Summary
Здесь мы описываем эффективные высокой пропускной способности
Protocol
1. Синтез дигоксигенин-11-UTP-Маркированный Riboprobe от ПЦР, созданных с использованием шаблона
- Для синтеза генов конкретного riboprobe, используйте Entrez Джин (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez), чтобы получить ген кДНК ссылка (RefSeq). Используйте Primer3 программы (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 проектировать ген-специфической ПЦР праймеры против 3'-области кДНК последовательности. Рекомендуемые параметры для выбора праймеров ПЦР описаны в другом месте (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html).
- Используйте MegaBLAST программы (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090) 6 оценить специфику выбранной последовательности ДНК. Последовательность ДНК считается конкретное, когда, используя ОЖИДАТЬ порог 0,01, она не совпадает с другой последовательности в базе данных RefSeq.
- ПЦР усиливают riboprobe шаблона. ПЦР-реакции компонентов и термоциклирования условия должны быть оптимизированы для каждого праймера множество. Типичный 50 мкл реакции содержит: 1X буфере, 2 мМ MgCl 2, 0,2 мм дНТФ, 1X Q решение, 1 мкг кДНК, 2.5U ДНК-полимеразы Taq, 0.25μm грунтовки, и нуклеазы без H 2 O. Типичный протокол термоциклирования включает в себя начальный денатурации при 94 ° С в течение 2 мин затем 40 циклов 94 ° С в течение 30 сек, 57 ° С в течение 30 сек, 72 ° С в течение 1 мин и окончательного расширения при 72 ° С в течение 10 минут. КДНК использовали в реакции ПЦР синтезируется из мыши мочеполовой мРНК.
- Отдельный продукт ПЦР методом электрофореза в агарозном геле, очищают с помощью набора Гель Добыча, и количественно очищенные продукты спектрофотометрии. Ожидаемая доходность составляет 1,2 - 3.6μg.
- Расшифруйте ПЦР продукта в меченых riboprobe. Транскрипции реакции (40 мкл) содержит: 400ng очищенный продукт ПЦР, 1X нуклеотидные смеси маркировки содержащих дигоксигенин 11-UTP, 1X транскрипции буфера, 5U РНКазы ингибитора 80У Т7 РНК-полимеразы, и нуклеазы без H 2 O. Инкубируйте 3-4 ч при 37 ° С и агитировать образцы каждые 30 минут.
- Используйте Qiagen RNEASY Мини набор для очистки riboprobes на основе инструкции по очистке РНК с по-колонки пищеварения ДНКазы. Riboprobes количественно спектрофотометрически. Ожидаемая доходность 4-20 мкг. Оценка качества зонд, разделяя аликвоты с помощью электрофореза на 1,5%, без денатурирующих агарозном геле. Высокое качество зондов мигрируют в качестве отдельных полос с минимальными смазыванию.
- Для обеспечения riboprobe в частности, признается своей цели, включают положительную ткани управления для первых ISH эксперимента. Целевой мРНК riboprobe это изображение должно быть известно в этом позитивном ткани контроля.
2. Подготовка вибрационный Клинок Микротом (на основе ранее описанного протокола) 7
- Подготовка 4% легкоплавкой агарозы решение в фосфатным буферным раствором (PBS). Микроволновая решение о роспуске агарозы и поддерживать решения на 62 ° C.
- Подготовка форм полистирола кольца путем удаления мембраны из пластин диаметром 12 мм культуры Millicell также вставки и сохранить полистирола кольцо для использования в качестве формы агарозы. Замочите кольца на ночь в раствор ингибитора РНКазы перед каждым использованием.
- Чтобы обеспечить гладкую поверхность резки, удаления ржавчины ингибитора и другие добавки с поверхности лезвия Wilkinson промыванием следующих растворителей, при 100%-ной концентрации: петролейный эфир, ксилола, хлороформа, метанола и MilliQ воды. Отдельные двойным лезвием вдоль на две отдельные лопасти.
- Придерживайтесь Уилкинсон лезвия микротома лезвие с Loctite клей. Микротома лезвие не используется для резки; он добавляет жесткость лезвия Wilkinson. Микротома лезвия должны быть сокращены к длине лезвия Wilkinson с использованием металлических ножниц и, как только придерживался, должны быть компенсированы 3 - 4 мм от передний край лопасти Уилкинсон.
