Summary
De stijfheid van de extracellulaire matrix van grote invloed op meerdere gedragingen van hechtende cellen. Matrix stijfheid varieert ruimtelijk overal een weefsel, en ondergaat wijzigingen in de verschillende aandoeningen. Hier hebben we methoden ontwikkelen om de ruimtelijke variatie in stijfheid in normale en fibrotische muis longweefsel met behulp van atomic force microscopie microindentation karakteriseren.
Abstract
Matrix stijfheid van grote invloed op de groei, differentiatie en functie van hechtende cellen 1-3. Op de macroschaal de stijfheid van weefsels en organen in het menselijk lichaam over meerdere orden van grootte 4. Is veel minder bekend over de manier waarop stijfheid varieert ruimtelijk in de weefsels, en wat de omvang en de ruimtelijke schaal van stijfheid veranderingen bij de ziekte van processen die resulteren in remodellering van het weefsel. Om beter te begrijpen hoe veranderingen in de matrix stijfheid om cellulaire fysiologie bij te dragen in gezondheid en ziekte, zijn de metingen van weefsel stijfheid verkregen op een ruimtelijke schaal die relevant zijn voor inwoner cellen die nodig zijn. Dit geldt met name voor de longen, een uiterst meegaand en elastisch weefsel waarin matrix remodeling is een prominente functie in ziekten zoals astma, emfyseem, hypertensie en fibrose. Te bepalen wat de lokale mechanische omgeving van longparenchym op een ruimtelijke schaal die relevant zijn voor inwoner cellen, hebben wij methoden ontwikkeld om rechtstreeks de lokale elastische eigenschappen van verse muizen longweefsel met behulp van atomic force microscopie (AFM) microindentation. Met de juiste keuze van de AFM indringlichaam, cantilever, en inspringing diepte, deze methoden is het mogelijk metingen van de lokale weefsel afschuifmodulus in parallel met fase contrast en fluorescentie beeldvorming van de regio van belang. Een systematische bemonstering van weefsel strips biedt kaarten van weefsel mechanische eigenschappen die lokale ruimtelijke variaties in afschuifmodulus onthullen. Correlaties tussen de mechanische eigenschappen en de onderliggende anatomische en pathologische kenmerken illustreren hoe stijfheid varieert met matrix depositie in fibrose. Deze methodes kunnen worden uitgebreid tot andere zachte weefsels en de ziekte-processen te onthullen hoe de lokale weefsel mechanische eigenschappen variëren door de ruimte en de progressie van de ziekte.
Protocol
1. Longweefsel Strip Voorbereiding
- Longweefsel is zeer compatibel en moeilijk te snijden in stroken voor de AFM karakterisering. Om tijdelijk het stabiliseren van de long-structuur voor het snijden, intratracheaal opblazen geïsoleerde muis longen met 50 ml / kg lichaamsgewicht van 2% een laag gel punt agarose (opgesteld in PBS) verwarmd tot 37 ° C. Afhechten van de luchtpijp en koelen van de opgeblazen longen in een bad van PBS bij 4 ° C gedurende 60 minuten. De agarose gel en zal opstijven in de luchtruim naar de longen structuur voorzichtig stabiliseren tijdens dit interval 5. Hogere concentraties agarose, dat wil zeggen 3-4%, kan worden gebruikt om verdere versterking van weefsel voor het snijden van stabilisatie.
- Snijd de agarose-gestabiliseerde muis longweefsel met een scheermes of scalpel in reepjes van 5 x 5 mm in lengte en breedte en 400 um in dikte, daarna wassen van de strips in een PBS bad voorverwarmd tot 37 ° C met behulp van een 100 ml bekerglas op een bench-top verwarmde roer plaat gedurende 5 minuten om de resterende agarose te verwijderen. Uit te sluiten grote luchtwegen en bloedvaten, knippen stroken van subpleural regio's ver van de belangrijkste stam bronchiën. Als luchtwegen en grote schepen af te beelden, gesneden stroken van longweefsel meer proximaal van de belangrijkste stam bronchiën.
