Summary
Microiontophoresis은 micropipette의 내부와 외부 사이의 전기 잠재력의 차이에 대한 응답으로 micropipette에서 이온의 움직임을 알아볼 수 있습니다. 생물 학적 활성 분자는이를 통해 전류에 비례하여 전달됩니다. 우리는 엑기스에서 내피 의존 vasodilation 공부를 미세 조작과 함께 아세틸콜린의 microiontophoresis을 설명합니다.
Abstract
Microiontophoresis는 실험 준비 이내에 지정된 사이트에서 용질을 제공하는 micropipette 팁 통한 전류의 흐름을 알아볼 수 있습니다. Microiontophoresis는 reproducibly 뉴런이 신경 전달 물질에와 neuropeptides를 제공함으로써 시냅스 전송 1 시뮬레이션할 수 있습니다. 무시할 수 량 (액체)이 변위는 실험 준비에 기계 소동을 방지합니다. 엑기스 3 이러한 기술을 채택하는 것은 vasodilation와 vasoconstriction의 메커니즘은 생체내 4,5에서 가장 미세한 수준에서 공부를 할 수있게되었습니다. 이러한 언어 전달의 주요 이점은이를 microvessels의 본질적인 속성을 공개 혈압 및 조직 혈액 흐름 체계 또는 재귀 변경, evoking 않고 microvascular 네트워크 내에서 정의된 사이트에서 공부하는 vasomotor 응답을 활성화합니다.
microiontophoresis의 제한은 관심을 사이트로 전달 에이전트의 정확한 농도가 확인할 6 어렵다는 것입니다. 그럼에도 불구하고, micropipette 팁에서 출시된 현재 방출의 강도와 기간에 비례 2,7, 그러한 것을 재현할 자극 - 반응 관계는 쉽게 정의 실험 조건 (아래에 설명된)에서 확인할 수 있습니다. microiontophoretic 전달에 영향을 미치는 추가적인 요인은 용질 농도와 솔루션에 자사의 이온화를 포함합니다. micropipette 팁의 내경이 유지 전류 counteracted 수 있습니다 diffusional '누출'을, 최소화하기 위해 ~ 1 μm의 이하해야합니다. 따라서 외부 (긍정적인) 전류는 양이온과 micropipette 내에서 그것을 유지하는 데 사용하는 부정적인 전류를 추출하는 데 사용됩니다.
micropipettes의 제작은 복잡한 전자 pullers 8 용이합니다. Micropipettes 그 필라멘트를 포함하는 유리 모세관 튜브에서 나온있는 백 엔드 ( "backfilled")에서 가득 micropipette의 일각에 '빅스'솔루션입니다. 이것은 micropipette의 루멘에 관심과 꺼내기 솔루션의 솔루션을 포함하고있는 주사기에 연결된 microcapillary 튜브를 삽입하여 이루어집니다. Micromanipulators는 실험 준비 시간 micropipettes의 원하는 위치를 설정합니다. 이동식 기지에 장착 Micromanipulators는 microvascular 네트워크 (아래 개발)의 지형에 따라 준비 주위에 위치하실 수 있습니다.
내피 의존 vasodilation 생산 : 마우스 cremaster 근육의 준비 arteriole (목성의 ID # 2874 관련 프로토콜을 참조)에 - 현재의 프로토콜은 아세틸콜린의 microiontophoresis (ACH + Club 호텔)를 보여줍니다. 자극 전달은 전자 트리거를 사용하여 디지털 이미지 수집과 동기화됩니다. Cx40 BAC - GCaMP2 유전자 변형 생쥐 9 사용은 생활 엑기스에 arteriolar 내피 세포에서 vasodilation을 기본 세포내 칼슘 반응의 시각화 수 있습니다.
Protocol
1. 애니멀 케어 및 사용
검토하고 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 승인에 따라, 적어도 12 주 된 수컷 생쥐를 사용합니다. 마우스 intraperitoneal (IP) 주입을 통해 pentobarbital 나트륨 (60 밀리그램 / kg)와 anesthetized 있습니다. 수술 절차 및 실험 프로토콜을 통해 마취는 필요에 따라 보조 (초기 주입의 10-20%, IP) (; 발가락이나 꼬리 공략 탈퇴 응답에 표시된 모든 30~60분)에 의해 유지됩니다. 실험 절차의 완료 후에 마우스 pentobarbital (IP) 및 경추 전위에 의해 euthanized과 과용이다.
