Summary
Nós descrevemos um método para processar e tela de campo coletados mosquitos para uma diversidade de vírus por cultura de células Vero ensaio. Empregando esta técnica, temos detectados nove tipos diferentes de vírus provenientes de 4 famílias taxonômicas em mosquitos coletados em Connecticut.
Abstract
Os mosquitos transmitem uma série de vírus diferentes, incluindo importantes patógenos humanos, tais como vírus do Nilo Ocidental, o vírus da dengue eo vírus chickungunya. Muitos desses vírus se intensificaram nas suas gamas endêmicas e se expandiu para novos territórios, necessitando de programas eficazes de vigilância e controle para responder a essas ameaças. Uma estratégia para monitorar a atividade do vírus envolve a coleta de um grande número de mosquitos dos locais endêmicos e testá-las para a infecção viral. Neste artigo, descrevemos como lidar, processo e tela de campo coletados mosquitos de vírus infecciosos de células Vero por ensaio de cultura. Os mosquitos são classificadas por localização armadilha e espécies, e agrupados em pools contendo ≤ 50 indivíduos. Espécimes agrupados são homogeneizados em salina tamponada com um misturador-mill ea fase aquosa é inoculada em culturas de células Vero confluentes (Clone E6). Culturas de células são monitorados para efeito citopático do dia 07/03 pós-inoculação e qualquer vírus cresceu em cultura de células são identificadas pelos testes de diagnóstico apropriado. Ao utilizar esta abordagem, temos isolados 9 tipos diferentes de vírus a partir de mosquitos coletados em Connecticut, EUA, e entre estes, cinco são conhecidos por causar doenças no homem. Três destes vírus (vírus do Nilo Ocidental, vírus Potosi e La Crosse vírus) representam novos registros para a América do Norte ou da região da Nova Inglaterra desde 1999. A capacidade de detectar uma grande diversidade de vírus é fundamental para monitoramento ambos estabelecidos e vírus emergentes na população de mosquitos.
Protocol
1. Triagem e identificação de mosquitos
- Os seguintes procedimentos são realizados em uma bancada de laboratório aberto em uma dedicada biossegurança de nível 2 (BSL-2) por pessoal de laboratório que são treinados para trabalhar com os mosquitos vivos. A "cadeia de frio" é mantida durante todo o procedimento.
- Anestesiar os mosquitos adultos vivem colocando bolsa coletora de mosquito em um freezer -20 ° por 5 minutos. Saco de transferência de coleção para um recipiente isolado contendo gelo seco. Feche a tampa e expor mosquitos para dióxido de carbono durante 1-3 minutos para garantir a completa knock-down.
- Toque mosquitos anestesiados em uma panela pré-refrigerados colocado sobre uma cama de gelo seco. Individual separada mosquitos fêmeas usando uma pinça fina e coloque em copos de plástico. Cubra com tampa e coloque em copos de gelo molhado.
- Identificar as espécies de mosquitos utilizando chaves taxonômicas descritiva com base na morfologia externa mosquito com o auxílio de um microscópio estéreo de dissecação (10-60X zoom) montado em uma mesa de frio eletrônica.
- Combine identificou espécies de mosquito em piscinas de ≤ 50 indivíduos em 2 mL pressão cap-frascos contendo um BB de cobre. Frascos estão identificados com um identificador exclusivo.
- Após a identificação de todos os mosquitos, os frascos são colocados em sacos etiquetados e mantidos em um refrigerador de isopor contendo gelo seco.
- Loja pools de mosquitos em um freezer -80 ° C até que o teste do vírus.
2. Considerações de biossegurança para isolar vírus a partir de mosquitos
- Os seguintes procedimentos são realizados em um nível de biossegurança 3 (NB-3) de laboratório por funcionários que são treinados para trabalhar com este nível de contenção de 1. Laboratórios, equipamentos, procedimentos e práticas estão sujeitos à fiscalização institucional, estaduais e federais e de inspeção. Buscar a formação adequada e aprovação antes de tentar os seguintes protocolos.
- Usar o equipamento de proteção individual (EPI) para cada procedimento, como batas descartáveis, luvas, protetores faciais, e respiradores.
- Desinfetar superfícies de trabalho com álcool 70% antes e após os procedimentos de completar.