2. AFM Microindentation en fluorescentie beeldvorming
- Te isoleren gebieden die van belang zijn voor AFM microindentation, kan weefsel worden gevisualiseerd door fasecontrast microscopie, of immunostained en gevisualiseerd met behulp van fluorescentie microscopie. Voor immunokleuring, blok weefsel strips met 5% serum van de bron van de gewenste secundaire antilichaam (in PBS) voor 2 uur zonder fixatie of permeabilisatie bij kamertemperatuur.
- Incubeer het weefsel strip met de juiste primaire antilichaam (bijvoorbeeld konijn anti-collageen I tot en met interstitiële collageen (1:250 verdunning), konijn anti-laminine (1:250 verdunning) te visualiseren om basale membraan visualiseren) in een well van een 12-well plaat op een rocker met een zacht schudden gedurende 1 uur, was monster drie keer voor vijf minuten elk met PBS, gevolgd door passende tweede antilichaam geconjugeerd aan fluorescerend label (bv. Alexa Fluor 546 geit anti-konijn secundair antilichaam (1:250 verdunning)) voor een uur bij kamertemperatuur.
- Uitgebreid wassen weefsel strips met PBS en op te slaan in PBS bij 4 ° C
- Onmiddellijk voorafgaand aan AFM karakterisering, bevestigt het weefsel strip aan een poly-l-lysine-gecoate 15 mm dekglaasje door het optillen van het dekglaasje van onder de drijvende weefsel, zorg ervoor dat het weefsel strip verspreidt gelijkmatig over het oppervlak dekglaasje, indien nodig, sandwich de strip met een tweede schone, ongecoat dekglaasje en toepassen van milde druk om met weefsel gehechtheid te helpen de poly-l-lysine-gecoate dekglaasje aan.
- Kalibreer de AFM-systeem na de fabricage van de opdracht onmiddellijk voorafgaand aan elke ronde van microindentation experimenten. Bepaal twee kritische parameters: 1) de cantilever veerconstante met behulp van de thermische fluctuatie methode in de lucht 6, en, 2) de cantilever doorbuiging gevoeligheid, dat is een parameter gebruikt om de fotodiode uitgangssignaal schaal om de werkelijke cantilever doorbuiging afstand, Δd. Kalibreer doorbuiging gevoeligheid door het verkrijgen van een standaard kracht-verplaatsing curve in PBS op een schoon glasplaatje berekenen vervolgens de helling van de kracht-verplaatsing curve (Fig.1B). In de kracht-verplaatsing curve meting, is de AFM tip uitgebreid naar en teruggetrokken uit het monster oppervlak op een locatie (zonder rastering in XY richtingen), met de doorbuiging van de cantilever, Δd, bewaakt als een functie van de tip verplaatsing, Δz .
Wij raden u aan een siliciumnitride driehoek cantilever met een 5-micrometer diameter borosilicaat bolvormig tip (Novascan). Met behulp van AFM probes met een veerconstante van 0,06 N / m, hebben we mechanisch gekarakteriseerd zachte materialen met schaar moduli verspreid over 100 tot 50.000 Pa.
- Veeg de onderkant van het monster dekglaasje met vloeipapier, monteer hem op een standaard glas glijbaan met vacuüm vet, monteer het glaasje op de AFM monster podium, en bedek het weefsel met 500 ui PBS (kamertemperatuur).
- Zet de microscoop voor oculair kijken naar de AFM tip in het centrum van het gezichtsveld af te stemmen door het aanpassen van de microscoop monster podium. Kies een gebied van belang op het weefsel door het verplaatsen van de AFM monster podium, schakel dan over naar CCD camera kijken naar fase contrast beeld en / of fluorescentie beelden van het weefsel record, zoals gewenst.
- Voer standaard AFM engagement de werking door het bewegen van de AFM tip langzaam naar beneden totdat het in contact komt met het monster.
