Summary
Microiontophoresis innebär förflyttning av joner från en mikropipett som svar på en skillnad i elektrisk potential mellan insidan och utsidan av mikropipetten. Biologiskt aktiva molekyler därmed levereras i förhållande till elektrisk ström. Vi illustrerar acetylkolin microiontophoresis i samband med mikromanipulation att studera endotelet-beroende vasodilatation i mikrocirkulationen.
Abstract
Microiontophoresis innebär passage av ström genom en mikropipett tips för att leverera ett löst ämne på en angiven plats inom en experimentell beredning. Microiontophoresis kan simulera synaptisk transmission 1 genom att leverera neurotransmittorer och neuropeptider på nervceller reproducerbart 2. Försumbara mängder (vätska) deplacement undviker mekaniska störningar för experimentella beredning. Anpassning av dessa tekniker för att mikrocirkulationen 3 har möjliggjort mekanismer vasodilatation och vasokonstriktion som skall studeras på mikroskopisk nivå in vivo 4,5. En viktig fördel med en sådan lokal leverans är så vasomotoriska reaktioner som skall undersökas i definierade platser inom en mikrovaskulära nätverk utan framkalla systemiska eller reflexiva förändringar i blodtryck och vävnad blodflöde, och därmed avslöjar inneboende egenskaper mikrokärl.
En begränsning av microiontophoresis är att den exakta koncentrationen av läkemedel levereras till platsen av intresse är svårt att avgöra 6. Ändå är dess release från mikropipett spetsen proportion till intensiteten och varaktigheten av vräkning nuvarande 2,7, kan ett sådant sätt att reproducerbart stimulus-responssamband lätt bestämmas under definierade experimentella förhållanden (beskrivs nedan). Ytterligare faktorer som påverkar microiontophoretic leverans inkluderar lösta koncentrationen och dess jonisering i lösning. Den inre diameter mikropipett spetsen bör vara ~ 1 mikrometer eller mindre för att minimera diffusion "läcka", som kan motverkas med en bibehållen ström. Således ett yttre (positiv) ström används för att mata ut en katjon och en negativ ström används för att behålla den inom mikropipetten.
Tillverkning av mikropipetter underlättas med avancerad elektronisk avdragare 8. Mikropipetter dras från glas kapillärrör med en glödtråd att "vekar" lösning i spetsen av mikropipett när den är fylld från baksidan slutet ("återfyllas"). Detta görs genom att sätta in en microcapillary slang kopplad till en spruta med lösningen av intresse och mata lösningen i lumen i mikropipetten. Micromanipulators aktivera önskad placering av mikropipetter inom experimentell beredning. Micromanipulators monterad på en rörlig bas kan placeras runt beredning enligt topografi mikrovaskulära nätverk (utvecklat nedan).
Detta protokoll visar microiontophoresis av acetylkolin (ACh + Cl -) på en arteriole av musen cremaster muskeln förberedelse (se tillhörande protokoll: JUPITER ID # 2874) för att producera endotelet-beroende vasodilatation. Stimulus leverans är synkroniserad med digitaliserade bilden förvärvet med en elektronisk utlösare. Användningen av CX40 BAC-GCaMP2 transgena möss 9 möjliggör visualisering av intracellulär kalcium svar underliggande kärlvidgning i arteriolär endotelceller i den levande mikrocirkulationen.
Protocol
1. Djurvård och användning
Efter granskning och godkännande från Institutional Animal Care och användning kommittén, hanmöss minst 12 veckor gamla användas. En mus är sövda med pentobarbital natrium (60 mg / kg) via intraperitoneal (ip) injektion. Under kirurgiska ingrepp och experimentella protokoll, är anestesin underhålls av kosttillskott (10-20% av initiala injektionen ip) som behövs (varje 30-60 minuter, angiven med tillbakadragande svar på tå eller svans nypa). Efter slutförandet av den experimentella proceduren musen är överdoserat med pentobarbital (IP) och avlivas av halsdislokation.