3. Вскрытие, хранение и подготовка Урогенитальные Ткани для Секционирование
- Подготовка PBSTw раствор (PBS, содержащего 0,1% Твин ™ 20 и 0,2 мм азид натрия, фильтруют через 0.22μm Stericup ® фильтр). Решение может быть подготовлен заранее и хранить при температуре 25 ° C.
- Инкубируйте недавно расчлененный мыши LUT (мочевой пузырь, мочеиспускательный канал тазовых и связанные с ними Вольфианская и Mϋllerian протока-производных структур) в течение ночи при температуре 4 ° С в PBS, содержащий 4% параформальдегида фиксатором.
- Дегидрировать тканей промывкой в течение 10 минут при 25 ° С в серии градуированных метанол / PBSTw (1:3, 1:1, 3:1 об / об) решений. Магазин образцы при -20 ° С на 100% метанола по крайней мере за одну ночь. Архив ткани могут быть по крайней мере 2yr.
- Подготовка тканей для секционирования по станавливающим архив тканей. Промыть в течение 10 минут при 25 ° С в серии градуированных метанол / PBSTw (3:1, 1:1, 1:3 об / об) решений.
- Препарировать и отказаться примерно две трети из мочевого пузыря, в результате чего большинство из треугольника части и крепятся к уретре.
- Место плесень полистирола кольца, плоские поверхности вниз на 25 ° C ясно микроскопический слайд стекла.
- Заполните форму кольца с 62 ° C агарозном решения и остыть в течение 2 мин.
- Удалить LUT ткани PBSTw и насухо промокните на абсорбирующей салфеткой.
- Передача ткани в раствор агарозы.
- Используйте пинцет, чтобы ориентировать LUT ткани в агарозном так, чтобы она подвешена на полпути между верхней и нижней частях кольца плесени и инкубировать ткани при температуре 4 ° С до агарозном укрепил.
- Если ткань раковины полностью в процессе затвердевания агарозы, он может быть исключен из агарозы и повторно внедрены. Отрегулируйте время охлаждения агарозы по мере необходимости во время повторного вложения процесса.
5. Секционирование Урогенитальные ткани с вибрационный Микротом (на основе ранее описанного протокола) 7
- Горы усиленные лезвия Wilkinson в вибрирующих микротома и установить лезвие угол до 35 °. Заполните ванну люкс образца с PBS и упаковать мокрого льда вокруг образца ванну.
- Удаление затвердевшей агарозы вилку из кольца плесень и пятна с поверхности дна абсорбирующие салфетки. Убедитесь, что ткань ориентирована правильно. Ткани ориентации могут быть скорректированы с помощью лезвия бритвы, чтобы скос плоского края плагин агарозы.
- Придерживайтесь плагин агарозы на вибрирующих микротома образца установки диска с Loctite клей, как показано на рис. 1А.
- Вставьте образец установки диска в vibratome.
- Отрегулируйте микротома толщиной 50 мкм раздел, скорость до 2, а амплитуда лезвия до 4 и начните вырезать срезах тканей.
- Используйте тупой пинцет для передачи каждой ткани сечения (рис. 1В) до 24-и культуре пластины хорошо, что содержит ледяной 0,5 мл PBSTw.
- Для подготовки образцов для гибридизации на месте, акцизов большинство из агарозы вокруг каждого срез ткани (остальные агарозном будет таять во время процедуры ISH) и удалить все связанные с мусором. Магазин сечением до 48 ч при 4 ° С в PBSTw.
6. Пример корзины Подготовка к В гибридизация
- Отрежьте нижнюю часть микроцентрифужных трубки на 100 мкл марки.
- Тепло сократить край трубки в пламени, пока пластик размягчается, а затем нажмите микроцентрифужных трубки твердо на центр 0,5 дюйма квадратными ячейками полиэстера.
- Обрезать избыток сеткой и использовать подогревом 18 иглу, чтобы проколоть два отверстия в каждую пробирку крышкой для завершения подготовки корзине (рис. 1в).
- Снимите крышку 24 лунками и сверлить отверстия 12 мм с центром над каждую лунку. Используйте крышку для передачи образцов корзины между моет протокола ISH (рис. 1D).
7. Эмбрион Порошок Подготовка к В гибридизация (на основе ранее описанного протокола) 8
- Сбор ткани эмбриона мыши от мышей, которые являются одной сцене как срезах тканей, которые оцениваются и хранить при температуре -80 ° C. Место замороженной ткани в керамический строительный раствор, погрузите ткани в жидком азоте, а также использовать пестик для измельчения ткани в мелкий порошок.