- Nauwkeurige AFM microindentation karakterisering van zachte monsters vereist kleine inkeping diepte om te voorkomen dat grote lokale stammen die de Hertz model dat wordt gebruikt voor elastische modulus berekening ongeldig. Om te voorkomen dat grote stammen, uit te voeren inkeping in de trigger mode door het instellen van de cantilever maximale doorbuiging (trigger point) tot 500 nm. Deze doorbuiging limiet zal beperken demaximale indrukking kracht tot minder dan 30 NN (F = cantilever veerconstante * verplaatsing, of F max = 0,06 NN / nm * 500 nm = 30 nN).
Het inspringen snelheid moet worden gekozen dat zij voldoende langzaam elastische eerder visco-elastische eigenschappen van de zachte monster 7 te verkennen. Een snelheid bereik van 20 tot 20 micrometer per seconde is geschikt voor het longweefsel.
- Voor een enkele meting van een gebied van belang, verplaats de AFM sonde naar de locatie van belang en het uitvoeren van een inkeping met een standaard kracht-verplaatsing curve (de sonde beweegt alleen in Z-richting, zonder XY scannen) te verzamelen.
- Voor het geautomatiseerd in kaart brengen van een regio van belang, overschakelen naar Force-Map modus, selecteert u de scan formaat en de sample punten binnen het geselecteerde gebied. In Force-Map mode, de AFM tip rasters over het monster oppervlak tussen inspringen bewegingen, en verzamelt de individuele kracht-verplaatsing curven op elk punt binnen een bepaalde sample grid. Meer meetpunten zal een hogere ruimtelijke resolutie, maar het verlengen van de tijd die nodig is voor het in kaart brengen. We vonden het handig om een 16 x 16 monster rooster te gebruiken om een 80 x 80 micrometer ruimte kaart in een inkeping snelheid van 20 micrometer per seconde, die kan worden voltooid in ~ 10 minuten.
3. AFM Data Extraction
- Voor het berekenen van de Young's modulus, past de kracht-verplaatsing curve van de Hertz sferische inspringen model met behulp van de kleinste kwadraten niet-lineaire gebogen fitting 8 (fig. 1 A, C):
waarin F = k c * Δ d, is de kracht van de cantilever buigen, k c is de cantilever veerconstante, R bol tip straal, δ = Δ z - Δ d is inspringen en υ is het monster Poisson ratio (υ = 0,4 voor longweefsel 9). - Voor de beoordeling van de kwaliteit van de pasvorm, het berekenen van de SSR-waarde, of de som van de kwadraten van het verschil tussen de gegevens en de pasvorm waarden, tijdens de niet-lineaire curve fitting. Elimineer onbetrouwbare of niet-interpreteerbare metingen door de gegevens te verwijderen van de "slechte" bochten met grote hervorming van de veiligheidssector waarden.
- Indien gewenst, om te zetten elasticiteitsmodulus (E) naar shear modulus (G), met behulp van de relatie E = 2 x (1 + υ) x G. Om de ruimtelijke patronen van stijfheid verzameld in Force-Map mode te visualiseren, plot modulus gegevens in contourkaarten (bijvoorbeeld in 16 x 16 monster rooster over een 80 x 80 micrometer gebied).
- Voor het verwerken van een grote hoeveelheid kracht curve gegevens kan een aangepaste algoritme worden geschreven om automatisch te passen kracht-verplaatsing curves, extract moduli, en / of het plot elastographs volgens dezelfde procedures en parameters zoals beschreven in 3.2 en 3.3 (bijv. Matlab).
Figuur 1 (A) Schematische voorstelling van AFM microindentation van een zachte monster op een vaste ondergrond met behulp van een sferische sonde (Overgenomen met toestemming van Dimitriadis E., et al.. Biophys 2002 J 8). (B) Representatieve kracht-verplaatsing curve verzameld uit een schoon glaasje in PBS om vrijdragende doorbuiging gevoeligheid te bepalen. (C) Representatieve kracht-verplaatsing curves verzameld uit zacht (blauw) en stijf (rood) monsters met de bijbehorende parameters van (A).
