Summary
I denna rapport beskriver vi den tredimensionella hud rekonstruera modell som efterliknar människans hud i arkitektur och komposition. Melanocyte fysiologi, melanom progression och öde huden stamceller har undersökts med hjälp av huden rekonstruera modell. Modellen är också användbart som en prekliniska verktyg för läkemedelsutveckling bedömning.
Abstract
De flesta in vitro-studier på försöksdjur huden biologi har gjorts i 2-dimensionella (2D) monokulturer, medan ackumulera tyder på att cellerna beter sig annorlunda när de odlas i ett 3D extracellulär matris och även interagera med andra celler (1-5) . Musmodeller har i stort sett använts för att studera vävnad morfogenes in vivo. Men mus och mänsklig hud har betydande skillnader i cellulär arkitektur och fysiologi, vilket gör det svårt att extrapolera mus studier på människa. Eftersom melanocyterna i mus hud är oftast lokaliserade i hårsäckarna, de har olika biologiska egenskaper från de människor, som letar i första hand till de basala lagret av epidermis. Den senaste utvecklingen av 3D mänsklig hud rekonstruera modeller har gjort det möjligt fält för att undersöka cell-matrix och cell-cell interaktioner mellan olika celltyper. Den rekonstruerar består av en "dermis" med fibroblaster inbäddade i en kollagen jag matrix, en "överhuden", som består av skiktad, differentierade keratinocyter och ett funktionellt basalmembranet, som skiljer epidermis från dermis. Kollagen ger byggnadsställningar, näringstillförsel och potential för cell-till-cell interaktion. 3D-hud modeller med melanocytisk celler rekapitulera naturliga inslag i pigmentcellens homeostas och melanom progression i mänsklig hud. Som in vivo, är melanocyter i rekonstruerade huden lokaliseras till basalmembranet varvas med basala lagret keratinocyter. Melanom celler uppvisar samma egenskaper som återspeglar den ursprungliga tumören stadium (RGP, VGP och metastaserande celler melanom) in vivo. Nyligen har dermal stamceller identifierats i den mänskliga dermis (6). Dessa flera potenta stamceller kan migrera till epidermis och differentiera till melanocyter.
Protocol
1. Den tredimensionella human hud Rekonstruera Modell:
- Beredning av acellulärt lager: Blanda följande reagenser i en 50 ml tub på is: 0,59 ml 10X EMEM, 50 l 200mm L-glutamin, 0,6 mL FBS, 120 l 7,5% Natriumbikarbonat och 4,6 ml bovint kollagen I. Tillsätt 1 mL blandningen i varje insats av tråg vävnadskultur. Inkubera i 30 minuter i rumstemperatur och låt gelen stelna. Färg i blandningen skall vara av halm-gult till rosa.
- Trypsinize mänskliga fibroblaster från kultur kolvar med 0,25% trypsin / EDTA, lägga DMEM innehåller 10% FBS att neutralisera. Samla cellerna genom centrifugering och återsuspendera 0,45 x 10 6 celler i 1,5 ml DMEM med 10% FBS. För dermal stamceller, samla in 6600 dermal sfärer (när huden stamceller växer i stamceller medium, de bildar sfärer i ett liknande sätt som neurospheres) genom att trycka kolven loss sfärer, centrifugering.
- Beredning av cellulära lagret: Blanda följande i en 50 ml rör på is: 1,65 ml 10X EMEM, 150 l 200 mm L-glutamin, 1,85 ml FBS, 350 l 7,5% Natriumbikarbonat, 14 ml bovint kollagen I och 1,5 ml fibroblaster fjädring från steg 2 (Alternativt kan man använda en kombination av 0,45 x 10 6 fibroblaster och 6600 dermalt sfärer i 1,5 ml av hud rekonstruera medelstora jag för huden stamceller rekonstruerar), blanda väl. Tillsätt 3 ml av blandningen till varje acellulärt lager-coated insert. Inkubera 45 minuter vid 37 ° C i en 5% CO 2 vävnadskultur inkubator. Färg i blandningen bör vara från halmgul till rosa. Efter gelen stelnar, lägg DMEM innehåller 10% FBS (2 ml inom och 10 ml utanför insatsen i varje brunn på hud rekonstruera brickor). Inkubera i 4 dagar och se till att gelen kontrakt.
