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Medicine

체외에서 시스템

Published: August 11, 2011 doi: 10.3791/2914
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biology, University of Haifa, 2Transgenic Oncogenesis and Genomics Section, Laboratory of Cancer Biology and Genetics, National Cancer Institute

Summary

체외 시스템에 수정 3 - D는 재구성 지하 막 여러 종양 세포 라인의 성장 특성 전이성 보조 사이트에서 종양 세포의 휴지 또는 proliferative 행위와 연관있는 제공됩니다

Abstract

유방암의 재발은 종종 암의 흔적이 없다는있는 긴 잠재 기간을 다음과 metastases는 기본 종양과 도움이되는 치료의 제거 후 수년 전까지는 임상적으로 명백한 될 수 없습니다. 이러한 현상의 가능성이 설명은 종양 세포가 전이성 사이트 씨앗 기존 치료에 저항하고, 시간이 1-4 오랜 기간 동안 휴면 남아있다는 것입니다.

보조 사이트에서 휴지 암세포의 존재는 둘 다 분아 따위에 의해 번식하지 않으며 apoptosis가 5-7 받아야 정지 독방 세포로 이전에 설명되었습니다. 또한, 이러한 고독한 세포는 질병의 진행의 80-10의 초기 단계에서 기본 종양에서 보급하고 환자의 골수, 혈액, 림프절 1,4,11에서 성장 체포 거주 보여왔다. 따라서, proliferative 상태로 휴면 또는 스위치를 조절 메커니즘을 이해하는 것은 질병 재발을 방지하기 위해 새로운 목표와 중재를 발견하기위한 중요합니다. 그러나, 전이성 종양 성장에 휴면에서 스위치를 조절 메커니즘을 분열하는 것은 가능한 모델 시스템의 부족에 의해 방해되었다.

생체내 및 종양 세포의 전이성 진행을 공부하기 전 생체내 모델 시스템에서 이전에 설명한 1,12-14되었습니다. 그러나 이러한 모델 시스템은 실시간 및 전이성 질환으로 세포 분열 따위에 의해 번식하는 고독한 휴면 종양 세포의 출현을 트리거 무엇으로 높은 처리량 방식의 기계론의 통찰력에서 제공하지 않았습니다. 우리는 최근 (D2A1, MDA - MB - 231, K7M2) 중 휴면 (D2.OR, MCF7, K7M2 - AS.46) 또는 proliferative 전이성 동작을 세포의 생체내 성장 특성 모델 체외 시스템에서 3D를 개발 생체내 인치 우리는 전이성 사이트에서 생체내의 휴면을 전시 종양 세포가 3 차원 (3D) 지하 막 추출물 (BME)에서 양식 때 생체내 높은 전이성 세포가 쉽게 변수 후 3D 문화 분아 따위에 의해 번식하는 반면, 정지 남아 있지만, 상대적으로 짧은 것을 보여주 정지의 기간. 중요한 시험 관내 모델 시스템에서 3D를 이용하여 우리는 ECM 성분이 휴면 종양 세포가 proliferative 상태로 전환되며, 생체내 연구 15-17에서에서 이것을 확인했는지 여부 조절에 중요한 역할을하는 처음으로 보여주었다. 따라서이 보고서에서 설명하는 모델 시스템 모델 종양의 휴면을 체외 방식의를 제공하고 microenvironment에 의해 유도된 proliferative 성장로의 전환을 공부합니다.

Protocol

1. 휴지 및 전이성 종양 세포 라인의 세포 배양 관리

  1. Dulbecco의 수정된 이글의 중간 (DMEM) 높은 포도당와 10 % 태아 소 혈청을 (포함 10cm 문화 접시에 휴지 (D2OR / MCF7/K7M2-AS.46) 및 전이성 종양 세포를 (D2A1 / MDA - MB - 231 / K7M2) 성장 FBS)과 항생제. 세포 70-80%의 합류에 도달하면, 다음과 같은 assays로 진행합니다.