4. Representatieve resultaten:
Figuur 2A toont een longparenchym strip bevestigd aan poly-l-lysine gecoat dekglaasje in PBS met een AFM sonde op zijn plaats direct boven gebied van belang en klaar voor microindentation mapping. Figuur 2B toont dat er in goed gesneden en gekleurd weefsel, de alveolaire microarchitectuur van het longparenchym goed bewaard gebleven, zoals waargenomen door immunofluorescentie kleuring voor basaalmembraan component laminine zonder fixatie of permeabilisatie. Figuur 2 CD geven immunofluorescentie kleuring voor collageen I in verse losgemaakte longen geoogst van muizen die eerder werden behandeld met PBS (fig. 2C), of behandeld met bleomycine (fig. 2D) tot fibrose 10 induceren.
Figuur 3A toont sample kracht-verplaatsing plots verkregen van de AFM microindentation. Met dezelfde uitgeoefende kracht, AFM tip genereert een groot inspringen op een zachte regio (blauwe lijn), wat resulteert in een relatief "platte" kracht-verplaatsing curve ten opzichte van een kleine inkeping en een "steile" kracht-verplaatsing curve voor een stijvere regio ( rode lijn). Voor het verkrijgen van schoon te dwingen curves, na elke inkeping van de AFM tip moet volledig worden teruggetrokken uit het monster oppervlak en vrij van contact voor de volgende inspringen. Dit contact vrije staat komt overeen met het vlakke gebied van de curve in figuur 3A, waar de tip vertaalt zonder cantilever doorbuiging. Figuur 3B toont een typische valse curve zonder een vlak gebied, die optreedt wanneer de tip is niet volledig teruggetrokken uit de steekproef oppervlak (bijv. zachte monster eenttaches tot punt), waardoor het onmogelijk is om het contactpunt te bepalen. Als de tip is volledig gevangen in soft monster kan de curve zien als weergegeven in figuur 3C, zonder duidelijke afbuiging maar klein geluid.
Figuur 4 toont afschuifmodulus gegevens uit kracht-verplaatsing curves ruimtelijk weergegeven als stijfheid kaarten (elastographs), waar de kleur schalen met afschuifmodulus. Elastographs tonen opvallende verschillen in het bereik en distribueren van weefsels schuifmodulus in de normale (Fig. 4A) en fibrotische (Fig. 4B) longparenchym, en de grote ruimtelijke variatie in afschuifmodulus, met name binnen de fibrotische long monster.
Figuur 2. (A) Fase contrast microscoop toont een AFM sonde over een muis longparenchym strip. Schaalbalk, 50 urn. (B) Immunokleuring van laminine in normale muis longweefsel met de alveolaire microarchitectuur van normale longparenchym. Witte doos toont typische 80-by-80μm elasticiteit mapping gebied. Schaalbalk: 20 urn. (C en D) Immunokleuring van collageen I in zoutoplossing (C) en bleomycine (D) behandeld muis longparenchym. Schaal van bars, 100 urn.
Figuur 3. (A) Representatieve interpreteerbaar kracht-verplaatsing curves verzameld uit zout (blauw) en bleomycine behandelde (rood) muis longparenchym, respectievelijk. Zwarte lijnen zijn de beste fit als gevolg van de sferische Hertz model en zijn voorzien van de bijbehorende berekende Young's moduli. (B, C) vertegenwoordiger van de VN-interpretabel kracht-verplaatsing curves.
Figuur 4. Vertegenwoordiger elastographs verzameld uit zout (A) en bleomycine behandelde (B) muis longparenchym. De kleur balken geven afschuifmodulus in kilopascal. Aslabels geven aan ruimtelijke schaal in micrometers. Schaalbalk: 20 urn
Discussion
Mechanische karakterisatie van longweefsel met AFM microindentation biedt ongekende ruimtelijke resolutie (afb. 4), biedt een uniek perspectief op microschaal variaties in weefsel stijfheid. Als voorbeeld van het nut ervan, vorige macro-schaal metingen in normale en fibrotische longweefsel strips aangegeven een ongeveer 2-3-voudige toename in elastance met fibrose 11,12. In tegenstelling, AFM microindentation blijkt dat weefsel verstijving is zeer plaatselijk, met een aantal regio's vertonen tot ~ 30-voudige toename van de shear modulus boven de mediaan bij normale, longweefsel 10. Als matrix stijfheid is nu bekend om kritisch te beïnvloeden celfunctie, deze lokale metingen geven van onschatbare waarde parameters om de biofidelity van celkweek onderzoek van longcellen te verbeteren.