- Aspirera medium från både insidan och utsidan av varje insats. Lägg till tvätt medium (HBSS med 1% dialyseras FBS) 2 ml till insidan och 10 ml till utsidan av insatsen i syfte att tvätta bort vanliga serum. Inkubera 1 timme vid 37 ° C.
- Beredning av skinn rekonstruera medium:
- För normal melanocyte och dermal stamceller rekonstruerar: att göra grundläggande medelstora (500 ml), blanda följande reagenser: 490 ml keratinocyte serumfritt medium, 1,8 ml bovint hypofysen extrakt, 10 ml dialyseras fetalt bovinserum, 500 ìl av 10 mikrogram / mL SCF 562,5 ìl 4 mikrogram / ml bFGF och 500 ìl av 264 mikrogram / ml ET-3. Medium I: Tillsätt 10 l fonden på 100 mikrogram / ml till 100 ml grundläggande medium. Medium II: Tillsätt 2 l EGF till 100 ml grundläggande medium. Medium III: Tillsätt 720 l CaCl 2 1 M till 300 ml grundläggande medium.
- För melanom rekonstruera: För att göra Medium I (100ml), blanda följande reagenser: 72,5 mL DMEM, 24 ml F12 (HAM s), 2 ml L-glutamin på 200 mm, 200 l hydrokortison på 269 g / ml, 200 l ITES av 500X, 200 l O-phosphorylethanolamine på 0,05 m, 200 l adenin på 90 mm, 200 l Progesteron av 2 nm, 240 l CaCl 2 1 M, 200 l trijodtyronin i 10 nm och 100 ìl chelexed nyfödda kalvserum (Lös upp 3 g Chelex 100 i 100 ml serum, rör om 1,5 timmar vid 4 ° C, filtrera sterilisera). För att göra Medium II (100ml), blanda följande reagenser: 72,5 mL DMEM, 24 ml F12 (HAM s), 2 ml L-glutamin på 200 mm, 200 l hydrokortison på 269 g / ml, 200 l ITES av 500X, 200 l O-phosphorylethanolamine på 0,05 m, 200 l adenin på 90 mm, 200 l Progesteron av 2 nm, 240 l CaCl2 1 M, 200 l trijodtyronin i 10 nm och 100 l nyfödd kalv serum. För att göra Medium III (300ml), blanda följande reagenser: 142,5 mL DMEM, 142,5 ml F12 (HAM s), 6 ml L-glutamin på 200 mm, 600 l hydrokortison på 269 g / ml, 600 l inkomstskatt av 500X , 600 l O-phosphorylethanolamine på 0,05 M, 600 l adenin på 90 mm, 600 l Progesteron av 2 nm, 720 l CaCl 2 1 M, 600 l trijodtyronin i 10 nm och 6 ml nyfödd kalv serum.
- Trypsinize mänskliga keratinocyter från kultur kolvar med 0,05% trypsin / EDTA, neutralisera trypsin med sojabönor trypsin inhibitor (250 mg / L 1x fosfatbuffrad saltlösning), spinn ner, resuspendera en cellpellet på 4,17 x10 6 celler / ml i huden rekonstruera medelstora I.
- Trypsinize mänskliga melanocyterna eller celler melanom från kultur kolvar med 0,05% trypsin / EDTA, neutralisera trypsin med sojabönor trypsin inhibitor, spinn ner, resuspendera en cellpellet på 0,83 x10 6 celler / ml i huden rekonstruera medelstora I.
- Ta bort tvätt medel från både insidan och utsidan av varje insats.
- Lägg huden rekonstruera medelstora jag (1,5 ml på insidan och 10 ml till utsidan av varje insats).
- Ta 600 l cellsuspension av keratinocyter och 600 l cellsuspension av melanocyterna eller celler melanom, blanda väl. Fördela 200 l blandad droppe cellsuspension för droppe på insidan av varje insats. För dermal stamceller rekonstruera, använder 100 ìl keratinocyte fjädring bara. Inkubera i 2 dagar vid 37 ° C.