2. 휴지 (정지)과 전이성 (proliferating) 종양 세포의 세포 증식 분석은 3D - BME 시스템에 교양

3D 시스템에 Culturing 휴지 / 전이성 세포

  1. 분석을 수행하기 전에 4 해동 Cultrex 성장 인자 - 감소 지하 막 추출 (BME)는 ° C 냉장고 밤. BME가 항상 얼음에 처리되어야합니다.
  2. 다음날, 판상 후드 안에 얼음 트레이에 96 잘 접시를 놓으십시오. 주사기와 디스펜서를 사용하여 얼음 차가운 BME 50 - 100μl와 코트 각각 잘. 더 거품이 우물에 형성되지 있는지 확인합니다. 30 분 37 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에 BME와 코팅 96 잘 판 ° C를 놓습니다.
  3. 그동안 동면 또는 전이성 종양 세포 (섹션 1에 준비)에서 미디어를 대기음. 10 ML 인산이 호수, PH 7.4 (PBS)를 버퍼로 문화 접시 린스. 문화 접시에 PBS 및 추가 2ml 트립신 37 미리 예열 ° C를 대기음. 37 humidified 5 % CO 2에서 번호판을 품어 ° C, 5 분.
  4. 10% FCS와 항생제로 보충 DMEM 높은 포도당의 5ml를 포함한 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송하고 세포를 계산합니다.
  5. 5 분 상온에서 1,500g의 속도로 조직 문화 원심 분리기에서 교양으로 전체 휴대폰 번호를 스핀 다운. 우리 assays 우리는 검사 각 세포주 또는 시점에 대해 / 잘 2X10 3 셀을 준비합니다. 그러나, 이것이 사용되는 세포 라인에 따라 다를 수 있습니다.
  6. 조심스럽게 뜨는을 대기음. 참고 대부분의 경우에 펠렛은 표시되지 않습니다. 따라서 일부 언론의 뒤에 둡니다. 단일 세포 현탁액을 얻은 것입니다 수 있도록 손가락으로 15ml 원뿔 튜브의 아래쪽을 누릅니다. 와 보충 항생제로 DMEM 낮은 포도당과 펠릿 다시 중단 2% FCS + 2 % BME (검정 미디어). 검정 미디어 100 μl마다 2x10 3 세포에 추가되어야합니다. 단일 세포 현탁액이 유지되도록 5ml 피펫으로 세포를 여러 번 씹다.
  7. 플레이트 세포 혼합물의 100μl 당 자 96 자 BME 코팅 접시의 위에. 배경 평가 (섹션 2.8)를 추가 100μl의 판 당 우물의 96 잘 BME 코팅 접시 위에서만 분석 미디어. 37 humidified 5% CO 2 배양기에서 교양 96 잘 번호판을 품어 ° C. 세포는 분석 매체와 4 일마다 다시 먹이해야합니다.

확산 분석 :

  1. 세포의 확산 분석 : 원하는 시간에 우물에 추가 셀 Titer 96 수성 하나의 솔루션 세포 증식 분석 키트 20 μl를 가리 킵니다. 2 시간을위한 37 ° C에서 humidified 5% CO 2 배양기에서 알을 품다. 490nm에서 엘리사 플레이트 리더 기록 흡광도를 사용하여. 배경 평가 및 뺄셈 들어, BME와 우물 프리 코팅에 셀 Titer 96 수성 하나의 솔루션 세포 증식 분석 키트의 20μl를 추가하고 유일한 분석 매체와 입혔다. 490 NM에서 엘리사 플레이트 리더 기록 흡광도를 사용하여.

3. 및 / 또는 전이성 (proliferating) 휴지 (정지) 종양 세포가 종양 세포에 세포 신호 분자에 대한 Immunofluorescent 얼룩

immunfluorescence 얼룩을 위해 3D 시스템에 Culturing 휴지 / 전이성 세포

* 다음과 같은 프로토콜은 Debnath J 외 18 발행 3D 문화 프로토콜의 수정입니다.