Een aantal praktische problemen ontstaan bij het gebruik van dunne stroken van longweefsel. De oppervlakken van de strips zijn niet volledig vlak, zoals het weefsel profiel volgt de architectuur van de onderliggende longblaasjes. De AFM-systeem past zich automatisch tip positie in de Z-richting tijdens inspringen wanneer het monster oppervlak hoogte van variatie is kleiner dan 15 micrometer, om te helpen deze uitdaging te overwinnen. Metingen zijn verricht bij kamertemperatuur, niet 37 ° C, zodat afwijkingen in de mechanische eigenschappen als gevolg van deze variatie in temperatuur kan niet worden geëvalueerd, hoewel ze zouden naar verwachting gering zijn. De invloed van de onderliggende alveolaire wand architectuur op waargenomen mechanische eigenschappen is moeilijk vast te stellen met de huidige lichtmicroscopie setup. Zo zou het wenselijk zijn om te bepalen of alveolaire wanden vertonen anisotropie en de verschillende mechanische eigenschappen als ingesprongen in richtingen uitgelijnd met of dwars op het vlak van de muur. Echter, de huidige exemplaren zijn dik en het imaging systeem geen 3D-mogelijkheden, dus is het niet mogelijk om de lokale alveolaire wand oriëntatie te bepalen op elk punt van contact. Ten slotte is de invloed van de cellulaire bestanddelen op de gemeten mechanische eigenschappen nog volledig opgehelderd worden. In de methodes hier worden beschreven, worden er geen inspanningen geleverd om specifiek te verwijderen cellulaire bestanddelen van het weefsel. Echter, de cellen die aanwezig zijn op het oppervlak beschikbaar is voor inspringen waarschijnlijk niet levensvatbaar te zijn gezien de tijd die is verstreken sinds weefsel oogst en de noodzaak van het snijden van het weefsel om de toegang tot de longblaasjes te krijgen. Specifieke experimenten om cellen te verwijderen, of herbevolken matrices met levensvatbare cellen, en evalueren van de daaruit voortvloeiende veranderingen in het weefsel stijfheid lijkt gerechtvaardigd.
Omdat de verse losgemaakte weefsel is nodig voor deze metingen, moet de tijd die verstreken is van weefsel oogst de meting worden geminimaliseerd en de monsters moeten worden bewaard bij 4 ° C op veranderingen in de mechanische eigenschappen te voorkomen. Bijzondere aandacht moet worden besteed wanneer weefsel strips worden overgedragen tussen de containers tijdens het wassen of vlekken, zodat minimale vervorming of beschadiging wordt gegenereerd. Voor de AFM toepassing in vloeistof, een cruciale stap is om het weefsel zo plat mogelijk knippen en het monster immobiliseren op de ondersteunende dekglaasje aan. Indien beschikbaar, kan een geautomatiseerd snijden machine, zoals een vibratome of weefsel snijmachine worden gebruikt voor het plakken van zeer uniforme dikte te snijden. Het is belangrijk om onmiddellijk bevestigen weefsel strips voor AFM-metingen en de verstreken tijd voor het AFM-metingen als het monster uiteindelijk los van de dekglaasjes te minimaliseren. Een nuttige observatie is dat grotere strips lijken te hechten meer stabiel te laten enten te dekken en op zijn plaats te blijven voor een langere looptijd in PBS dan kleinere strips.