2. Micropipettes 및 Microiontophoresis
- Microiontophoresis의 micropipettes는 (내부 팁 직경 ~ 1 μm의) 수평 피펫 풀러를 사용하여 borosilicate 유리 모세관 튜브의 준비가되어 있습니다. 우리는 강성을위한 ~ 5mm의 테이퍼를, 더 이상 tapers 더 유연하고 있습니다.
- Micropipettes은 18.2 MΩ 물속에 녹아있는 1M ACH (Figure1A - C)와 backfilled 있습니다. backfilling 들어, microcapillary 튜브가 관심의 작용제 (그림 1)이있는 주사기에 결합 0.2 μm의 필터에 연결됩니다. 이들은 쉽게 조작 (아래) 또는 상용 공급 업체로부터 구입할 수 있습니다. microcapillary 튜브는 micropipette가 채웁니다로 microcapillary 튜브를 철수하면서 micropipette와 ACH 솔루션 루멘으로 전달의 백 엔드에 삽입됩니다. 아래 방향의 팁과 micropipette 개최, 공기 방울이 부드럽게 micropipette를 flicking에 의해 제거됩니다.
- micropipette은 micromanipulator (그림 2)에 장착 홀더에 안전합니다. 홀더가 차례로 microiontophoresis 프로그래머의 긍정적인 단자에 연결된 외부 핀에 micropipette 이내 ACH 솔루션을 연결 은색 철사를하고 있습니다. 조직 준비의 가장자리에 보안 두 번째 은색 와이어는 micropipette의 끝에이 준비를 통해 생리 생리 식염수로 고급이므로 회로를 완료하기 위해 단자에 연결되어 있습니다.
- 유지 전류가 micropipette 팁이 arteriolar 벽에 인접한 위치에있을 때 (또는 형광 응답) vasodilation을 방지하기 위해 적용됩니다. 현재 유지하면 micropipette 팁 (내경 = 1 μm의) 및 작용제 농도의 크기가 다를 수 있지만 정의 매개 변수 (우리가 1M ACH, 1 μm의 팁을 위해 ~ 200 NA를 사용)에 대한 매우 재현할 수 있습니다 것입니다. 유지 전류는 이미지 수집의 시작과 동기화 전자 트리거 (보충 그림 1)을 통해 현재의 배출의 전달과 일치하는 중단됩니다.
3. 미세 조작
- XY 현미경 단계에 대한 사용자 지정 플랫폼은 강자성 스테인레스 스틸로 밖으로 가공되었습니다. 플랫폼 크기 (1 / 8 "X 12"X 13 ") 자기 기지 (그림 2B)로 준비에 의해 결정 위치를 사용하도록 보안 (그림 2A) 원하는. Micromanipulators으로 실험 준비 주위에 위치 micromanipulators 충분한 공간을 수 있습니다.이가 관심 사이트 (그림 2C)에 위치 micropipettes 준비 주변 가공 플랫폼에 직접 배치.
4. 대표 결과
- micropipette 팁이 arteriole에 인접한 위치로 ACH에 형광 반응 (ACH의 누출을 방지하기 위해 조정보다는 현재 유지)가 있습니다. 임계값 자극 아래 아무런 효과가 없었다. 그러나, 자극 강도가 증가로 내피 세포 칼슘 형광은 arteriole 따라 점차적으로 큰 거리 증가로 자극의 위치 (그림 3)에서 형광의 강도를 않았다.
그림 1. Microiontophoresis의 Pipettes를 Backfilling위한 방법. A) microcapillary 튜브 (녹색 화살표)가. B) microcapillary 관으로 공급됩니다 다음 1M ACH 가득한 주사기에 연결된 필터 0.2 μm의 (보라색 화살표)에 첨부된 압축 피팅 (파란색 화살표)에 보안이 백 엔드 및 솔루션을 통해 microiontophoresis의 피펫은 피펫이 가득되면 아래 팁을 보유) micropipette. C의 루멘을 채우기 위해 있질 부드럽게 거품을 (검은색 화살표)를 제거하기 위해 테이퍼 위에 끄적입니다.
그림 2. Micromanipulator 배치에 대한 사용자 지정 플랫폼입니다. .. 실험 준비를 주변에 위치) 강자성 스테인레스 스틸 플랫폼 XY translational 단계를 포함하는 사용자 정의 MVX10 현미경 기지에 배치되었다 B) 원형 마그네틱베이스는 소형 3 축 micromanipulators의 하단에 부착된 C) Micromanipulators (관련 프로토콜을 참조하십시오 : 조브의 ID # 2874)는 관심의 특정 사이트를 연구하기 위해 서요.IR 컴팩트한 크기와 다재 다능한 여러 micropipettes를 동시에 사용할 수 있도록합니다.