- Комбинат эмбриона порошок с 4-х томах ацетона и гомогенизации с несколькими ударами гомогенизатор Dounce.
- Передача гомогената на 15 мл стеклянный завинчивающейся флакон и извлекать на ночь при 4 ° C.
- Гранул эмбриона порошка путем центрифугирования при 5000rpm в течение 10 минут при 4 ° C. Удаляют содержащих липиды супернатант. Ресуспендируют ткани пеллет в 4vol свежего ацетона и экстракт для 2ч при температуре 4 ° C.
- Гранул эмбриона порошка путем центрифугирования при 5000rpm в течение 10 минут при 4 ° C. Удаляют супернатант.
- Воздух сухой осадок на # 2 Whatman фильтровальной бумаги. Давка гранул для получения мелкого порошка и хранить в плотно закрытых стеклянных флакона при 4 ° C. Приблизительную мощность составляет 50 мг порошка на 1 г сырого веса эмбриона.
8. Ситу В День Гибридизация 1
- Разогреть prehybridization решение (50% формамида, 5x SSC, 1% Блокировка реагента, 10μg/mL дрожжевой тРНК, гепарин 10μg/mL хранить при -20 ° C) до 60,5 ° C. Это решение может быть подготовлен заранее и хранить при температуре -20 ° C.
- Подготовка влажной камере гибридизации, заполнив небольшую пластиковый контейнер хранения с примерно 0,5 в водопроводной воде. Крышка контейнера и подогреть до 60,5 ° C.
- Добавить 2 мл PBSTw для скважин из 24-и культуру пластину. Место образец корзины в отверстия 24-а крышку пластины и секции передачи ткани в корзинах (до 10 секций в корзине были использованы).
- Инкубируйте срезов ткани в течение 30 минут при 25 ° С в 6% H 2 O 2. Этот и все последующие инкубации должно осуществляться с нежным агитации на орбитальный шейкер, если не указано иное. Все инкубацииг моет проводятся в 24-луночных планшетах и использование общего объема решение 2mL/well.
- Вымойте срезах тканей 4 х 5 мин при 25 ° С в PBSTw.
- Инкубируйте срезах тканей для 12 мин при 25 ° С в PBSTw содержащие 5μg/mL протеиназы К.
- Вымойте срезах тканей 1 х 5 мин при 25 ° С в PBSTw.
- После исправления срезах тканей для 20 минут при 25 ° С в PBS, содержащий 4% параформальдегида и 0,2% глутарового альдегида.
- Вымойте срезов ткани 2 х 5 мин при 25 ° С в PBSTw.
- Добавить 2mL/well из нагретого буфера prehybridization и инкубировать срезах тканей внутри влажной камере гибридизации, по крайней мере 1 час при 60,5 ° C.
- Добавить 0.65μg помечены riboprobe к prehybridization буфера в каждую лунку и инкубировать срезов ткани на ночь в увлажненной камере гибридизации на 60,5 ° C.
9. Ситу В День Гибридизация 2
- Подготовьте следующие решения для пост-гибридизации шаги моющие: Решение 1 (50% формамида, 5x SSC, 1% SDS), Решение 2 (10 мМ Трис-HCl рН 7,5, 0,5 М NaCl, 0,1% Твин ™ 20, 0,2 мм азид натрия , 0.22μm фильтруется), и решение 3 (2x SSC, 50% формамид). Эти решения могут быть подготовлены заранее. Решения 1 и 3 хранятся при температуре -20 ° С и Решение 2 хранится при температуре 25 ° C. Срок хранения решения составляет не менее 3 месяцев.
- Вымойте срезах тканей 3 х 30 минут на 60,5 ° С, подогретого Решение 1. Использование влажной камере во время мытья.
- Вымойте срезах тканей 1 X 10мин на 60,5 ° С, подогретого Решение 1/Solution 2 (1:1 об / об) решение. Использование влажной камере во время стирки.
- Вымойте срезах тканей 4 х 10 мин при 25 ° С, Решение 2.
- Инкубируйте тканей разделы для 15 мин при 37 ° С в растворе 2, содержащих 0.25μg/mL РНКазы.
- Вымойте срезах тканей 1 X 10 мин при 25 ° С с раствором 2 (без РНКазы).
- Вымойте срезах тканей 1 X 10 мин при 25 ° С с раствором 3, затем 2 X1hr моет на 60,5 ° С, Решение 3. Использование влажной камере при 60,5 ° C моет.