AFM microindentation kunnen karakteriseren monsters verspreid over een breed scala van 100 Pa tot 50 kPa (shear modulus) bij gebruik van een standaard 0,06 N / m cantilever met een diameter van 5 micrometer bolvormig tip. Dit bereik kan worden uitgebreid met behulp van sondes met verschillende veerconstanten; AFM probes met sferische glazen tips van 0,6 tot 12 micrometer in diameter en de lente constanten, variërend 0,01 tot 0,58 N / m zijn commercieel verkrijgbaar (bijv. Novascan) en veelgebruikte 3. Met een 5 micrometer bolvormig tip, de theoretische contactoppervlak tussen de tip en weefsel is ongeveer 5-9 um 2 voor 400-700 nm inspringen (Fig. 1A). Kleinere of grotere tips kunnen worden gebruikt om kleinere of grotere schaal van de ruimtelijke resolutie te bieden. Piramidale tips zijn ook gebruikt bij AFM microindentation 13-16, het verstrekken van kleinere contact gebieden en waardoor ruimtelijke resolutie in kaart te brengen, hoewel data fitting is ingewikkelder voor deze tip geometrie.
Een aantal beperkingen van deze methode dient te worden opgemerkt. De long is van oudsher mechanisch niet-invasieve manier gekarakteriseerd, bijvoorbeeld met behulp van druk-volume-analyse 17 of punch-inspringing van de hele longen 19,20. Invasieve methoden, zoals hier beschreven veranderen de longen architectuur in belangrijke manieren door het verlies van de lucht-vloeistof interface die normaal bestaat in de met lucht gevulde longen en het verlies van pre-stress die long gedeeltelijke inflatie houdt op ontspanning van de ademhalingsspieren. Deze beperkingen gelden voor alle metingen die in het longweefsel strips 18. Opvallend is echter de mediaan stijfheid gemeten in de parenchym van normaal longweefsel (afschuifmodulus ~ 0.5kPa) niet wezenlijk verschilt van de schattingen op basis van punch-inspringing van intacte longen bij rust volumes 19,20. Terwijl longweefsel is bekend dat niet-lineaire verstijving vertonen bij toenemende vervorming, is het niet mogelijk om te testen in een rigoureuze wijze de vraag of deze eigenschap naar beneden blijft tot de micro-schaal met de methoden hier werkzaam. De Hertz model gaat uit van homogeniteit van het monster. Echter, de meeste biologische materialen, waaronder longparenchym, worden in toenemende mate heterogeen op het verminderen van ruimtelijke schaal. Heterogeniteit van het monster kan leiden tot artefacten, zoals variatie van de Young's modulus afhankelijk van de diepte inspringen, dat wil zeggen, afhankelijk van de laag of onderdeel dat is vervorming. De heterogeniteit in het xy-vlak kan worden beperkt door het zorgvuldig kiezen van de juiste sferische tip grootte, afhankelijk van de microstructuur van het biomateriaal zoals voorgesteld door Dimitriadis EK et al.. 8 Het is veel moeilijker te voorspellen of te corrigeren van de Hertz model fout te wijten aan materiaal heterogeniteit in de z-richting. Azeloglu et al.. heeft onlangs voorgesteld een hybride computationeel model om de elastische eigenschappen van heterogene ondergrond te karakteriseren met discrete embedded insluitsels 21. Hun nieuwe techniek biedt een potentieel middel om te berekenen opnemen eigenschappen van heterogene materialen het overwinnen van de beperkingen van de Hertz-analyse.
De Hertz model gaat ook absoluut elastisch gedrag, terwijl de biologische materialen meestal weer tijd-afhankelijke visco-elastische gedrag. Een volledige karakterisering van de visco-elastische weefsel kan worden verkregen door het variëren van de gebruikte inspringen snelheden. Belangrijk is dat de vorige macro-schaal mechanische testen van een normale en fibrotische longweefsel toont zwakke frequentie afhankelijkheid van longweefsel mechanische eigenschappen, en het behoud van de verschillen tussen normale en fibrotische weefsel mechanische eigenschappen in alle frequenties testen 11. Deze bevindingen suggereren sterk dat het meten van de mechanische eigenschappen met een enkele inkeping snelheid met AFM een essentieel aspect van de veranderingen in weefsel mechanische eigenschappen die fibrose begeleiden vastlegt.