2. Mikropipetter och Microiontophoresis
- Microiontophoresis mikropipetter (intern spets diameter, ~ 1 mikrometer) bereds av borsilikatglas kapillärrör med en horisontell pipett avdragare. Vår har en ~ 5 mm kona för styvhet, längre smalnar är mer flexibla.
- Mikropipetter är återfylls med 1M ACH (Figure1A-C) löses upp i 18,2 Mohm vatten. För återfyllning är en microcapillary slang kopplad till 0,2 ìm filter kopplas till en spruta med agonist av intresse (Figur 1). Dessa kan lätt tillverkas (nedan) eller köpas från kommersiella leverantörer. Den microcapillary röret sätts in i bakdelen av mikropipett och ACH Lösningen levereras i lumen medan återkalla microcapillary röret som mikropipetten fyller. Håll mikropipett med spetsen nedåt, finns luftbubblor avlägsnas genom att försiktigt vicka på mikropipetten.
- Den mikropipett är säkrad i en hållare monterad i en mikromanipulator (figur 2). Hållaren har en silvertråd ansluter ACh lösning inom mikropipett till en extern stift, som i sin tur är ansluten till den positiva terminalen på en microiontophoresis programmerare. En andra silvertråd ställts på kanten av vävnaden preparatet är ansluten till den negativa terminalen för att slutföra kretsen som spetsen på mikropipett är avancerade in i fysiologisk koksaltlösning under beredningen.
- Ett behålla strömmen tillämpas för att förhindra vasodilatation (eller fluorescerande svar) när mikropipett spets är placerad i anslutning till arteriolär väggen. Att behålla aktuella kommer att variera med storleken på mikropipett spetsen (inre diameter = 1 mm) och agonist koncentration, men är mycket reproducerbar för definierade parametrar (vi använder ~ 200 nA för 1M Ach, 1 mm spets). Den behålla nuvarande upphör sammanfaller med leverans för utkast aktuella via den elektroniska avtryckaren (kompletterande figur 1) synkroniserad med uppkomsten av bilden förvärvet.
3. Mikromanipulation
- En anpassad plattform för ett XY-mikroskop skede var fabricerade av ferromagnetiska rostfritt stål. Plattform dimensioner (1 / 8 "x 12" x 13 ") gör tillräckligt med utrymme att placera micromanipulators runt experimentella preparat som önskas (Figur 2A). Micromanipulators fäst magnetiska baser (Figur 2B) aktiverar positionering som dikteras av beredningen. Dessa är placeras direkt på fabricerade plattform runt förberedelserna för positionering mikropipetter i områden av intresse (figur 2C).
4. Representativa resultat
- Med mikropipett spets placeras intill en arteriole finns fluorescens svar på ACH (behålla nuvarande än justeras för att förhindra ACh läckage). Under ett tröskelvärde stimulans sågs ingen effekt. Men som stimulusintensitet, ökat endotelceller kalcium fluorescens över allt större avstånd längs arteriole, liksom av fluorescens, på platsen för stimulering (Figur 3).
Figur 1. Metod för Återfyllning Microiontophoresis pipetter. A) En microcapillary röret (grön pil) är säkrade i en klämringskoppling (blå pil) som är ansluten till en 0,2 ìm filter (lila pil) som sedan är kopplad till en spruta fylld med 1M ACH. B) microcapillary röret matas in i microiontophoresis pipett via backend och lösningen är fördrivna för att fylla lumen i mikropipett. C) När pipetten är fylld, håll spetsen ner och knacka försiktigt över den koniska för att ta bort bubblor (svart pil).
Figur 2. Anpassade Plattform för mikromanipulator Placering. .. A) En ferromagnetiska rostfritt stål plattform placerades på en anpassad MVX10 mikroskop databas som innehåller en XY-translationell skede B) cirkulär magnetisk baser som sitter på botten av kompakt 3-axlig micromanipulators C) Micromanipulators placerade runt den experimentella preparat (se tillhörande protokoll: JUPITER ID # 2874) för att studera specifika platser av intresse. Denir kompakt storlek och mångsidighet att flera mikropipetter som ska användas samtidigt.
