Summary
修改后的3 - D在体外培养系统是其中的几个重组基底膜的肿瘤细胞株的生长特性与休眠或增生的肿瘤细胞转移的辅助站点的行为相关
Abstract
乳腺癌复发往往遵循一个潜伏期长，其中有没有癌症的迹象，并转移可能不会成为多年后切除原发肿瘤的辅助治疗，直到临床明显。这种现象的一个可能的解释是，肿瘤细胞有种子的转移部位，耐常规疗法，并保持时间 1-4长时间处于休眠状态。
以前在辅助站点休眠癌细胞的存在已被描述为静态，既不增殖也不是孤立发生凋亡 5-7的细胞。此外，这些孤立的细胞已被证明传播从原发肿瘤的早期疾病进展8-10的阶段，并驻留在病人的骨髓，血液和淋巴结1,4,11中生长被捕。因此，了解的机制，规范增殖状态的休眠或交换机是发现新的目标和干预措施，以防止疾病的复发的关键。然而，揭开肿瘤休眠开关调节转移性增长的机制已经阻碍了缺乏可用的模型系统。
在体内和体外模型系统研究进展肿瘤细胞的转移已被描述以前 1,12-14 。然而，这些模型系统并没有提供实时和高通量的方式进入孤处于休眠状态的肿瘤细胞增殖转移性疾病的出现触发什么机械的见解。最近，我们在体外系统开发的一个三维模型 ， 在细胞体内生长的特点，表现出休眠（D2.OR MCF7，K7M2 - AS.46）或增生（D2A1，MDA - MB - 231，K7M2）转移性行为在体内 。我们证明了，表现在体内肿瘤细胞在转移部位的休眠保持静态时，在一个3维（3D）基底膜提取物（BME）培养，而高度在体内转移的细胞很容易在三维培养增殖后，变量，但相对较短时期的平静。重要的是利用体外模型系统中的三维，我们首次展示了ECM的成分，起着重要的调节是否处于休眠状态的肿瘤细胞会切换到增殖状态，并确认 在体内研究15-17作用。因此，本报告中所描述的模型系统提供了在体外培养的方法，以模型的肿瘤休眠研究的微环境诱导的增殖生长的过渡。
Protocol
1。休眠和转移性肿瘤细胞株的细胞文化维护
- 成长在10厘米的培养板包含贝科改良Eagle培养基（DMEM），高糖和10％胎牛血清休眠（D2OR / MCF7/K7M2-AS.46）和转移性肿瘤细胞（D2A1 / MDA - MB - 231 / K7M2）（ FB）和抗生素。一旦细胞达到70％至80％汇合，进行以下的检测。
2。培养细胞处于休眠状态（静态）和转移（扩散）的肿瘤细胞增殖实验在一个三维生物医学工程系统
在三维系统休眠/转移性细胞培养
- 解冻Cultrex生长因子，减少基底膜提取物（BME）的4 ° C冰箱进行检测前一个晚上。请注意在冰上处理的生物医学工程应在任何时候都。
- 翌日，地方上的一盘冰层流罩内的96孔板。大衣搭配使用饮水机用注射器冰冷的BME 50 -100μL每口井。确保无气泡形成在井。 96孔板中涂与生物医学工程与5％的CO 2在培养箱在37℃放置30分钟。
- 在此期间，吸从休眠或转移性肿瘤细胞（第1条编制）媒体。冲洗培养板，用10 ml磷酸盐缓冲生理盐水，pH值7.4（PBS）的。吸的PBS和加入2ml胰蛋白酶预热在37 ° C，培养板。在饱和湿度，5％CO2孵育板在37℃，5分钟。
- 转移细胞15毫升的锥形管中，辅以10％胎牛血清和抗生素的DMEM高葡萄糖5毫升和细胞计数。
- 离心1500克速度在室温5分钟，培养一个组织文化的离心机的细胞总数。在我们的实验中，我们准备为每个单元格的行或时间点2X10 3细胞/孔进行审查。然而，这可能会有所不同，这取决于使用的细胞线。
- 小心吸出上清液。请注意，在多数情况下是不可见的沉淀。因此，留下一些媒体的背后。用手指轻按15毫升锥形管的底部，以确保获得一个单细胞悬浮液。重新悬浮颗粒辅以抗生素用DMEM低血糖的2％FCS + 2％的BME（化验媒体）。应加100μL的检测媒体2X10每3细胞。磨碎的细胞多次与5毫升吸管，以确保保持单细胞悬液。
- 板100μL的细胞混合，每孔96孔BME涂层板的顶部。背景评估（第2.8节）除了100μL，每板以及只有96 BME涂层板顶部的检测媒体。在加湿5％CO2培养箱孵育培养96孔板，在37 ° C 。细胞应该重新喂养，每4天检测媒体。
增殖实验：
- 细胞增殖实验：添加到所需的时间，井点20μL细胞滴度96水溶液的一个解决方案细胞增殖检测试剂盒。饱和湿度5％CO2培养箱中孵育在37 ° C为2h。使用ELISA酶标仪记录吸光度在490nm处。背景评价和减法，添加细胞滴度96水溶液的一个解决方案细胞增殖检测试剂盒20μL井预涂层与生物医学工程和检测媒体覆盖。使用ELISA酶标仪记录吸光度在490 nm。
3。免疫荧光染色细胞信号分子，在休眠状态的肿瘤细胞（静态）和/或转移性肿瘤细胞（增殖）
在三维系统immunfluorescence染色培养休眠/转移性细胞