- Aspirera huden rekonstruera medelstora jagfrån både insidan och utsidan av varje insats. Lägg huden rekonstruera medelstora II (2 ml på insidan och 10 ml till utsidan). Inkubera i ytterligare 2 dagar vid 37 ° C.
- Aspirera huden rekonstruera medelstora II från insidan och utsidan av varje insats, lägga 7,5 mL huden rekonstruera medelstora III till bara utsidan. Från denna punkt, rekonstruerar ytan börjar att utsättas för luften. Ändra medelstora III varannan dag fram till dag 18.
- Harvest huden rekonstruera vid dag 18:
- Sug media från insidan och utsidan av skären.
- Ta bort insatser från facket med pincett.
- Klipp ut rekonstruera (inklusive polykarbonatfilter) genom att spåra en cirkel nära kanten med en skalpell blad.
- Skär rekonstruera och filtret i hälften på en hård yta.
- För paraffin: Placera en halv av de rekonstruera ett histologi kassett mellan 2 svarta TBS biopsi papper och njuta hela kassetten i 10% formalin i mer än 4 timmar. Placera sedan kassetten i 70% etanol och lagra den i 4 ° C tills du är redo att bearbeta rekonstruera för paraffininbäddning.
- För frysta snitt:
- Placera den andra halvan av rekonstruera i 50% sackaros vid 4 ° C i 1-2 timmar, sedan ändra sackaros till 2M och lagra den i 4 ° C i ytterligare 1-2 timmar.
- Fördela optimal kapning medier Frysning (oktober) i en disponibel bas formen så att den fyller ca 50% av båten. Undvik bubblor i ULT.
- Ta tag i kanten på rekonstruera med pincett och ta bort rekonstruera från sackaros. Placera den på Kimwipes tills Kimwipes absorbera sackaros.
- Överför rekonstruera i basen mögel på toppen av oktober, med hjälp av pincett och en spatel. Täck toppen av rekonstruera med fler oktober tills basen formen är helt full. Se till att du inte har några bubblor i oktober som kommer att göra skärande svårt.
- Placera basen mögel jämnt på krossad torris och låta oktober att frysa helt.
- Linda basen mögel i aluminiumfolie och förvara den vid -70 ° C tills du är redo att klippa den med en kryostat.
- Ympa en hud rekonstruera på en mus:
- Förbered en 50 ml Falcon rör med 5 mL DMEM (för frysning och upptining mus hud).
- Använd en kvinnlig SCID hårlös utavlat musen runt 6 veckor.
- Musen är sövda med isofluran (EZ anestesi-system): första anestesi sker i induktionskammare med 4% isofluran (innan musen flyttas till den kirurgiska sängen) och bibehålla anestesi genom en nosecone paus under förfarandet (isofluran: 1,5-2% ). Värme stöd av en uppvärmd platta för att förhindra hypotermi och sterila oftalmiska smörjmedel tillämpas för att förhindra okulär skada under narkos.
- Sätt 600 ml vatten i en bägare och lämna på toppen av en värmeplatta för att hålla vattentemperaturen mellan 40 - 60 ° C.
- Rengör musen huden med sammansatta benzoin tinkturen och spritsuddar prep.
- Markera en linje på toppen av musen tillbaka för att hålla samma position för suturering senare.
- Skär ett runt såret ca 1,2 cm i diameter på musen övre delen av ryggen med hjälp av Iris sax och pincett. Täck såret med steril gasbinda svampar. Sätt den runda musen huden i 5 ml DMEM, sedan lämna i flytande kväve behållare tills den är helt fryst. Avfrostning röret i hett vatten på toppen av en värmeplatta tills helt upptinade. Upprepa 3 gånger.
- Lossa huden rekonstruera från transwell med kirurgiska blad och ta bort membranet mycket försiktigt, för över huden rekonstruera (överhuden uppåt) på toppen av såret.
- Placera musen huden (epidermis uppåt) på toppen av huden rekonstruera.
- Gör den första sutur på markören tidigare märkt, den andra på botten, sedan ytterligare två suturer på sidorna att fixa musen huden.
- Rengör musen huden efter ympning. Ta bort nosecone och hålla musen på den uppvärmda plattan tills vaken och rörlig.
