверхности правой теменной черепа (1 мм задняя и 5 мм латеральнее брегмы) для мониторинга кровотока в СМА на территории лазерной допплеровской флоуметрии.
- Убедитесь, что гибкий микроострийных крепится к черепу твердо перед животное превратилось в лежачем положении. Шее животного помещается на мягкой подкладке и его нос проходит в носовой обтекатель аппарата анестезии. В результате будет иметь достаточно места для гибких микроострийных.
- Ректального датчика температуры вводится для поддержания постоянной температуры тела животного на 37 ± 0,5 ° С.
- Обе передние лапы и hindpaws выявляются в операционную платформу поверхности, и хвост, приклеенный к ректальной трубки. </ OL>
- Под операционным микроскопом, средней линии шеи разрез производится с помощью ножниц между рукояткой и челюсть, осторожно подъема свободной кожи.
- Парных основных подчелюстной железы прямо разделены, с левой железы левой на месте. Правый подчелюстной железы убирается краниально и закреплены вместе с кивательной мышцы.
- Подвергаются разделению omohyoid мышц покрытия оболочки сонной тщательно разделить с датчиков.
- Право общей сонной артерии (ССА), тщательно отделены и изолированы от блуждающего нерва и его оболочки (расположен сбоку от ОАС).
- Далее, 2 хирургических методов, которые использовались часто для выполнения MCA окклюзии расходятся:
- Три свободные швы воротника (7-0 шелк) готовятся вокруг правой ОСА.
- Внешней сонной артерии (ЭКА) отождествляется, изолированных и обезболивающий укол (2-3мм дистальнее бифуркации). Это может быть впоследствии разделена с микро-ножниц. Чтобы избежать случайных повреждений при периферической прижигание сайта, власть должна быть установлена на уровне 1, используя мощности ручки. Это соответствует для всех cauterizations.
- Достаточное натяжение применяется к наиболее проксимальный шов на воротнике ОСО, чтобы закупорить кровоток (постоянные перевязки). Поток окклюзии проверяется ~ 50% падения базовых значений корковой перфузии.
- Затем судно клип помещается непосредственно перед бифуркации ОСА, чтобы избежать ретроградного потока во время arteriotomy.
- Arteriotomy осуществляется между проксимальным лигируют шва и судно клипа на ОСО с микро-ножницы (ближе к перевязке).
- Тепло-притупляются силиконовым покрытием нейлона 7-0 шва вводят через arteriotomy и передовых, пока не достигнет судно клипа. 2 оставшиеся свободные швов воротник слегка затянуть вокруг ОСО между arteriotomy и судно клипа, чтобы избежать обратного потока утечки через ОСО, с осторожностью, чтобы не травмировать стенки артерий, а затем судно Клип снят.
- ЭКА определена, расчлененный как можно больше (вблизи ее бифуркации на язычной и верхнечелюстной артерий), обезболивающий укол (с силовой агрегат к 1), и делится с микро-ножниц.
- Две свободные нити воротника (7-0 шелк) готовятся вокруг проксимальных ICA чуть выше бифуркации ОСА.
- ОСО временно закрыт с судна клипа. Поток окклюзии проверяется ~ 50% падения базовых значений корковой перфузии.
- Затем ICA временно закрыт с судна клип выше два свободных воротник швы, чтобы избежать ретроградного потока во время arteriotomy.
- Arteriotomy осуществляется с помощью микро-ножницы в отраженном ЭКА близки к пню.
- Тепло-притупляются силиконовым покрытием нейлона 7-0 шва вводят через arteriotomy в странах ЕЦА и передовых, пока не достигнет прикладной судна клип в ICA. 2 свободные швы воротника в проксимальных ICA мягко ужесточили вокруг проксимальных ICA, чтобы избежать рефлюкса кровотока через ICA, с достаточно внимания, чтобы не травмировать стенки артерий, а затем судно Клип снят.
- Окклюзии шов медленно продвигались по внутренней сонной артерии (ВСА) в сторону основания черепа до мягкого не почувствуете сопротивление. Одновременное падение церебрального кровотока значение в процентах (= 80%) по сравнению с исходным подтверждается лазерной допплеровской флоуметрии. 2 воротник швы затягиваются вокруг вставленной нити.
- Для переходных мозговой ишемии экспериментов, окклюзии шов аккуратно снята через 45 минут. На этот раз точка может быть изменена для различных экспериментальных целей.