- Culturas de células e materiais potencialmente infecciosos são tratados de Classe II biossegurança gabinete (BSC).
- Pools de mosquitos são homogeneizadas em um misturador-mill que é colocado dentro de um BSC.
- Homogeneizados de mosquito são centrifugadas em uma microcentrífuga anti-aerossol. Se este procedimento não pode ser realizada dentro de um BSC, o operador deve usar um respirador durante a operação e recuperação de amostras da centrífuga.
- Pipetas e pontas de pipeta de manuseio de materiais no BSC (biossegurança gabinete) são embebidos em água sanitária a 10% antes da autoclavagem. Todos os resíduos de laboratório é descontaminados em autoclave antes do descarte.
3. Preparação de células Vero
- Decantar meios de cultura de um grande frasco de cultura de tecidos (175 cm 2) de células Vero confluentes (Clone E6) em copo resíduos contendo lixívia.
- Lave as células Vero, adicionando uma alíquota de 5 mL de PBS e agite sobre a camada de células e ao longo dos lados do frasco certificando-se cobrir completamente monocamada inteiro.
- Decantar PBS em copo de resíduos.
- Adicionar 2,5 mL de tripsina-EDTA e agite sobre camada de células certificando-se cobrir completamente monocamada inteiro.
- Incubar balão em incubadora por 5 minutos a 37 ° C CO, 5% 2.
- Agitar suavemente e frasco agite para remover as células da superfície inferior. As células devem deslizar facilmente; incubar um adicional de 1-5 minutos se as células não são facilmente escorregar.
- Adicionar 5 mL de Minimal Essential Media (MEM), 5% de soro fetal bovino (FBS), usando uma pipeta sorológica e pipeta up-and-down 10-20 vezes para quebrar os aglomerados de células.
- Adicionar um adicional de 15 mL de MEM, 5% FBS para um volume total de 22,5 mL e misture bem.
- Coloque 40 frascos pequenos cultura de tecidos (25 cm 2) na vertical em dois racks (20 frascos / rack).
- Coloque o racks contendo frascos dentro da cabine de segurança biológica e remover capacetes frasco, colocando tampas em frente dos frascos.
- Dispense 4 mL de MEM, FBS 5% em cada frasco utilizando uma pipeta sorológica.
- Dispense 0,5 mL células em suspensão em cada frasco (~ rácio divisão 1:6) Substitua as tampas frasco.
- Adicionar 50 mL de MEM, 5% FBS de volta para o balão de grande cultura de tecidos de origem, contendo suspensão de células restantes (~ 2,5 ml) e retornar balão até a incubadora. O frasco mesma cultura grande tecido pode ser reutilizado até 5 passagens e, em seguida, um frasco deve ser novo set-up para substituí-lo.
- Coloque pequenos frascos de cultura de tecidos em pilhas de bandeja. Redemoinho da bandeja para se certificar de que a mídia de maneira uniforme cobre o fundo do charlatões.
- Coloque pequenos frascos na incubadora a 37 ° C CO, 5% 2 e crescer durante a noite até confluentes 80-90%.
4. Preparação dos pools de mosquitos
- Manter pools de mosquitos frio durante os procedimentos de teste. Use pré-refrigeradosracks freezer e liquidificador moinho de cassetes, gelada reagentes e uma centrífuga refrigerada durante o processamento de pools de mosquitos.
- Colocar os tubos contendo os mosquitos em um rack freezer pré-refrigerados e adicionar 1-1,5 mL PBS-G para cada tubo de mosquitos.
- Recuperar misturador moinho de cassetes do freezer. Coloque 24 tubos em cada cassete e depois segura no misturador-mill.
- Homogeneizar as amostras durante 4 minutos a 25 ciclos / segundo. O moinho misturador sacode os tubos em alta velocidade e um BB de metal dentro de cada tubo rompe o tecido do mosquito.
- Centrifugar os tubos por 6 minutos a 7.000 rpm.
- Colocar os tubos de volta para racks freezer até inoculados em células Vero.
5. Inoculação de células Vero com homogenatos piscina mosquito
- Verifique pelo menos um frasco de cultura de tecido de cada série em microscópio invertido para assegurar a saúde e confluência celular adequada; esperar cerca de 80-90% de cobertura.