*以下协议是一个3D的文化Debnath 说 J 等 18公布的协议的修改。
- 准备在2.1节中所述的生物医学工程。第二天：8室载玻片系统放在一盘冰层流罩内。冰冷的BME使用200μLpipetman 50ul大衣每口井。确保生物医学工程是均匀分布，无气泡形成在井。 8室玻璃幻灯片涂在饱和湿度5％的CO 2与生物医学工程在37 ° C放置20分钟。
- 收获的休眠状态，或转移性细胞从第1条和2.3 - 2.4节所述，准备文化。收集在15毫升的锥形管培养细胞的总数。我们准备5 × 10 3细胞/孔为每个细胞株和时间点进行检查。在组织文化的1500克速度离心机离心的细胞，在室温5分钟。仔细吸出上清液。注意，球团是不可见的，因此留下一些媒体背后。用手指轻按15毫升锥形管的底部，以确保获得单细胞悬液。重新挂起检测媒体沉淀。应增加5X10每3细胞检测媒体400μl。磨碎用5ml移液管细胞的许多倍。这一步非常重要，以确保保持单细胞悬液。
- 细胞混合涂与生物医学工程8商会每板400μl。培养8商会载玻片系统在加湿5％的CO 2培养箱培养，在37 ° C。细胞应该重新喂养，每4天检测媒体。
免疫荧光染色：
- 在所需的时间点上，吸出上层的媒体和添加200μL含4％多聚甲醛（PFA），5％蔗糖和0.1％Triton X - 100的的固定液，在室温下孵育5分钟。吸出固定液，并添加4％的煤灰200μL含有5％的蔗糖和孵化，在室温下放置25分钟。
- 吸出固定液，加400μL磷酸盐缓冲液（PBS），以每口井。孵育10分钟，在室温。吸出PBS，加入400μ用含0.05％吐温20在室温下10分钟。
- 座为10％驴血清200μL或1小时（阻止使用的解决方案应确定为每个主抗体经验）3％的牛血清白蛋白在室温下固定细胞。
- 吸出阻塞的解决方案，并添加200μL抗体（稀释应确定要使用的每所小学的抗体经验）。稀释10％驴血清抗体，如果10％驴血清阻塞，或在3％BSA的主要抗体，如果使用3％BSA封闭液稀释。孵育一抗4℃过夜° C。
- 吸的抗体，用400μlPBS洗井15分钟，并重复两次。吸出PBS和添加驴200μL反各自的抗体结合罗丹明红色（稀释应凭经验确定），覆盖铝箔和1小时在室温下孵育8室幻灯片。
- 400μlPBS（3x15分钟洗），洗井。吸PBS。装用DAPI VECTASHIELD安装介质。 40分钟，在室温下在黑暗中的干幻灯片。幻灯片可以保持1周，在4 ° C商店在黑暗中的幻灯片。共聚焦显微镜图像幻灯片。
4。代表性的成果：
一个休眠D2.0R在3D文化D2A1转移性肿瘤细胞的扩散分析的一个例子是在图1A所示。 D2.0R细胞处于休眠状态（静态）通过整个实验的14天的文化时期，而高转移D2A1细胞仍然蛰伏仅4至6天之后，他们开始增殖。在最初的休眠期，许多细胞保持的3 - D的文化孤立（ 图 1B，第4天），而其他非增殖细胞形成多细胞球体。在3 - D文化过渡D2A1从休眠细胞增殖状态（ 图1B; 12天）是与细胞形态的剧烈变化。因此，这个实验可以用来测试什么因素/ s可能触发休眠D2.0R细胞摆脱其休眠状态，什么因素/ S可能会阻止其休眠状态D2A1细胞过渡。 图2是一个代理的例子防止D2A1细胞从休眠增殖状态的过渡。正如图2所示，D2A1细胞的肌球蛋白轻链激酶（ML - 7）的特异性抑制剂治疗保持D2A1细胞处于休眠状态。
在三维系统中培养的处于休眠状态和增殖的肿瘤细胞中的细胞信号可通过免疫荧光染色细胞信号分子的研究。正如图3所示的一个D2A1细胞（红染色）肌球蛋白轻链磷酸化显着增加，其次是F -肌动蛋白细丝形成的肌动蛋白压力纤维（绿色染色）重组过程中出现的过渡，从休眠（1-4天）扩散（7天）。然而，阻断肌球蛋白轻链均有产品或特定的药物（ML - 7）在D2A1细胞激酶的活性保留D2A1细胞处于休眠状态，抑制肌球蛋白轻链磷酸化和F -肌动蛋白压力纤维组织（ 图4）的结果。
图1。 体外模型来研究孤立肿瘤细胞的休眠和转移性增长开关。一）休眠D2.0R扩散和转移D2A1的，在3 - D Cultrex BME，N = 8，平均（± SE ）。三个实验（* P≤0.05）的代表结果。二）培养D2.0R和D2A1细胞的光镜图像在3 - D Cultrex BME放大倍率X20 。图修改巴坎等17。
图2。防止在抑制肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的三维培养系统的D2A1（静止）从休眠细胞增殖的开关。时间当然D2A1细胞培养增殖的3 - D，N Cultrex BME = 8，平均（± SE）。细胞未处理（对照组），或与MLCK的特异性抑制剂（ML - 7; 5微米）培养5天48小时开始治疗。图修改巴坎等17。