- После снятия шва нитью, сайт arteriotomy закрыта, чтобы избежать послеоперационных кровотечений. В методе Коидзуми, это связано с ужесточением надежно воротник швов вокруг ОСО. В технике Лонга, в arteriotomy сайт на базе ЕЦА является обезболивающий укол, то воротник швов на проксимальной МКА являются ослабил и снял для восстановления сонной потока.
- Чтобы закрыть разрез, подчелюстной железы и СКМ укладывать на операционном поле. Края раны, затем приблизить ткани клей в шейном и кожи головы районов. Кроме того, рассасывающиеся основной шов или металл может быть использован, чтобы закрыть рану особенно когда долгосрочного выживания животного предназначено.
- После закрытия разреза, животное получает 1 мл теплой солевой подкожно, как объем пополнения. Дозы соответствующих анальгетиков (т.е. Бупренорфин на 0,05-0,1 мг / кг) следует использовать, чтобы минимизировать боль животного и дискомфорт во время восстановительного периода. Анимал удаляется из хирургического набора и помещен в теплой области восстановления / клетку, чтобы предотвратить переохлаждение, со свободным, легким доступом к мягкой пищи и воды.
- не наблюдается дефицита
- отказа продлить контрлатеральной передней лапой (легкая координационного неврологического дефицита)
- кружили в направлении контралатеральной на инфаркт (умеренная координационного неврологического дефицита)
- падения в направлении контралатеральной к инфаркта (тяжелая координационного неврологического дефицита)
- депрессии уровень сознания, не стихийное движение
- После 24 часов реперфузии MCA, выживших мышей взвешивали, глубоко под наркозом с 4% isoflorane и принес в соответствии с утвержденным протоколом.
- Мозг осторожно удаляют и помещают в мозг мыши слайсер матрицы, и весь головной мозг является секционного коронки на 2 интервала мм.
- Разделы погружены в 2% ТТС в фосфатном буферном растворе (PBS) при 37 ° С в течение 20 минут. После окрашивания ТТС, infracted области отображается как белый (неокрашенных) тканей, прилегающих к красного кирпича (жизнеспособных) ткани (рис. 1).
- Последовательные разделы фотографируются с помощью цифровой камеры, а площадь инфаркта измеряется с программой J изображения.
- Области инфаркта (белые, неокрашенные), площадь ипсилатерального полушария (белый и красный кирпич, окрашенные) и области контралатерального полушария (красный кирпич, окрашенные) измеряются для каждого раздела. Объем рассчитывается путем суммирования репрезентативных районов во всех разделах и умножения на толщина среза. После исправления для купирования, объем миокарда рассчитывается по следующей формуле 9:
Исправлено Инфаркт Объем (CIV),% = [контралатеральной объема полушария - (объем ипсилатерального полушария - инфаркт объема)] / контралатеральной полушарии объем х 100
3. MCA окклюзии хирургии:
4 Коидзуми метод
3 Лонга Метод
Дальнейшая процедура во многом сходится:
4. Послеоперационное неврологическое обследование
После животное приходит в общее сознание, неврологического дефицита можно оценить по простой шкале (пятибалльная шкала) следующим образом 3:
5. Окрашивание и количественного измерения объема мозга инфаркта
6. Представитель Результаты
После окклюзии и реперфузии MCA через левую ОСО установить переходный церебральная ишемия, животных умерщвляют и их коронки секционного мозги окрашивали TTC для оценки объема инфаркта (рис. 1).
Рисунок 1. TTC-окрашенных серийный корональные разделы мозга (2 мм) от мышей, подвергнутых воздействию MCA окклюзии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Модель MCAO является признанным модель, которая воспроизводит ишемии головного мозга у мышей вида. Эта модель впервые была использована в крыс, а затем адаптированных к мышам. Как избежать удаление фрагментов костей черепа, чтобы исключить влияние хирургических манипуляций на проницаемость гематоэнцефалического барьера и внутричерепное давление, является преимуществом данной методики. Однако, много переменных, таких как деформация связанных различия 10, размер шовного наконечник 11, длительность окклюзии 6, температура тела 12, анестезия 13, и другие факторы могут привести к несогласованности в инфаркта объемов в этой модели.
Есть определенные технические детали, которые требуют упоминания:
- Покрытие конце шва будет создавать гладкие и управляемой шва для окклюзии СМА со снижением риска перфорации.
- Деликатно отдельной и безопасной блуждающего нерва из соседних артерий так что это не случайно ограничен в воротник швом. Убедитесь в том, чтобы использовать два воротника швы, чтобы избежать кровотечения ретроградной через arteriotomy при подъеме окклюзии шва и затяните их осторожно, чтобы избежать травмирующих артериальной стенки.