그림 3. Arterioles에서 칼슘 형광가. arteriolar 벽을 라이닝 내피 세포의 칼슘 형광은 자극 강도로 증가했다. 처음 3 패널 A) 250 NA, B에 형광 반응의 이미지)를 표시 500 NA와 C) 현재 1000 NA의 방출 (전체 500 MS 펄스 기간). 내피 세포의 칼슘 형광이 증가하는 이상의 거리를 AC (각각 ~ 130, 270 400 μm의)에서 괄호로 표시됩니다. 각 패널에 arteriole 전체 기준선은 ACH에 형광 반응 (F / 정)이 자극의 사이트에 기록된 위치를 나타냅니다. 증가 ACH의 자극에 대한 F / 정 대 시간의 D) 레코딩. 현재의 배출이 증가로, F / 정은 진폭과 기간이 증가했다. 100 NA의 자극이 임계값 이하이고 전혀 아무런 영향을 미치지 않았다 않습니다.
보충 그림 1. 전자 트리거에 대한 회로 다이어그램.이 회로는 개인용 컴퓨터의 병렬 포트와 인터페이스입니다. 그것이 5V의 지속적인 TTL 펄스를 제공하면 활성화됩니다. 7805 칩은 9 12V DC 전원 공급 장치 (해당하는 전압의 배터리가 괜찮습니다)에 연결된 5V의 전압 조정기입니다. 7805에서 출력은 쿼드 정무 스위치와 회로의 출력 전원을 제공합니다. 1K 저항에 걸쳐 입력은 컴퓨터에서합니다.
Discussion
여기에서 설명한 프로토콜 microiontophoresis에 대한 micropipettes 준비하고 구현하는 방법을 보여줍니다. 아세틸콜린의 배송은 anesthetized 마우스 arterioles에서 칼슘 신호 기본 내피 의존 vasodilation을 설명하는 데 사용됩니다. 우리의 결과는 설명되는 ACH가 microiontophoresis의 micropipette (그림 3)에서 전류 방출의 강도와 내피 세포의 칼슘 형광 증가를 증가하는 이상의 거리. 휴식 조건에서 형광 증가의 부족 micropipette에서 ACH 무시할 수 누출을 나타냅니다. 100 NA의 자극 강도 (그림 3, 전설)에 응답의 부족은 자극의 한계 강도가 증가 내피 세포의 칼슘을 필요는 것을 보여줍니다. 이 기술은 쉽게 다른 vasoactive 대리인 및 조직 준비에 적용할 수 있습니다.
실용적인 고려 사항 : arteriolar 반응을 연구하기 위해 microiontophoresis 작업에서 몇 가지를 인식해야합니다. 그것이 전달 작용제의 실제 농도를 결정하기 어려운 입증되었습니다 있지만, 자극 - 반응 곡선은 준비 시간과 사이에 재현할 수 있습니다. 이러한 펄스 기간은 상수 개최 (예, 500 MS)와 (; 그림 3 예, 250, 500 1000 NA) 배출은 현재 변화에 의해 수행할 수 있습니다. 또는 현재의 배출이 지속적으로 개최 수 있습니다 (예, 500 NA) 및 펄스 기간 다양한 (예, 250, 500 1000 MS). 정의된 작용제 농도의 행동에 대한 참조를 위해 준비가 적절한 솔루션 5 superfused 수 있습니다. 용질 방출을위한 원동력은 전기 요금의 움직임이기 때문에, 배달하는 에이전트는 micropipette에서 전이 될 수있는 그물 요금을 휴대해야합니다. 관심 에이전트가 기본 전하 캐리어 있는지 확인하기 위해, 그것은 전기 삼투을 최소화하기 위해 고농도 (예를 들어, ACH 1 M)에서 해산합니다. 이것은 micropipette의 충전 솔루션의 산도를 조작이 필요하면, 차량 컨트롤은 어떤 특이 현상이 효과를 확인할 필요가 있습니다. 적절한 컨트롤도 혼자 전류의 통과를 위해 수행되어야합니다 (예 : isotonic 호수 가득한 micropipettes를 사용하여). 릴리스의 해당 사이트에서 에이전트의 확산에 대한 효과적인 거리는 ascertained되어야하며 micropipette가에 위치이므로 가장 쉽게 생리적 반응 (예, vasodilation 또는 ACH의 배출에 따라 세포 내 칼슘의 증가)의 실종에 의해 경험적으로 결정됩니다 대상 사이트에서 거리를 정의. 연습에 효과적인 확산 거리가 크게 micropipette의 끝에이 조직의 위치에 얼마나 영향이며, 조직과 팁로 아래로 누르면 끝이 occluded 경우 예를 들어, 배출이 장애보다. 과도한 결합 조직, 특히 골칫거리이며, 수술 준비하는 동안 조직 표면에서 제거되어야합니다. 주의는 또한 지정된 에이전트의 팁을 파괴의 가능성을 부여해야합니다. 이것은 상대적으로 짧은 펄스를 (예 : ≤ 1 S)를 사용하여 최소화합니다. 지속 전류 (예 : 몇 초)으로 작용제 그것은 micropipette에서 일괄 작성 솔루션의 확산으로 대체 할 수있는 것보다 더 빠르게 일각에서 퇴학 수 있습니다.