图3。其次是F -肌动蛋白重组的肌球蛋白轻链磷酸化在从休眠D2A1细胞增殖生长的开关。 D2A1细胞培养8室载玻片上，在3 - D Cultrex BME 。细胞的DAPI（蓝色）核本地化，鬼笔环肽（绿色）F -肌动蛋白与抗体对磷酸化形式的肌球蛋白轻链（MLC - P）（红色），表示在不同的时间点，固定和染色。 F -肌动蛋白的MLC - P染色（黄色）的合并。 D2A1（日数1 - 4）从休眠细胞增生性增长（7天），肌动蛋白应力纤维的形成（箭头）的过渡期间增加的MLC - P的表达。共聚焦显微镜，放大倍率x63。白条等于20微米。图修改巴坎等17。
图4。抑制肌球蛋白轻链激酶（MLCK）D2A1细胞介导的F -肌动蛋白应力纤维形成D2A1细胞未处理（对照组），或与MLCK的（ML - 7，5微米）抑制剂治疗，48小时开始对文化日5，或炒或MLCK的shRNA的治疗，并为磷酸化的肌球蛋白轻链（MLC - P）（红色），F -肌动蛋白（绿色），和细胞核（蓝色）形式染色。 F -肌动蛋白的MLC - P染色（黄色）的合并。共聚焦显微镜，放大倍率x63。白条等于20微米。
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Discussion
的基本机制，保持传播的肿瘤细胞处于休眠状态或在其过渡到转移性增长的结果仍是未知。这种现象已经非常困难的研究在人类患者4,12和少数临床前模型已开发来解决这个问题。然而， 在体内和体外模型系统，为肿瘤休眠的 一些特点 （1,12审查）。然而， 在体内肿瘤休眠模式主要用来验证规范肿瘤休眠的 潜在机制，但不适合进行实时探索一个单一的传播处于休眠状态的肿瘤细胞的生物学特性。
3 - D系统介绍了这里的模型，为第一次孤立的肿瘤休眠和在体外模型系统的切换到转移性增长。随着时间的推移，造型肿瘤休眠（静止）和过渡到三维系统的扩散扩散法可遵循。此法可利用一个高吞吐量的方式，在较短的时间框架的潜在因素/保持静态阶段处于休眠状态的肿瘤细胞，或可能会激活它们的增殖的基因研究。此外，增殖实验可以被用来作为一种高通量平台，屏幕上的其他肿瘤细胞株可能处于休眠状态的表型。
研究肿瘤休眠或开关管常规生化方法在三维系统的转移性增长的分子机制（RT - PCR检测/免疫印迹）是困难的，可用于生化研究，从休眠中提取的RNA /蛋白的低量肿瘤细胞。然而，图3和4，在三维模型系统的休眠和暴发的肿瘤细胞的细胞信号分子的免疫荧光染色可以适用。因此，这里提出的模型系统，可以作为一个有效的工具，开始探索调节孤立肿瘤细胞的休眠和转移性增长的过渡的分子机制。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是由国家癌症研究所的院内研究计划中的一部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 11965-118 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 11885-092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10091-148 | |
| Growth factor-reduced 3-D Cultrex Basement Membrane Extract | Trevigen Inc. | Protein concentration between 14-15mg/ml | |
| D2.0R and D2A1 cell lines | 5,19 | ||
| K7M2 and K7M2AS1.46 cells | 20 | ||
| MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | ||
| An 8 chamber glass slide system | Lab-Tek | 177402 | |
| Cell Titer 96 AQueous One Solution cell proliferation assay kit | Promega Corp. | G3580 | |
| VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Elisa Plate Reader | Bio-Tec | Record 490nm | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | Magnification x63 |
References
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