- Sätt musen till en ny bur.
- Postoperativa analgesi: Meloxikam (1 mg / kg) genom subkutan injektion omedelbart efter operationen, 24 timmar och 48 timmar efter operationen.
2. Representativa resultat:
Hud rekonstruerar med normala melanocyter och dermal stamceller
Huden rekonstruerar odlas i en speciell 6-bra bricka med bilagor. Huden facket är odlade i DMEM med 10% FBS för de fyra första dagarna (Fig. 1A). Huden rekonstruerar mediet jag används när keratinocyter är ympats med melanocyterna eller celler melanom (Fig. 1B). Överhuden är utsatt för luft vid dag 9 och detta gör keratinocyter att differentiera (bild 1C). På dagen 18, rekonstruerar epidermis i huden består av skiktad keratinocyte lager. Den odifferentierade basala lagret och sekventiellt differentierade skikt är vertikalt orienterade (fig. 1D). Stainning den del av rekonstruerar med melanocytisk markör S100 visar att melanocyterna är i linje med de basala lagret av överhuden och kommunicera med flera keratinocyter genom Dendrite förlängningar (Fig. 1E). Huden facket innehåller fibroblaster inbäddad i en kollagen typ I matris. Deponeras kollagen IV anger basalmembranet som skiljer överhuden från läderhuden (bild 1F). När dermal stamceller (märkt med GFP Lentiviral vektor) är inbäddade med fibroblaster i en kollagen I matris, vandrar de till epidermis och differentierar till melanocyter (1), (bild 2). Flera lager av keratinocyter i epidermis utvecklas.
Huden rekonstruerar av melanom tumörer
Clinicopathological studier visar att melanom framsteg i flera steg: gemensamma förvärvade nevi, dysplastiska nevi, RTP (radial tillväxtfas) melanom, VGP (vertikal tillväxtfas) melanom och metastaserande melanom (7). Olika stadier av linjer melanom cell är morfologiskt lika varandra i 2-D kultur (Fig. 3A-D), men när de ingår i huden rekonstruerar, återspeglar beteendet hos de celler de in vivo egenskaper. Läget och tillväxten av normala melanocyter är hårt styrda i huden rekonstruerar (Fig. 3E). RGP primära melanom WM35 föröka sig främst epidermis (Fig. 3F), medan VGP melanom WM793 växer invasivt in i dermis (bild 3G). Metastaserande melanom 1205Lu invadera aggressivt djupt ner i dermis (bild 3H).
Figur 1. Hud rekonstruerar med normala melanocyter. Brutto hudens utseende rekonstruerar visas i AC. A. fibroblasts blandas med kollagen odlas i DMEM med 10% FBS och form dermal fack. B. keratinocyter och melanocyter är seedad på toppen av dermis och växa i huden rekonstruera medium. C. överhuden utsätts för luft vid dag 9. D. H & E-färgade hud rekonstruera presenterar överhuden består vertikalt orienterade basala lager och sekventiellt differentierade skiktat lager cell. Dermis innehåller fibroblaster inbäddad i en kollagen typ I matris. E. S100-positiva melanocyterna (svarta pilar) hamnar på basalmembranet och kommunicera med flera keratinocyter. F. Kollagen IV-färgning anger basalmembranet som skiljer överhuden från läderhuden. Alla stainings i DF utfördes på formalinfixerade, paraffininbäddade snitt.
Figur 2. Dermal stamceller i hudens rekonstruerar migrera till epidermis och differentierar till melanocyter. Vid 5 dagar efter sådd keratinocyter, enda GFP-positiva celler (grön) börjar migrera ut från sfärer. Överhuden är fortfarande består av ett enda lager. Dag 8, ett fåtal celler når epidermis-dermis gränssnitt. På dagen 10, GFP-positiva celler tätt linje vid basalmembranet position. Den migrerade GFP-positiva celler i överhuden uttrycka melanocytisk markör HMB45 (röd, vilket framgår av vita pilar). Kärnor färgas med DAPI (blå). Överhuden är utvecklat som flera lager. Basalmembranet indikeras med vita streckade linjer.