Figur 3. Kalcium fluorescens i arterioler. Kalcium fluorescensen hos endotelceller kantar arteriolär väggen ökade med stimulusintensitet. De första 3 paneler som visas bilder av fluorescens svar till A) 250 nA, B) 500 nA och C) 1000 nA utmatning aktuella (alla 500 ms pulslängd). Avståndet över vilken endotelceller kalcium fluorescens ökat indikeras med parentes i AC (~ 130, 270 och 400 ìm, respektive). Hänvisningen linje tvärs över arteriole i varje panel visar var fluorescens svar (F / Fo) till ACh spelades in på platsen för stimulering. D) Inspelningar av F / Fo kontra tid för att öka ACh stimuli. Som utkast nuvarande, ökat F / Fo i amplitud och varaktighet. Observera att 100 nA stimulans låg under tröskeln och hade ingen effekt.
Kompletterande figur 1. Kopplingsschema för elektronisk avtryckare. Kretsen är ansluten till en parallellport från en persondator. När den aktiveras det ger en konstant TTL puls 5V. Den 7805 chip är en 5V spänningsregulator ansluten till en 9-12V likström (ett batteri av rätt spänning är bra). Utgång från 7805 ger ström till Quad Bilaterala Switch och till utgången av kretsen. Ingång över 1K motstånd är från datorn.
Discussion
Protokollet som beskrivs här visar metoder för att förbereda och genomföra Mikropipetter för microiontophoresis. Leverans av acetylkolin används för att illustrera kalcium signalering underliggande endotel-beroende vasodilatation i arterioler av sövda musen. Våra resultat visar att avståndet över vilket ACh ökar endotelceller ökar kalcium fluorescens med intensiteten för utkast ström från microiontophoresis mikropipett (Figur 3). Avsaknaden av fluorescens ökar under vila förhållanden indikerar försumbar läckage av ACh från mikropipetten. Avsaknaden av svar på 100 nA stimulusintensitet (Figur 3, legenden) visar att en tröskel intensitet stimulering krävs för endotelceller kalcium för att öka. Dessa tekniker kan lätt anpassas till andra vasoaktiva läkemedel och preparat vävnad.
Praktiska överväganden: I arbetet med microiontophoresis att studera arteriolär reaktivitet bör flera saker skall erkännas. Även om det har visat sig svårt att fastställa de faktiska koncentrationen av levererade agonist, stimulus-respons-kurvor är reproducerbar inom och mellan förberedelser. Dessa kan utföras genom att hålla pulslängd konstant (t.ex. 500 ms) och varierande utkast nuvarande (t ex 250, 500 och 1000 nA, Figur 3). Alternativt kan kastas ut nuvarande hållas konstant (t.ex. 500 nA) och pulslängd varierade (t ex 250, 500 och 1000 ms). För att en hänvisning till de åtgärder som av en definierad agonist koncentration, kan preparatet superfused med lämplig lösning 5. Eftersom drivkraften för lösta utkast är elektrisk laddning rörelse, måste ombudet ska levereras bära en netto kostnad förskjutas från mikropipetten. För att säkerställa att agenten av intresse är det primära avgiften bärare, det är upplöst i höga koncentrationer (t.ex. ett M för ACh) för att minimera elektro-osmos. När detta kräver att manipulera pH mikropipett fylla lösning, är fordonets reglage behövs för att fastställa eventuella ospecifika effekter. Lämpliga kontroller bör också göras för passage av nuvarande ensam (t ex med hjälp av mikropipetter fyllda med isoton koksaltlösning). Det effektiva avståndet för spridning av agenten från dess plats av utsläpp bör utredas och är lättast bestäms empiriskt med försvinnandet av en fysiologisk reaktion (t.ex. vasodilatation eller en ökning av intracellulär kalcium vid utmatning av ACh) som mikropipett är placerad definierat avstånd från målet sajten. I praktiken är effektiv spridning avståndet starkt påverkas av hur toppen på mikropipett är placerad i vävnaden, t.ex. om spetsen trycks ner i vävnaden och dess spets är blockerad, än utkast är nedsatt. Överdriven bindväv är särskilt besvärande och bör tas bort från vävnaden ytan under kirurgiska beredning. Man bör också ges möjligheten att förbruka spetsen av utsedda ombud. Detta minimeras genom att använda relativt korta pulser (t ex ≤ 1 s). Med fortsatta strömmar (t.ex. flera sekunder) kan agonist utvisas från spetsen snabbare än den kan ersättas av diffusion från huvudavgasflödet fylla lösningen i mikropipetten.