  1. 같은 섹션 2.1에 설명된 BME를 준비합니다. 다음날 : 판상 후드 안에 얼음 트레이에 장소 8 챔버 유리 슬라이드 시스템을. 200μl pipetman를 사용하여 얼음처럼 차가운 BME의 50ul와 코트 각각 잘. BME가 고르게 확산이며 거품이 우물에 형성되지 있는지 확인합니다. 20 분 37 humidified 5 % CO 2에서 BME와 코팅 8 챔버 유리 슬라이드 ° C를 놓습니다.
  2. 섹션 1과 섹션 2.3-2.4에서 설명한대로 문화에 준비에서 수확 동면 또는 전이성 세포. 15 ML 원뿔 관에 교양으로 세포의 총 수를 수집합니다. 우리는 검사 각 세포 라인과 시점에 대해 / 잘 오 X10 3 셀을 준비합니다. 5 분 상온에서 1,500g의 속도로 조직 문화 원심 분리기에있는 세포를 스핀 다운. 자세히 supernate를 대기음. 펠렛 볼하지 않습니다, 따라서 뒤에 어떤 미디어를 두십시오. 단일 세포 현탁액을 얻은 것을 보장하기 위해 손가락으로 15ml 원뿔 튜브의 아래쪽을 누릅니다.검정 미디어와 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 검정 미디어 400μl마다 5x10 3 세포에 추가되어야합니다. 5ml 피펫으로 세포를 여러 번 씹다. 이 단계는 단일 세포 현탁액이 유지되도록하는 것은 매우 중요합니다.
  3. BME와 코팅 8 실의 각 상단에 따라 잘 세포 혼합물의 플레이트 400μl. 37 humidified 5% CO 2 배양기에서 교양 8 실 유리 슬라이드 시스템을 품어 ° C. 세포는 분석 매체와 4 일마다 다시 먹이해야합니다.

Immunofluorescence 염색법 :

  1. 원하는 시간 지점에서, 대중 매체의 상위 레이어를 대기음 4 %의 Paraformaldehyde (PFA), 5 % 자당 및 0.1 % 트리톤 X - 100을 포함하고있는 정착액의 200μl를 추가하고 5 분 실온에서 알을 품다. 정착액을 대기음 25 분 상온에서 5 %의 자당과 부화를 포함한 4퍼센트 PFA의 200μl를 추가합니다.
  2. 정착액을 기음, 인산염의 추가 400 μl 각 잘하는 (PBS) 살린 버퍼. 실온에서 10 분 알을 품다. PBS를 대기음 400 μ PBS는 실온에서 10 분 트윈 20 0.05 %를 포함하는 추가합니다.
  3. 10% 당나귀 혈청 중의 200μl 또는 1시간 (사용할 수 있도록 솔루션을 각 기본 항체에 대해 경험적으로 결정되어야 차단)을 3 % BSA와 함께 실온에서 고정 세포를 차단합니다.
  4. 차단 솔루션을 기음과 주요 항체의 200μl을 (희석을 사용하여 각 기본 항체에 대해 경험적으로 결정한다)을 추가합니다. 10% 당나귀 혈청이 차단에 사용되는 경우 10 % 당나귀 혈청의 기본 항체를 희석하거나 3% BSA 차단 솔루션이 사용된 경우 3 % BSA의 기본 항체를 희석. 4 밤새 차 항체와 함께 품어 ° C.
  5. 항체를 대기음, 15 분 동안 PBS 400μl로 우물을 세척하고 두 번 반복합니다. PBS를 기음과 rhodamine 빨간색 (희석이 경험적으로 결정한다)에 안티 - 각 - IgG 복합 당나귀의 200μl를 추가, 실온에서 1 시간 동안 알루미늄 호일과 부화로 8 챔버 슬라이드 커버.
  6. 400μl PBS (각 씻어 3x15 분)와 우물을 씻으십시오. 대기음 PBS. VECTASHIELD는 DAPI와 매체 장착과 탑재. 어둠 속에서 실온에서 40 분 건조 슬라이드. 슬라이드 4 ° C. 1 주일 동안 보관 가능 어둠의 슬라이드를 저장합니다. 이미지 공촛점 현미경으로 슬라이드.