하나는 (예를 들어, + 자극을 depolarizing K를 제공하기 위해) 지역 이온 환경을 변경하려고하는 경우에는 무시할 볼륨, microiontophoresis로 전이되기 때문에, 이것은 효과적으로 microiontophoresis로 달성되지 않을 수 있지만 쉽게 원하는 데 대량 액체의 압력 방출로 이루어진다 작곡. arteriole의 로컬 자극에 대한, 2-3 μm의 내부 직경과 micropipette 팁 분출 압력 4-5 PSI (28-35 kPa) 및 솔레노이드 밸브 10과 제어 펄스 기간 (예, 1 번째)와 함께 잘 작동합니다. microvessel에 micropipette에서 에이전트 지속적인 공급이 필요합니다 어디에, 압력 방출은 적절한 내부 팁 직경 (예 : ~ 10 μm의) 11,12의 micropipettes를 사용하는 것이 좋습니다. 꼭지 밸브로 알려진 높이의 정압 열은 ON / 정압 머리 잘 정의된, 저렴한를 제공합니다. 유량은 피펫 팁 및 운전 압력의 내부 직경에 의해 결정됩니다. 언제나처럼, 차량 제어 압력 방출의 특이 현상이 행동을 제외 필수적입니다.
Disclosures
동물과 관련된 모든 절차와 프로토콜은 미주리 대학의 동물 케어 및 사용위원회의 승인과 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 연구소 건강의 가이드와 함께 조화롭게 수행되었습니다.이 문서의 생산은 스탠포드 Photonics 후원했다.
Acknowledgments
저자 '실험실에서 연구가 건강 보조금 R37 - HL041026, R01 - HL086483 및 R01 - HL056786 (SSS)과 미국 공공 보건 서비스에서 F32 - HL097463 및 T32 - AR048523 (PB)에 의해 국립 연구소에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosilicate Glass Capillary Tubes | Warner Instruments | GC120F-10 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | model P-97 | |
| Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| adapter for Luer hub | Martech | AC1343 | To secure microcapillary tubing |
| 0.2 μm Nylon Titan filter | Sun Sri | 42204-NN | Low retention volume to minimize loss |
| 5 ml syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Pipette Holder | Warner Instruments | E45W-M12VH | |
| Silver Wire | Warner Instruments | AG10W | 0.25mm diameter |
| 3-axis micromanipulator | Siskiyou, Inc. | DT3-100, MXB, MXC, MGB/8 | Components for manipulator as shown |
| microiontophoresis current programmer | World Precision Instruments, Inc. | Model 260 | |
| trigger device | Custom | custom | circuit provided in Suppl. Figure 1 |
| stainless steel plate | McMaster-Carr | 1/8" X 12" X 12" | According to design |
| Intensified Digital Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | Integrated with Piper Control software |
References
- Majno, G., Palade, G. E. Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).
- Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).
- Grant, R. T. Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster). J. Physiol. 172, 123-137 (1964).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats. Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).
- Klitzman, B., Duling, B. R. Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle. Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).
- Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &, S. egal, S, S. Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle. FASEB J. 14, 197-207 (2000).
- Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo. Circ. Res. 92, 793-800 (2003).
- Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles. Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).
- Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction. FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).
- Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy. J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).
- Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice. Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).
- Grant, R. T. The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). J. Anat. 100, 305-316 (1966).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation. Acta Physiol. , (2011).
- Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels. Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).