De Poisson-ratio van 0,4 voor het longweefsel wordt gebruikt in dit werk is van een macroscopische meting 9. Helaas, de Poisson-ratio op micro-schaal en eventuele wijzigingen onder ziektebeeld zijn niet beschikbaar in de literatuur. Als alternatief voor E, E / (1-υ 2) of (1-υ 2) / πE (aangegeven met de elastische constante k) 22 kan worden berekend op basis van AFM microindentation en gerapporteerd wanneer de Poisson-ratio is niet bekend. Voor de meeste biomaterialen Poisson-ratio is in het bereik van 0,4 tot 0,5 vanwege hun hoge gehalte aan water. Binnen het bereik 0,3-0,5, de factor 1 / (1-υ 2) varieert slechts 1.10 tot 1,33, zodanig dat een redelijke variaties in de verhouding van de Poisson oefenen slechts een bescheiden effect op de gerapporteerde modulus. De toename van de shear modulus dat we verslag van fibrotisch weefsel ten opzichte van normaal weefsel is verscheidene malen in grootte, wat inhoudt dat er fouten in verband met variaties in de verhouding Poisson's zijn beperkt ten opzichte van de veranderingen in mechanische eigenschappen waargenomen.
De werkelijke algoritme en de code die kan worden gebruikt voor de analyse van kracht-verplaatsing van gegevens is onderworpen aan de specifieke toepassing conditie en de daarop volgende kenmerken van de verschillende populaties van kracht-verplaatsing curves. Als er meer verfijnde analyse is van belang, kan een raadplegen van het werk van Lin et al.. 23. De auteurs stelde een aantal synergetische strategieën in een algoritme dat veel van de complicaties die eerder hebben verhinderd inspanningen om de montage van Hertz modellen van inspringing gegevens te automatiseren overwint.
Verscheidene andere gebieden zijn beschikbaar voor de verdere ontwikkeling en exploitatie van deze methode. In de gevallen waarin men geïnteresseerd in het visualiseren van de alveolaire wanden, zonder antilichaam labeling, kan zowel elastine en collageen worden gevisualiseerd uit hun autofluorescente signaal in het groene spectrum. Aan de andere kant, beter kunnen imaging, met behulp van dunnere weefselcoupes, 3D-imaging technieken, of beide, verbeteren van de mogelijkheid om weefsel architectuur correleren met de onderliggende mechanische eigenschappen. Terwijl de huidige methoden is het mogelijk kleuring en visualisatie van extracellulaire matrix componenten, zoals collageen en laminine, kunnen extra inspanningen worden gericht op vlekken celoppervlaktemerkers om specifieke celpopulaties te identificeren en om de mechanische micromilieus karakteriseren in de nabijheid van dergelijke populaties. Alternatively, kan weefsel worden verzameld van muizen die fluorescent-gelabelde lijn markers of cel-specifieke eiwitten aan hetzelfde doel na te streven. Ten slotte is de methode gedetailleerde hier lijkt goed geschikt voor het karakteriseren van andere anatomische kenmerken in de longen, zoals schepen die verbouwen bij hypertensie, en luchtwegen die verbouwen bij astma. Op basis van de huidige stand van de ontwikkeling en het potentieel voor verdere verbetering, AFM microindentation lijkt klaar om waardevolle inzichten opleveren in de veranderingen in het weefsel stijfheid die progressie van de ziekte in de longen te begeleiden, en zullen niet van waarde zijn twijfel in het karakteriseren van ruimtelijke en temporele veranderingen in de stijfheid van een verscheidenheid van andere zachte weefsels.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken A. en B. Tager Shea voor hun lopende samenwerking en het verstrekken van het longweefsel wordt gebruikt voor demonstratiedoeleinden hier. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health subsidie HL-092961. Dit werk werd uitgevoerd in een deel bij het Centrum voor Nanoscale Systems (CNS), een lid van het National Nanotechnology Infrastructure Network, die door de National Science Foundation ondersteund onder NSF award ECS-0335765. CNS is een onderdeel van de Faculteit der Kunsten en Wetenschappen aan de Harvard University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM tip | Novascan Technologies, Inc. | PT.GS | 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m |
| Poly-L-Lysine coverslips | VWR international | 354085 | BD BioCoat 12 mm round No.1 glass |
| Agarose, Low Gelling Temperature | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody | Abcam | ab34710-100 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A11010 | |
| Rabbit anti-Laminin | Sigma-Aldrich | L9393 |
References
- Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am J Physiol Cell Physiol. 279, C1345-C1350 (2000).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Klein, E. A. Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening. Curr. Biol. 19, 1511-1518 (2009).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. Airway contractility and smooth muscle Ca(2+) signaling in lung slices from different mouse strains. J Appl Physiol. 95, 1325-1332 (2003).