- Подготовьте следующие решения для иммуногистохимического выявления DIG-меченых riboprobes: ткани блокирующего буфера (туберкулез, 1X TBS, 10% овец сыворотки, 1% блокирующий реагент, 1% БСА, 0,1% Твин ™ 20, 0.22μm фильтруется), Антитела Разбавление Буфер (AD, 1xTBS, 5% овечьей сыворотки, 1% блокирующий реагент, 1% БСА, 0,1% Твин ™ 20, 0,2 мм азид натрия, 0,22 м ™ фильтруется) Антитела Поглощение буфера (AA, 1xTBS, 5% овечьей сыворотки, 1 % блокирующий реагент, 1% BSA, 6mg/mL порошок эмбриона) и TBSTw (1xTBS, 0,1% Твин ™ 20, 0,2 мм азид натрия, 0.22μm фильтруется). Эти решения могут быть подготовлены заранее. TBSTw хранится при температуре 25 ° C, то все другие решения, хранятся при температуре -20 ° C.
- Вымойте 3 х 10 мин при 25 ° С TBSTw.
- Инкубируйте срезах тканей крайней мере 2ч при 25 ° С в борьбе с туберкулезом буфера.
- Хотя тканей вынашиваются в ТБ буфера, добавить 1.1μL анти-DIG антител в буфере 200 мкл AA для каждой скважины. Инкубируйте А. А. буфера + антитела не менее 2ч при температуре 4 ° С, то центрифуге при 10 000 оборотов в минуту в течение 1 мин. Удалить супернатант А. А. буфера и добавить его в 2 мл AD буфера.
- Удалить срезов ткани от туберкулеза буфера и инкубировать их в течение ночи в увлажненной камере при температуре 4 ° С в AD буфер, содержащий антитела.
10. В Ситу День Гибридизация 3
- Подготовка цвета решение для разработки NTMT (100 мм Трис-HCL рН 9,5, 100 мМ NaCl, 50 мМ MgCl 2, 0,2 мм азид натрия, 0.22μm фильтруется). Это решение может быть подготовлен заранее и хранить при температуре 25 ° C. Непосредственно перед применением, добавьте 2 мМ левамизол и 0,1% Твин ™ 20.
- Удалить раствор антител (AD буфера + антитела) из скважин и хранить раствор при 4 ° C. Он может быть использован повторно до еще два раза.
- Вымойте тканей 8 х 10 мин при 25 ° С TBSTw содержащей 2 мМ левамизол.
- Тщательно передачи ткани от корзины чашке Петри содержащие TBSTw. Используйте пинцет, чтобы удалить видимые мусора. Передача тканей в чистые трубы микроцентрифужных.
- Вымойте тканей 1 X 10 мин при 25 ° С NTMT 1 мл.
- Удалить NTMT и добавить 1mL/tube смеси, содержащей 50% NTMT (содержащий 2 мМ левамизол) и 50% BM Purple, трубы в месте, защищенном от света окна и инкубировать при температуре 25 ° C. Цвет времени развития колеблется от нескольких часов до нескольких дней. Если цвет развивается медленно, 100% BM Фиолетовый могут быть использованы.
- Монитор развития и изменения цвета NTMT / BM Фиолетовый решение, если он накапливается осажденные кристаллы или если она подвергается изменению цвета с желтого до фиолетового. После полного развития цвета (4-250 часов), стирать ткани 2 х 5 мин при 25 ° С с 1mL/tube из NTMT содержащей 2 мМ левамизол.
- Инкубируйте тканей течение ночи при 4 ° С в 1mL/tube ФСБ, содержащий 4% параформальдегида пост-фиксатором.
- Для отбеливания тканей, тканей инкубировать в течение 30 минут при 25 ° С в 1mL/tube из PBSTw, содержащий 3% H 2 O 2
- Ткань разделы монтируются на стеклах, coverslipped, а полученную с использованием сложного микроскопа.
11. Представитель Результаты:
Пространственной ориентации LUT ткани в агарозном определяет плоскость срезах тканей. Для сагиттальной разделов, по крайней мере две трети пузырь вырезали, а оставшиеся LUT ткани вложен в агар, что уретры средней линии параллельно плоской поверхности плагин агарозы (рис. 1А). Незначительные изменения в тканях плоскости могут быть сделаны фаски плоских края плагин агарозы. Представитель сагиттальной участке от 17.5dpc мужской ткани LUT, которая ориентирована в этой плоскости показано на рисунке 1b.