- Крылонебный артерия отходит от МКА после ОСО бифуркации. Для того чтобы избежать отклонения кончик возрастанию шва в крылонебный артерию вместо ICA, настроить хирургических платформы держать голову мыши и шею в прямом направлении. Это отклонение является общим для обоих Коидзуми и техники Лонга, поэтому необходимо соблюдать осторожность в любом порядке.
- Лазерной допплеровской флоуметрии является метод мониторинга в реальном времени кровотока в различных анатомических областях, и применяется в нашем эксперименте для измерения потока крови в область мозга поступает через MCA. Это значительно повышает точность позиционирования шва, и таким образом обеспечивает получение устойчивых результатов. Это отметил преимущество перед менее точные методы измерения длины шва должны быть вставлены, которые восприимчивы к вмешательству анатомических вариациях.
- Временное увеличение лазерной допплеровской флоуметрии при вставке вашего шва через ОСО и ICA гарантирует, что вы движетесь в правильном направлении, и близко к МСА устья.
- Затылочной артерии чаще всего возникает из проксимальных ЭКА (хотя иногда от МКА) в задне направлении. Это должны быть определены (в некоторых случаях лигируют) во избежание возможных ошибок при вставке шва.
- Для уменьшения изменчивости миокарда, поддерживать температуру корпуса мыши устойчивый во время операции и во избежание переохлаждения после операции.
- Используйте TTC окрашивания до 72 часов после операции MCAO для анализа объема инфаркта соответствующим образом. Для более точках выживаемость использовать другие методы окрашивания, таких как крезиловый окрашивания фиолетовый, чтобы определить размер инфаркта.
| Коидзуми Метод | Метод Лонга | |
| Сайт вставки шва | Ипсилатеральная общей сонной артерии | Ипсилатеральная наружной сонной артерии |
| Постоянный артериальной жертвы | Общей сонной и наружной сонной артерии | Внешние сонной артерии |
| Риск смертельного интраоперационной артериальной разрыв / кровоизлияние | Менее озабоченность | Большой интерес |
| Возможность шва утечку в крылонебный артерии | Да | Да |
| Процедурные время | Вообще быстрее | Вообще больше |
| Лазерной допплеровской флоуметрии: Процент падения по сравнению с исходным | > = 80% | > = 80% |
| Лазерной допплеровской флоуметрии: окклюзия / реперфузии тенденции |
|
|
Таблица 1. Сравнение двух методов внутрипросветный окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) у мышей
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никакого конфликта интересов.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Animal | Harlan Laboratories | 20-26 grs | |
| Dissection microscope | Microscope | Leica Microsystems | 6.3:1 zoom | |
| Fiber optic illuminator | Illuminator | TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA | FO1–-150 | |
| Isoflurane | Anesthesia | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| SuperCut Iris scissor, straight | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14218 | |
| Vannas micro-scissor, straight | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Dumont fine tip forceps | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 503290 | |
| Vessel clip | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14120 | |
| High Frequency Desiccator 900 | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 500397 | |
| 7-0 surgical Nylon monofilament suture | Suture | Ethicon Inc. | 1647G | Suture for occlusion |
| 7-0 surgical Silk suture | Suture | Ethicon Inc. | 7733G | Suture for ligation |
| Silicone RTV adhesive | Silicone rubber | World Precision Instruments, Inc. | 1571 | |
| Vetbond | Tissue adhesive | 3M | 70200746587 | |
| Puralube Vet Ointment | Eye ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Buprenorphine hydrochlorode | Analgesics | Hospira Inc. | NDC 0409-2012-32 | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, Inc. | 501292 | ||
| PeriFlux System 5000 | TCD flowmetry | Perimed | ||
| BAT-12 | Rectal thermometer | World Precision Instruments, Inc. | BAT-12R | |
| T/PUMP, TP600 | Thermal blanket | Gaymar Industries | ||
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Mice brain matrix slicer | Brain slicer | Zivic Instruments | BSMAS001-1 |
References
- Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).
- Lloyd-Jones, D. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, e21-e181 (2009).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 84-91 (1989).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurol Res. 19, 641-648 (1997).
- Fujii, M. Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 28, 1805-1810 (1997).
- Bederson, J. B. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17, 1304-1308 (1986).
- Qi, X., Hosoi, T., Okuma, Y., Kaneko, M., Nomura, Y. Sodium 4-phenylbutyrate protects against cerebral ischemic injury. Mol Pharmacol. 66, 899-908 (2004).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56, 196-200 (2005).
- Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism? Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).