4. 대표 결과 :

3D 문화의 휴지 D2.0R 및 전이성 종양 D2A1 세포의 확산 분석 예제는 그림 1A에 표시됩니다. 높은 전이성 D2A1 세포는 그들이 세포 분열 따위에 의해 번식하기 시작 이후 4~6일 동안 수면 상태에 남아있는 반면 D2.0R 세포는 전체 실험 십사일 문화 시대를 통해 (정지) 휴면 수 있습니다. 다른 아닌 proliferating 세포가 여러 세포 spheroids을 형성하는 반면, 초기 잠복 단계 동안, 많은 전지 (일 4 그림 1B) 3 - D 문화의 독방 남아 있습니다. 3 - D의 문화에 proliferative 상태로 휴면에서 D2A1 세포의 전환 (그림 1B, 12 일) 셀 형태의 극적인 변화와 관련된 것입니다. 따라서,이 분석은 어떤 요소를 테스트하는 데 사용할 수있는 / S는 수면 상태에서 등장하는 휴면 D2.0R 세포를 실행할 수 있으며, 어떤 요소 것은 / s의 자신의 수면 상태에서 전환할 D2A1 세포를 방지할 수 있습니다. 그림 2는 에이전트의 예입니다 휴면에서 proliferative 상태로 전환하는 D2A1 세포를 방지. 그림 2에서 그림, 마이 오신 라이트 체인 키나제 (ML - 7)의 특정 억제제 D2A1 세포의 트리 트먼트는 휴면 상태에 D2A1 세포를 유지.

3D 시스템에 교양 동면 proliferating 종양 세포의 신호를 세포는 세포 신호 분자에 대한 immunofluorescence 얼룩으로 공부하실 수 있습니다. 그림 3에서 그림 굴지 스트레스 섬유 (녹색 얼룩)을 형성 F - 굴지의 필라멘트의 개편 다음 D2A1 셀 (빨간색 얼룩)에서 마이 오신 라이트 체인 인산화에 상당한 증가는 휴면으로부터 전환 (1-4 일) 동안 발생 확산 (일 7). 그러나, shRNA 또는 특정 약물 (ML - 7)에 의해 D2A1 세포의 마이 오신 라이트 체인 키나제의 활동을 차단하는 것은 D2A1 휴면 상태에있는 세포와 마이 오신 경쇄 인산화 및 F - 굴지 스트레스 섬유 조직 (그림 4)의 억제에 결과를 유지합니다.

그림 1
그림 1. 독방 종양 세포 휴면 및 전이성 성장에 스위치를 공부 체외 모델 인치 3 - D Cultrex BME의 휴면 D2.0R 및 전이성 D2A1의) 확산, N = 8 (± SE를 의미). 세 실험 (* P ≤ 0.05)의 대표적인 결과입니다. B) D2.0R 및 D2A1 세포의 라이트 현미경 이미지는 3 - D Cultrex BME의 배율 x20에서 교양.그림 Barkan 외 17 수정되었습니다.

그림 2
그림 2. 마이 오신 라이트 체인 키나제 (MLCK)의 억제에 의해 3D 문화 시스템의 확산에 휴지 (정지)에서 D2A1 세포의 스위치를 예방. 3 - D Cultrex BME, N의 교양 D2A1 세포 증식의 시간 코스 = 8 (± SE를 의미). 전지 (제어) 치료했다, 또는 MLCK의 특정 억제제 (ML - 7, 5 μm의)와 함께 치료를 문화의 날 5 48 시간부터 시작하십시오. 그림 Barkan 외 17 수정되었습니다.

그림 3
그림 3. 마이 오신 경쇄 인산화은 proliferative 성장 휴면에서 D2A1 세포의 스위치 중에 F - 굴지의 개편으로 따라갔다. D2A1 전지는 8 챔버 유리 슬라이드에 3 - D Cultrex BME에 교양되었습니다. 세포 고정과 핵 지방화를위한 DAPI (파란색), F - 굴지에 대한 phalloidin (녹색)과 같은 다양한 시간 지점에서 지적 마이 오신 라이트 체인 (MLC - P) (적색)의 phosphorylated 양식에 대한 항체 물들일되었습니다. F - 굴지 및 MLC - P의 얼룩 (노란색)의 병합. MLC - P 표현은 굴지 스트레스 섬유 형성 (화살표) 다음 proliferative 성장 (일 7) 휴면 (days1 - 4)에서 D2A1 세포의 이행 기간 동안 증가했다. 공촛점 현미경, 확대 x63. 화이트 막대는 20 미크론 같습니다. 그림 Barkan 외 17 수정되었습니다.