Пример корзины защитить тонкие тканевые срезы от потери и от накопления пыли и твердых частиц во время многодневных ISH процедуры. Пример корзины готовятся плавления полиэфирной сетки, чтобы обрезанный конец трубки микроцентрифужную 1,5 мл (рис. 1в). Маленькое отверстие прокалывается в крышку каждого образца корзине облегчить решение поток в страну и из корзины. Пример корзины взвешены в ISH решения, помещая их в просверленные отверстия 12 мм в 24-луночный планшет крышкой (рис. 1D). Изменение крышки пластины поддержки корзины, когда они передаются между 24-луночных планшетах в течение раствора изменяется.
Задача сложная, ограничить неспецифические фоне окрашивание в течение длительного периода инкубации, необходимые для обнаружения низких мРНК изобилие. Добавлением 0,2 азид натрия в образце буферов и их последующей фильтрации через 0.22μm фильтры появились ограничить фоне окрашивания (рис. 2). Использование метода, описанного здесь, там, кажется, не видны различия в окраске фона, когда образцы инкубируют в цвете разработки решений для длительных периодов времени (рис. 3).
Рисунок 1. Подготовка мыши ниже мочеполовой (LUT) тракта срез ткани и микроцентрифужных трубки корзина для ISH. LUT содержащее часть мочевого пузыря, уретры и тазового связанные Вольфианская и Mϋllerian протока полученные структуры) вложена в цилиндрический разъем на 4% легкоплавкой агарозы. (А) вилка приклеены к образца установки диска и (Б) разрезать на 50 мкм секций с вибрирующим микротоме. (C) LUT разделе переносится в корзину микроцентрифужных трубка, которая готовит пирсинг отверстие в крышке трубы и сетка слияния полиэстера до конца вырезать нижнюю часть трубки. (D) микроцентрифужных трубка вставляется в 12 мм отверстия, просверленные в 24-луночный планшет крышкой, так что срезах тканей взвешены в буферный раствор в течение ISH протокола. Стрелки указывают LUT ткани в пробке агарозы.
Рисунок 2. Включение 0,2 азид натрия в 0.22μm фильтруется решения улучшает качество тканей и уменьшает фоновый окрашивания. 17.5dpc самца мыши нижних мочеполовых путей (LUT) были секционного в сагиттальной плоскости с толщиной 50 мкм. Ткань Срезы окрашивали по ISH с помощью зонда направлена против поворот гомолога 1. Буферов, используемых для ISH были либо (А) 0.22μm фильтруется и дополнена 0,2 азид натрия (NaAz) или (В) не фильтруются и не дополнены NaAz. Стрелки указывают на фоне пятен. Изображения были захвачены в то же увеличением. Результаты представитель окрашивания образцов для п = 3 помета независимые мышей.
Рисунок 3. Фон интенсивности окрашивания, кажется, не увеличивается с длительным развитием цвета. 17.5dpc самца мыши нижних мочеполовых путей (LUT) были секционного в сагиттальной плоскости с толщиной 50 мкм. Срезы окрашивали ISH путем инкубации их в растворе для окрашивания хромоген () 9.5h с помощью зонда, который признает высокую стенограмму изобилие эстрогена связанных гамма рецептор (Esrrg), (B) для 43.5h с помощью зонда, который признает среду изобилия Стенограмма bromodomain прилегающих к цинка домена пальцем, 2А (Baz2a), или (С) в течение 236h с помощью зонда, который признает низкой численности стенограмму бескрылые типа MMTV интеграции сайт семьи, член 10а (Wnt10a). Изображения были захвачены в то же увеличением. Результаты представитель окрашивания образцов для п = 3 помета независимые мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование метода, описанного здесь, можно обнаружить мРНК во всех основных типов клеток и тканей отсеков плода мужского и женского мыши ТМП в том числе мезенхимальных колодки, уротелия, гладких мышц, предстательной железы почки, семяизвергательного канала и влагалища. 50 мкм разделы, используемые в настоящем протоколе имеют то преимущество, что достаточно толстой, чтобы решать ткани архитектуры (таких как кровеносные сосуды), но достаточно тонкие, чтобы избежать захвата зонда, который является методологическая проблема часто встречается в течение всего монтажа ISH. Каждый новый riboprobe оценивается на положительные ткани управления, где окрашивание был оценен в ранее опубликованные исследования. Мы гарантируем, что окрашивание модели являются специфическими в этих тканях. Еще одно преимущество нашего метода является то, что модели несколько мРНК может быть оценен в смежных разделах ткани из той же ткани LUT. Кроме того, этот метод может использоваться в сочетании с иммуногистохимических методов визуализации ячейки специфических маркеров белков и определить типы клеток окрашивали ISH протокола. Этот метод несовместим с традиционными методами counterstaining, таких, как ядерная counterstaining с быстрой Красный или гематоксилином. Тем не менее, мы успешно контрастно образцов с люминесцентными ядерной пятен, в том числе 4 ',6-diamidino-2-фенилиндола (DAPI) и пропидий йодида.