- Thundat, T., Warmack, R. J., Chen, G. Y., Allison, D. P. Thermal and ambient-induced deflections of scanning force microscope cantilevers. Appl Phys Lett. 64, 2894-2896 (1994).
- Mahaffy, R. E., Shih, C. K., MacKintosh, F. C., Kas, J. Scanning probe-based frequency-dependent microrheology of polymer gels and biological cells. Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophys. J. 82, 2798-2810 (2002).
- Butler, J. P., Nakamura, M., Sasaki, H., Sasaki, T., Takishima, T. Poissons' ratio of lung parenchyma and parenchymal interaction with bronchi. Jap. J. Physiol. 36, 91-106 (1986).
- Liu, F. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. J Cell Biol. 190, 693-706 (2010).
- Ebihara, T., Venkatesan, N., Tanaka, R., Ludwig, M. S. Changes in extracellular matrix and tissue viscoelasticity in bleomycin-induced lung fibrosis. Temporal aspects. Am J Respir Crit Care Med. 162, 1569-1576 (2000).
- Dolhnikoff, M., Mauad, T., Ludwig, M. S. Extracellular matrix and oscillatory mechanics of rat lung parenchyma in bleomycin-induced fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 160, 1750-1757 (1999).
- Rehfeldt, F., Engler, A. J., Eckhardt, A., Ahmed, F., Discher, D. E. Cell responses to the mechanochemical microenvironment--implications for regenerative medicine and drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 59, 1329-1339 (2007).
- Berry, M. F. Mesenchymal stem cell injection after myocardial infarction improves myocardial compliance. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, 2196-2203 (2006).
- Azeloglu, E. U., Bhattacharya, J., Costa, K. D. Atomic force microscope elastography reveals phenotypic differences in alveolar cell stiffness. J Appl Physiol. 105, 652-661 (2008).
- Wagh, A. A. Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 54-60 (2008).
- Martinez, F. J., Flaherty, K. Pulmonary function testing in idiopathic interstitial pneumonias. Proc Am Thorac Soc. 3, 315-321 (2006).
- Cavalcante, F. S. Mechanical interactions between collagen and proteoglycans: implications for the stability of lung tissue. J Appl Physiol. 98, 672-679 (2005).
- Hajji, M. A., Wilson, T. A., Lai-Fook, S. J. Improved measurements of shear modulus and pleural membrane tension of the lung. J Appl Physiol. 47, 175-181 (1979).
- Lai-Fook, S. J., Wilson, T. A., Hyatt, R. E., Rodarte, J. R. Elastic constants of inflated lobes of dog lungs. J Appl Physiol. 40, 508-513 (1976).
- Azeloglu, E. U., Kaushik, G., Costa, K. D. Developing a hybrid computational model of AFM indentation for analysis of mechanically heterogeneous samples. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 4273-4276 (2009).
- A-Hassan, E. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophys J. 74, 1564-1578 (1998).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. J. Biomech. Eng. 129, 430-440 (2007).
