Summary
Мы представляем подробный протокол для агробактериальной вирус-индуцированных генов (VIGS) анализа в хлопка. Вирус табачной погремушкой (ТРВ)-производные векторов VIGS были развернуты, чтобы побудить глушителей РНК хлопка GrCLA1, Cloroplastos alterados один ген. Альбиноса фенотип вызванных глушителей GrCLA1 наблюдался на всходов в течение 2 недель после прививки.
Protocol
1. Саженцы выращивают хлопок
- Сейте семена возвышенности хлопка (Gossypium hirsutum) многообразие Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR и Deltapine 90 в горшках (7 см в диаметре), содержащий Metro Mix 700 (SunGR, Beavile, штат Вашингтон).
- Имейте в горшках поднос, покрытый пластиковым куполом при 23 ° С, 120 мкЕ м -2 с -1 света, с 12 час light/12 час светового дня в темном роста комнате.
- Удалить купол, когда две семядоли появились.
- Примерно две недели спустя, использование растений с двумя полностью расширена семядоли для анализа VIGS. На данном этапе, настоящие листья еще не вышли (рис. 1).
2. Построить VIGS вектора, несущего ген GrCLA1
- Amplify 1 Cloroplastos alterados ген хлопок (GrCLA1) с помощью ПЦР с праймерами GrCLA1-F, 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 'и GrCLA1-R, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3 "из библиотеки кДНК Г. raimondii тканях листа.
- Дайджест ПЦР продуктов GrCLA1 с EcoRI и KpnI и вставьте в pYL156 (pTRV-RNA2) вектора на перевязки.
- Экран клонов на LB агаром, содержащей 50 мкг / мл канамицина. Проверка конструкции ограничением пищеварения фермента и последовательности.
- Преобразование плазмиды Agrobacterium в tumefaciens GV3101 электропорацией и восстановить в жидкой среде LB при 28 ° C. Выберите трансформантов на пластинах с LB + канамицину (50 мкг / мл) + гентамицин (25 мкг / мл). Бактерии могут быть сохранены в 25% глицерине при -80 ° С для длительного использования.
3. Выполните VIGS прививки
- За три дня до прививки, полоса замороженные запасы глицерина tumefaciens Agrobacterium проведения pYL192 (ТРВ): RNA1, pYL156 (ТРВ): RNA2 (вектор в одиночку) и pYL156 (ТРВ): RNA2-GrCLA1 на LB агаром, содержащей 50 мкг / мл канамицина и 25 мкг / мл гентамицина. Инкубируйте пластин при 28 ° С в течение 24 часов.
- За два дня до проникновения VIGS, выбрать одну колонию для каждой конструкции из выше пластин и привить его в 5 мл LB среде, дополненной 50 мкг / мл канамицина и 25 мкг / мл гентамицина; Grow бактериальной культуры при 28 ° С в течение ночи в каток со скоростью 50 оборотов в минуту.
- Передача выше культуры в колбу с 50 мл LB среде, дополненной 50 мкг / мл канамицина и 25 мкг / мл гентамицина, плюс 10 мМ MES (2 - (4 морфолино)-этан сульфокислоты) и 20 мкМ acetosyringone. Рост культуры при 28 ° С в течение ночи в шейкере со скоростью 50 оборотов в минуту.
- На следующий день, спином вниз агропромышленного бактериальных клеток при 4000 оборотов в минуту в течение 5 минут, повторно приостанавливать культуры в инфильтрации буфера, содержащего 10 мМ MgCl 2, 10 мМ MES и 200 мкМ acetosyringone. Отрегулируйте OD 600 из культуры до 1,5.
- Оставить культуру на скамейке при комнатной температуре в течение 3 часов.
- До агробактериальной инфильтрация, удар нижней семядолей хлопчатника с 25 G иглу без пирсинга через семядоли. Один или два отверстия (в зависимости от мягкости ткани) были кулаками по каждому разделу семядолей (рис. 2).
- Смешайте агробактериальной суспензионной культуре pYL192 (ТРВ): RNA1 и pYL156 (ТРВ): RNA2 или pYL156 (ТРВ): RNA2-GrCLA1 в соотношении 1:1; рука проникнуть смесь из нижней семядолях через ранив сайтов с помощью 1 needleless мл шприца (рис. 3).
- Обложка растения с пластиковым куполом и оставить проникли растений при комнатной температуре, при тусклом освещении на ночь.