그림 4
그림 4. . 문화의 날 48 시간의 시작을 위해, 마이 오신 라이트 체인 키나제 (MLCK) D2A1 세포 중재 F - 굴지 스트레스 섬유 형성의 억제 D2A1 세포 (제어) 치료했다, 또는 MLCK (5 μm의 ML - 7)에 대한 억제제로 치료 5 또는 발진 또는 MLCK shRNA 취급 및 마이 오신 라이트 체인 (MLC - P) (적색), F - 굴지 (녹색), 그리고 핵 (파란색)의 phosphorylated 양식 스테인드. F - 굴지 및 MLC - P의 얼룩 (노란색)의 병합. 공촛점 현미경, 확대 x63. 화이트 막대는 20 미크론 같습니다.

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Discussion

전이성 성장하기 위해 전환에 휴면 상태 또는 결과 종양 세포를 전파 관리 기본 메커니즘은 크게 알려지지 않은 상태로 유지됩니다. 이러한 현상은 인간의 환자 4,12 그리고 몇 잠복기 모델이 문제를 해결하기 위해 개발되었습니다에서 공부하는 것은 매우 어려운되었습니다. 그럼에도 불구하고, 생체내 및 종양 휴면에 대한 전 생체내 모델 시스템의 일부 (1,12에서 검토) 특징되었습니다. 그러나, 종양이 휴면에 대한 생체내 모델은 주로 종양 휴면을 규제하는 잠재적인 메커니즘을 검증하기 위해 이용하지만, 실시간으로 하나의 전파 휴면 종양 세포의 생물학을 탐구 의무가 없습니다 수 있습니다.

3 - D 시스템이 처음으로 독방에 종양의 휴면과 체외 모델 시스템에서 전이성 성장을 스위치 여기 모델 제시. 모델링 종양의 휴면 (정지)와 3D 시스템의 확산로의 전환에 대한 확산 분석은 시간이 지남에 따라 수 있습니다. 이 분석은 높은 처리량 방법 및 요인 / 자신의 정지 단계에서 휴면 종양 세포를 유지하거나 세포 분열 따위에 의해 번식에 활성화 수도 유전자 가능성이 비교적 짧은 기간에 공부를 이용하실 수 있습니다. 또한 확산 분석은 휴면 표현형가있을 수 있습니다 추​​가로 종양 세포 라인에 대한 화면으로 높은 처리량 플랫폼으로 활용하실 수 있습니다.

전통적인 생화 학적 방법으로 3D 시스템의 전이성 성장에 종양이 휴면 또는 스위치를 제어하는​​ 분자 메커니즘을 공부하는 것은 (RT - PCR / 웨스턴 blots) 휴지에서 생화학 연구를위한 추출 수있는 RNA / 단백질의 낮은 금액을 주어 어렵습니다 종양 세포. 그러나, 같은 그림 3과 4에 표시되는 3D 모델 시스템에서 동면 outbreaking 종양 세포의 세포 신호 전달 분자의 immunofluorescence 얼룩이 적용될 수 있습니다. 따라서 여기에 제시된 모델 시스템은 독방에 종양 세포 휴면 및 전이성 성장로의 전환을 규제 분자 메커니즘을 탐구하기 시작하는 효과적인 도구로 검색할 수 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 연구는 국립 암 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM high glucose Invitrogen 11965-118
DMEM low glucose Invitrogen 11885-092
Fetal bovine serum (FBS) Invitrogen 10091-148
Growth factor-reduced 3-D Cultrex Basement Membrane Extract Trevigen Inc. Protein concentration between 14-15mg/ml
D2.0R and D2A1 cell lines 5,19
K7M2 and K7M2AS1.46 cells 20
MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells ATCC
An 8 chamber glass slide system Lab-Tek 177402
Cell Titer 96 AQueous One Solution cell proliferation assay kit Promega Corp. G3580
VECTASHIELD mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Elisa Plate Reader Bio-Tec Record 490nm
Confocal microscope Carl Zeiss, Inc. Magnification x63

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References

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