Eftersom försumbar mängd förskjuts med microiontophoresis, om man försöker att ändra det lokala joniska miljö (t.ex. för att leverera en depolariserande K + stimulus), kan detta inte vara ett effektivt sätt uppnås med microiontophoresis men är lätt uppnås med tryck utmatning av bulk vätska har önskad sammansättning. För lokal stimulering av en arteriole, mikropipett tips med en inre diameter av 2-3 ìm fungerar bra med utmatning tryck 4-5 psi (28-35 kPa) och pulslängd (t ex 1 sekund) styrs med en magnetventil 10. Var uthållig leverans av en agent från en mikropipett på en microvessel krävs, är trycket ejection föredra att använda mikropipetter lämpliga interna tips diameter (t.ex. ~ 10 mikrometer) 11,12. En hydrostatisk kolumn med känd höjd med en kran ventilen ger en billig, väl definierade på / av konstant tryck huvud. Flöden bestäms av inre diameter pipettspetsen och den drivande trycket. Som alltid fordonets reglage är viktiga att utesluta ospecifik åtgärder tryck utkast.
Disclosures
Alla procedurer och protokoll som handlar om djur godkändes av Djurens skötsel och användning kommitté vid universitetet i Missouri och som utförs i enlighet med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur. Produktionen av denna artikel var sponsrad av Stanford Photonics.
Acknowledgments
Forskning i författarnas laboratoriet stöds av National Institutes of Health bidrag R37-HL041026, R01-HL086483 och R01-HL056786 (SSS) och F32-HL097463 och T32-AR048523 (PB) från USA Public Health Service.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Borosilicate Glass Capillary Tubes | Warner Instruments | GC120F-10 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | model P-97 | |
| Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| adapter for Luer hub | Martech | AC1343 | To secure microcapillary tubing |
| 0.2 μm Nylon Titan filter | Sun Sri | 42204-NN | Low retention volume to minimize loss |
| 5 ml syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Pipette Holder | Warner Instruments | E45W-M12VH | |
| Silver Wire | Warner Instruments | AG10W | 0.25mm diameter |
| 3-axis micromanipulator | Siskiyou, Inc. | DT3-100, MXB, MXC, MGB/8 | Components for manipulator as shown |
| microiontophoresis current programmer | World Precision Instruments, Inc. | Model 260 | |
| trigger device | Custom | custom | circuit provided in Suppl. Figure 1 |
| stainless steel plate | McMaster-Carr | 1/8" X 12" X 12" | According to design |
| Intensified Digital Camera | Stanford Photonics Inc | XR/Mega-10 | Integrated with Piper Control software |
References
- Majno, G., Palade, G. E. Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).
- Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).
- Grant, R. T. Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster). J. Physiol. 172, 123-137 (1964).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats. Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).
- Klitzman, B., Duling, B. R. Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle. Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).
- Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &, S. egal, S, S. Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle. FASEB J. 14, 197-207 (2000).
- Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo. Circ. Res. 92, 793-800 (2003).
- Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles. Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).
- Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction. FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).
- Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy. J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).
- Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice. Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).
- Grant, R. T. The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). J. Anat. 100, 305-316 (1966).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation. Acta Physiol. , (2011).
- Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels. Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).