- Line up 20 frascos pequenos cultura de tecidos em um rack e frascos de etiquetas com números de adesão correspondente de cada grupo mosquito.
- Solte as tampas e mais decantar dos meios de comunicação de frascos de cultura de tecidos em copo de resíduos. Deixe a mídia o suficiente no frasco completamente monocamada de células do revestimento.
- 100μL alíquota do sobrenadante de cada grupo mosquito processados para o balão correspondente cultura de tecidos.
- Recolocar e apertar cap garrafa de cultura.
- Lay frascos de cultura de apartamento no shaker por 5 minutos (temperatura ambiente) a 35-40 rpm.
- Retorno de 20 frascos de cultura de tecidos para a posição vertical em um rack e coloque no BSC.
- Desoperculação 3 frascos de cultura de tecido de uma só vez, dispensar quatro meios de crescimento mL em cada frasco utilizando uma pipeta sorológica, recoloque as tampas.
- Certifique-se que a ponta da pipeta não contato com o gargalo do balão cultura ou lábio. Trocar a ponteira, se necessário, se o contato é feito com o frasco.
- Frascos de cultura de tecidos incubar a 37 ° C, 5% CO 2.
6. Triagem células Vero para o crescimento do vírus
- Tela inoculados frascos de cultura de tecidos para sinais de infecção viral, o efeito citopático (CPE), 3-7 dias após a inoculação.
- Inspecionar visualmente culturas de células para CPE e / ou contaminação pela inclinação do frascos e examinar os meios de comunicação que reúne na parte inferior do balão. A mídia vai aparecer nublado como as células se deterioram durante o CPE ou devido ao crescimento de leveduras, fungos ou contaminação bacteriana.
- Re-examinar culturas de células que exibem media nublado em microscópio invertido. Vírus fará com que as células se tornam deformadas e libertar-se dos frascos de cultura. Culturas de células com contaminantes visíveis, por exemplo, o fermento, outras bactérias, fungos ou detritos mosquito pesados, são re-testadas, passando a piscina mosquito original através de um filtro de seringa 0.22μM.
- Assepticamente dispensar 1-2 mL de mídia a partir do vírus-positivos culturas de células em criotubos rotulados com uma pipeta sorológica.
- Culturas de vírus são armazenadas a -80 ° C até identificados utilizando os ensaios de diagnóstico apropriado.
7. Preparação de reagentes
- MEM, 5% FBS. Dissolver 37,6 g de MEM em pó em um volume final de 4 L de dd H 2 0. Dispense solução em 500 mL em frascos de alíquotas de mídia e autoclave. Quando a solução tiver arrefecido, adicionar assepticamente 26 inativado pelo calor mL de soro fetal bovino, 5,2 mL L-glutamina, 5,2 anti-biotic/mycotic mL, e 10,4 mL de bicarbonato de sódio 7,5% para cada garrafa. Armazenar a 4 ° C.
- PBS-G. Dissolver 16 g NaCl, 0,4 g KCl, 2,3 g Na 2 HPO 4, 0,4 g KH 2 PO 4, e 4 mL de 0,5% Vermelho Fenol em 1000 mL dd H 2 0. Ajustar o pH a 7,1-7,4 com 2 N NaOH (se necessário). Num copo separado, o calor de 600 mL H 2 0 a ferver. Remover da placa-quente, adicione 10 g de gelatina, e dissolver. Adicione a gelatina dissolvida solução para a solução PBS e ajustar o volume final de 2 L com dd H 2 O. Dispensar 100 mL de solução em garrafas e autoclave. Quando a solução tiver arrefecido, adicionar assepticamente 42,8 ml de soro de coelho inativado pelo calor e 1,4 anti-biotic/mycotic mL. Armazenar a 4 ° C.
- PBS lavar celular. Adicionar 50 mL 10X Dulbecco PBS a 400 mL dd H 2 O. Ajustar o pH para 7,1 com NaOH 2 N. Ajustar o volume final de 500 mL com dd H 2 O. Solução de filtro com unidade de vácuo 0.2uM filtro. Dispense em 5 mL em alíquotas de 8 mL tampa de rosca tubos. Armazenar a 4 ° C.