Figur 3. Huden rekonstruerar olika stadier av melanom: AD. Normala melanocyter och celler melanom odlas i 2D kulturer. A. Melanocyter från förhuden. B. RGP WM35 celler. C. VGP WM793 celler. D. metastaserande melanom 1205Lu celler. E. Normal melanocyter finns vid basalmembranet. F. RGP melanom WM35 celler växer som cell-kluster i överhuden. G. VGP melanom WM793 celler invaderar in i dermis genom basalmembranet. H. metastaserande melanom 1205Lu celler invaderar aggressivt djupt i dermis.
Felsökning
| Problem | Felsökning |
| Kollagen blandningen inte stelna inte | Kollagen blandningen färg bör halm-gult till rosa, annars pH fel och kollagen får inte gel. Om färgen är ljust gul, bör mer natriumbikarbonat läggas droppvis. |
| Kollagen fällningar förtid i mixuture | Förvara alla komponenter på is tills kollagen blandningen släpps ut på skäret |
| Kontrakterade kollagen är inte ens (den ena sidan är tjockare än den andra sidan) | Kalibrera hylla inkubatorn |
| Överhuden bildas med mindre än tre keratinocyte lager. | Använd odifferentierade keratinocyter vid lägre passager |
Discussion
Vi har beskrivit att generera 3D huden rekonstruerar med normala mänskliga melanocyterna, dermal stamceller och celler melanom. När odlas i monolager kultur, melanocytisk celler presentera en liknande morfologi (tillplattad, spindel eller mer dendritiska-formad) oavsett ursprung klinisk fas. Däremot rekonstruerar 3D hud rekapitulera steg-specifika egenskaper melanom celler. Normal mänsklig melanocyter bosatta basalmembran mellan epidermal och dermal skikt som enskilda celler. RGP primära melanom celler växer som små klasar längs basalmembranet medan mer aggressiv VGP melanom celler växa som stora kluster bryta igenom basalmembranet i dermis. Metastaserande melanom celler växer i alla riktningar och invaderar djupt i dermis som enskilda celler eller kluster. Kvantitativa analyser kan utföras på denna modell genom att mäta djupet i invasionen och omfattningen av spridningen. Förutom karakterisering av normala och maligna melanocytisk celler, enligt den modell som vi direkt kan inducera differentiering av huden stamceller till mognat melanocyter, som hem till basala lagret av överhuden och etablera bona fide kommunikation med keratinocyter genom uppreglering av E-cadherin ( 6).
Använda virala vektorer, kan vi antingen aktivera eller inaktivera geners funktion för en bättre förståelse av dynamiken och funktionella betydelsen av gener som uttrycks genom varje celltyp i huden rekonstruerar, som lovar att bli en effektiv modell för att studera inte bara omvandlingen mekanismer melanocyter , men också utvecklingen av melanom (8). Långsiktiga observationer av cellens fenotyp har blivit möjligt genom ympning av hud rekonstruerar till nedsatt immunförsvar djur. En sådan mänsklig hud-mus chimär är ett utmärkt instrument för forskning för att studera melanomagenesis och melanom metastaser.
Huden rekonstruerar också kan vara en användbar plattform för läkemedelsutveckling bedömning. Många läkemedel som utrota cancerceller i 2D odlingsbetingelser har ofta liten effekt i experimentella och kliniska tillämpningar. Som framgår av in vivo tumören, melanom celler i 3D kulturer är ofta resistenta mot de läkemedel som cellerna i 2D kulturer svara på, vilket tyder på att mikromiljön modulerar signalvägar i melanom. För framgångsrik läkemedelsutveckling, 3D huden rekonstruera modellen är en idealisk preklinisk verktyg för att förutsäga effekterna av föreningar in vivo (9,10).