- Передача растений к росту комнате с температурой 23 ° С, 120 мкЕ м -2 с -1 света с 12-часовой световой / 12 часа темно цикла.
Примечание: VIGS работает, когда растения находятся в стадии либо 23 ° С или теплице (25-28 ° С). Когда температура относительно невысока (от 23 до 25 ° С), легче для прививки и фенотип является более равномерным по сравнению с более высокими (28-30 ° С) или колебались температуры. Покрытие растений с куполом и делает VIGS более эффективным.
- Изучить глушителей фенотипа в 7 ~ 8 дней после проникновения. Настоящих листьев из замолчать растений pYL156 (ТРВ): RNA2-GrCLA1 начал отображать альбиноса фенотип (рис. 4). Растения проникли с агробактерий проведения pYL156 (ТРВ): RNA2 служить в качестве контроля.
- Проверьте эффективность генов путем изучения уровня экспрессии эндогенных генов с использованием обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР) с РНК, выделенной из-под контроля и заставил замолчать растения хлопка.
Примечание: VIGS-е изд растения должны находиться под карантином, содержащихся условиях и растения должны быть надлежащим образом автоклавного и утилизировать после анализов, как ТРВ имеет широкий круг хозяев и уведомлению возбудителя.
4.Представитель Результаты:
Примерно через две недели после ручной инфильтрация с агробактериальной смеси, альбиноса фенотип вызванных GrCLA1 глушителей явно наблюдается на настоящих листьев. Глушителей КПД достигает почти 100% в нескольких экспериментов с более чем 50 заводах. Замолчать растений дисплей равномерно распределенных и очень сильный альбиноса фенотипа на новых развивающихся листьев с мозаикой на листья бузины (рис. 4).
Рисунок 1. Хлопка рассады на примерно две недели старой сцены с двумя полностью развернут семядоли для агробактериальной инфильтрации.
Рисунок 2. Штамповка крошечные отверстия на нижней стороне семядолей хлопчатника использованием 25 G иглы для облегчения агробактериальной инфильтрации.
Рисунок 3. Рук инфильтрации агробактериальной смесь в семядоли хлопок через ранив сайтов с помощью шприца needleless
Рисунок 4. Альбино фенотипа появилась на VIGS замолчать хлопчатника. Четыре сорта показано на рисунке. ) Fibermax 832; B) Phytogen 480WR; С) Phytogen 425RF; D) Deltapine 90.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
VIGS был доказан, чтобы быть мощным инструментом в области функциональной геномики анализа временно сбить экспрессии эндогенных генов. В этом исследовании, мы разработали агробактериальной VIGS за счет использования TRV основе двоичного вектора. Хлопок CLA1 (GrCLA1) ген был разработан как визуальным маркером для мониторинга эффективности глушителей. Мы последовательно приобрела 100% генов эффективности глушителей, свидетельствует альбиноса фенотип, появляющиеся на настоящих листьев во всех разновидностях испытания, начиная с около двух недель после проникновения. Тем не менее, CLA1-замолчать растения хлопка почти превратился в волокно или посевной стадии, который, вероятно, из-за сильных дефектов на хлоропласта развития. Успешное развитие хлопкового VIGS предоставляет альтернативу легко молчание генов, представляющих интерес для потерей функции анализов и закладывает основу для хлопка функциональной генетики / геномики в быстро приближается постгеномной эпохи 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора. SP-Динеш Кумар и Юла Лю для ТРВ-VIGS векторов, и д-ра. Чак Kenerley, Терри Уилер, Джим Старр и Bayer CropScience за предоставление семян хлопчатника. Эта работа финансировалась NSF для LS и NIH для PH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roller drum | Glas-Col | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | Bio-Rad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | Bio-Rad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | Bio-Rad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB Corp., Affymetrix | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Infiltration buffer |
References
- Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes. Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).
- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y.
- Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
- Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. Plant J. 39, 734-746 (2004).
- Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P.
- Estevez, J. M., Cantero, A., Romero, C., Kawaide, H., Jimenez, L. F., Kuzuyama, T. Analysis of the expression of CLA1, a gene that encodes the 1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway in Arabidopsis. Plant Physiol. 124, 95-104 (2000).
- Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution. Plant J. 9, 649-658 (1996).
- Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt. Plant J. 66, 293-305 (2011).