Метод, описанный здесь, включает в себя несколько улучшений по сравнению с тот, который был описан ранее 7. Почти все из буферов и растворов реагентов складе в текущем рукописи готовятся заранее и могут храниться в течение длительных периодов времени, что повышает эффективность работы. Добавлением азида натрия 0,2 мм для большинства реагентов и их фильтрации через 0.22μm мембран значительно снижает неспецифическую фоне окрашивания, увеличивает реагента срок годности, и сводит к минимуму накопление твердых частиц на срезах тканей во время ISH процедуры. Эта рукопись также описывает производства проницаемой микроцентрифужных трубки корзин, которые содержат срезах тканей во время ISH и изменение нескольких хорошо культуры пластину, которая держит крышку корзины в буфер изменения. Мы обнаружили, что эти устройства, которые легко производится в лаборатории, уменьшить потери образца, свести к минимуму повреждения тканей раздел в процессе обработки, а также повысить эффективность работы. Кроме того, использование закрывающемся пластиковом контейнере камере влажности помогает защитить от испарения. Это особенно важно для срезов ткани в периферических скважин образца, где так называемый "эффект края" можно ввести экспериментальной переменной. При использовании влажности камеры, мы не наблюдали заметного окрашивания качественных различий в периферийных по сравнению с внутренним скважин образца.
Хотя этот протокол является эффективным механизмом для изучения моделей экспрессии в тканях мышей LUT, Есть некоторые ограничения, с этим методом. Эффективность обнаружения мРНК варьируется в зависимости от riboprobes и абсолютное изобилие мРНК не может быть определена. Другим ограничением является то, что окрашивание модели может варьироваться в зависимости от плоскости сечения. Чтобы свести к минимуму эти ограничения, мы оцениваем каждый мРНК картина в несколько разделов из нескольких помет-независимого плодов.
Этот метод может быть оптимизирован для визуализации моделей экспрессии мРНК в других типах тканей мыши или других видов. Такое изменение необходимо, чтобы амплитуда микротома лезвие и скорость быть оптимизированы в ткани срезов и что концентрации протеиназы К быть оптимизированы в ISH процедуры. Кроме того, необходимо предварительно поглощать анти-дигоксигенин антитела с эмбрионом порошок от одного вида ткани, которая в настоящее время оценивается на ISH. Хотя этот метод не используется для срезов ткани тоньше, чем 40 мкм, так как разделы распадаются в течение ISH окрашивания, он может быть адаптирован для использования в высокопроизводительных целом монтажа ISH окрашивания. Мы использовали этот метод для проведения целого монтажа ISH плода и новорожденных мышей простаты, а также плода гонад и почек. Для целого монтажа окрашивания ISH, необходимо оптимизировать протеиназы К ткани пищеварения, а также количество и продолжительность моет следующие ночной инкубации антитела к снижению фонового окрашивания, вызванного захватом зонд.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Lan Йи, Института рака в Нью-Джерси, для оказания технической помощи в подготовке ткани корзины. Эта работа финансировалась Национальным институтом здоровья и гранты DK083425 DK070219.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Group | 11214667001 | |
| Blocking reagent | Roche Group | 11096176001 | |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Group | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 | |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Group | 1277073910 | |
| dNTPs | Roche Group | 11969064001 | |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model | |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F5786-1L | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma-Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 | |
| Levamisole | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp | 46551 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375-500G | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 | |
| Millicell culture plate insert | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR | |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 | |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 | |
| Polyester mesh, 33 micron, 12" x 24" | Small Parts, Inc. | CMY-0033-D | |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML | |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 | |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase | |
| RNase | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| RNase inhibitor | Roche Group | 03335399001 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega Corp. | M6101 | |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza Inc. | 50101 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263-500mL | |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 | |
| SSC, 20X solution | Research Products International Corp. | S24022-4000.0 | |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | |
| T7 RNA polymerase | Roche Group | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A | |
| Yeast tRNA | Roche Group | 109495 |
References
- Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
- Rozen, S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).
- Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).
- Vezina, C. M. Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate. Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).
- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