Sammanfattningsvis, hud rekonstruera modeller överbrygga gapet mellan in vitro och in vivo-studier. De kommer att leda till en bättre förståelse för vilka gener som är inblandade i omvandlingen och hur stamceller bidrar till denna omvandling.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Wistar institutet Djuranläggningen, Mikroskopi Facility, Histotechnology Facility och forskning Supply Center. Denna studie har finansierats delvis genom anslag från National Institutes of Health CA 076.674, CA 098.101, CA 025.874 och CA 10.815.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x EMEM | BioWhittaker | 12-684F | |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH-30071.02 | |
| Bovine Tendon Acid-Extracted Collagen | Organogenesis | 200/50 | |
| Tissue Culture 6-well Trays with Inserts | Organogenesis | 9285 | |
| Keratinocyte Serum Free Medium | GIBCO, by Life Technologies | 17005042 | |
| Dialyzed Fetal Calf Serum | Hyclone | SH-30079.03 | |
| recombinant Human Stem Cell Factor | Fitzgerald Industries | RDI-307-255X | |
| Basic FGF | Fitzgerald Industries | 30R-AF015 | |
| Endothelin-3, human | American Peptide | 88-5-10 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-7902 | |
| DMEM | JRH biosciences | 56430-10L | |
| F12 (HAM’s) | GIBCO, by Life Technologies | 11765-54 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0888 | |
| Insulin, Transferrin, Ethanolamine, Selenium (ITES) | BioWhittaker | 17839Z | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A9795 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Newborn calf serum | Hyclone | SH3011802 | |
| 10% buffer formalin | Surgipath | 00600 | |
| Optimal cutting temperature freezing media (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| Multi cassettes | Surgipath | 02293-BX | |
| TBS biopsy papers | Triangle Biomedical Sciences | BP-B | |
| TBS biopsy papers | Triangle Biomedical Sciences | BP-B | |
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 15-182-501C | |
| Compound benzoin tincture | Professional Disposables, Inc, | S42450 | |
| Alcohol Prep Swabs | CVS pharmacy | ||
| Silk Black Braided 5-0 | Ethicon Inc. | 682G | |
| Gauze sponges (sterile) | CVS pharmacy | ||
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS5070 | |
| Iris scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS5913 | |
| Surgical blades | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2976 | |
| EZ anesthesia | Euthanex Corp. | ||
| SCID hairless outbred mouse | Charles River Laboratories |
References
- Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 242-247 (2006).
- Sun, T., Norton, D., McKean, R. J., Haycock, J. W., Ryan, A. J., MacNeil, S. Development of a 3D cell culture system for investigating cell interactions with electrospun fibers. Biotechnol Bioeng. 97, 1318-1328 (2007).
- Kremer, M., Lang, E., Berger, A. Organotypical engineering of differentiated composite-skin equivalents of human keratinocytes in a collagen-GAG matrix (INTEGRA Artificial Skin) in a perfusion culture system. Langenbecks Arch Surg. 386, 357-363 (2001).
- Escámez, M. J., Garcí, M., Larcher, F., Meana, A., Muñoz, E., Jorcano, J. L., Del Río, M. An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice. J Invest Dermatol. 123, 1182-1191 (2004).
- Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Yu, H., Xu, X., Kong, J., Lee, J. T., Herlyn, M. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J Cell Sci. 123, 853-860 (2010).
- Meier, F., Nesbit, M., Hsu, M. Y., Martin, B., Van Belle, P., Elder, D. E., Schaumburg-Lever, G., Garbe, C., Walz, T. M., Donatien, P., Crombleholme, T. M., Herlyn, M. Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF. Am J Pathol. 156, 193-200 (2000).
- Yu, H., McDaid, R., Lee, J., Li, L., Kumar, S. M., Elder, D. E., Van Belle, P., Gimotty, P., Guerra, M., Hammond, R., Nathanson, K. L., Dalla Palma, M., Herlyn, M., Xu, X. The role of BRAF mutation and p53 inactivation during transformation of a subpopulation of primary human melanocytes. Am J Pathol. 174, 2367-2377 (2009).
- Lee, J. T., Li, L., Brafford, P. A., van den Eijnden, M., Halloran, M. B., Sproesser, K., Haass, N. K., Smalley, K. S., Tsai, J., Bollag, G., Herlyn, M. PLX4032, a potent inhibitor of the B-Raf V600E oncogene, selectively inhibits V600E-positive melanomas. Pigment Cell Melanoma Res. 23, 820-827 (2010).
- Tsai, J., Lee, J. T., Wang, W., Zhang, J., Cho, H., Mamo, S., Bremer, R., Gillette, S., Kong, J., Haass, N. K. Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3041-3046 (2008).