8. Resultados representante
Nove diferentes de vírus provenientes de 4 famílias taxonômicas foram recuperados a partir de mosquitos coletados durante a vigilância contínua em todo o estado de Connecticut 1997-2010 (tabela 1). Cinco desses vírus são conhecidos por causar doenças no homem, os patógenos mais importantes que estão sendo vírus do Nilo Ocidental e Oriental, vírus da encefalite eqüina. Novas descobertas incluem: o primeiro isolamento do WNV a partir de mosquitos coletados emAmérica do Norte em 1999 2, o primeiro isolamento do vírus Potosi, no nordeste dos EUA em 2000 3, eo primeiro isolamento do vírus La Crosse na Nova Inglaterra em 2005 4.
| Vírus | Família | Não. isola | Locais No. | Não. ano detectado | Doença humana | Refs. |
| Vírus do Nilo Ocidental | Flaviviridae | 1002 | 94 | 12 | Moderada a grave, febre, encefalite | 2,5 |
| Oriental vírus da encefalite eqüina | Togaviridae | 292 | 41 | 10 | Encefalite, grave | 6,7 |
| Highlands J vírus | Togaviridae | 178 | 39 | 11 | Não conhecido | 6 |
| Jamestown Canyon vírus | Bunyaviridae | 305 | 74 | 14 | Leve a moderada, febre, meningite | 8 |
| Vírus Potosi | Bunyaviridae | 259 | 76 | 4 | Não conhecido | 3 |
| Cache Valley vírus | Bunyaviridae | 114 | 51 | 8 | Leve a grave, febre, doença neurológica em dois casos documentados | |
| Trivittatus vírus | Bunyaviridae | 83 | 21 | 11 | Não conhecido | |
| La Crosse vírus | Bunyaviridae | 1 | 1 | 1 | Moderada a encefalite, grave | 4 |
| Flanders vírus | Rhabdoviridae | 4 | 4 | 2 | Não conhecido |
Vírus tabela 1. Detectado no campo de coleta de mosquitos por Vero ensaio de cultura de células. Os mosquitos foram coletados durante a vigilância em todo o estado de Connecticut 1997-2010.
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Discussion
Vero ensaio de cultura celular serve como um método eficaz para mosquitos tela de campo recolhidas para uma diversidade de vírus. Isto contrasta com os métodos moleculares que atingem especificamente a um ou alguns vírus de interesse. Além disso, descobrimos que ensaio de cultura de células Vero é tão ou mais sensível do que a RT-PCR 7 e fornece-nos isolados do vírus que são armazenados em nossa coleção de referência para estudos futuros. No entanto, os sistemas de cultura de células pode não ser apropriada em muitos casos. Esta abordagem incorre em despesas adicionais ea formação exigida para crescer vírus em um laboratório de NB-3, no entanto, estes custos podem ser compensados por fontes relativamente barata para cultura de células. É importante notar também que a maioria mas não todos os vírus mosquito-borne produzir CPE em cultura de células Vero 9,10. Vírus da dengue é uma notável exceção que deve ser rastreada por um outro teste de diagnóstico. Idealmente, uma combinação de métodos de cultura tanto molecular e celular são usados para testar para a infecção viral. Estamos usando atualmente convencional e RT-PCR quantitativa ensaios 4,11,12, às vezes em conjunto com o seqüenciamento, para identificar vírus isolados em cultura de células, e para confirmar a infecção na piscina mosquito.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos as importantes contribuições dos drs. John Anderson, Andrew principal e Shirley Tirrell a este estudo. Este trabalho foi financiado em parte por concessões do Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) e do Departamento de Agricultura dos EUA (58-6615-1-218, CONH00768 e CONH00773).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16140 | |
| Anti-biotic/mycotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. | GIBCO, by Life Technologies | 25080 | |
| L-Glutamine 200mM 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Powdered minimal essential medium (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11700 | |
| 10X Dulbecco’s PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14080 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15400 | |
| Rabbit serum | GIBCO, by Life Technologies | 16120 | |
| Vero Cells (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 | Falcon BD | 353112 | |
| Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 | Falcon BD | 353108 | |
| Copper-coated BB’s, 4.5 mm | Crosman | 0767 | |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 | |
| Isopack freezer racks | Eppendorf | 022510240 |
References
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