Summary
Se presenta el protocolo detallado para la mediada por Agrobacterium inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) de ensayo en el algodón. El virus del cascabel del tabaco (TRV) vectores derivados de VIGS fueron desplegados para inducir el silenciamiento de ARN de algodón GrCLA1, Alterados Cloroplastos un gen. El fenotipo albino causadas por el silenciamiento GrCLA1 se observó en el estado de plántula dentro de 2 semanas después de la inoculación.
Abstract
Algodón (Gossypium hirsutum) es uno de los cultivos más importantes del mundo. Los esfuerzos se han hecho considerables en la reproducción molecular de nuevas variedades. El análisis genético a gran escala funcional de algodón se ha quedado atrás la mayor parte de las especies de plantas modernas, probablemente debido a su gran tamaño de la duplicación del genoma, los genes y la poliploidía, largo ciclo de crecimiento y la obstinación a la transformación genética 1. Para facilitar el estudio funcional de alto rendimiento genética / genómica en algodón, tratamos de desarrollar ensayos transitoria rápida y eficiente para evaluar las funciones de genes de algodón.
Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) es una poderosa técnica que fue desarrollada con base en el host post-transcripcional silenciamiento génico (PTGS) para reprimir la proliferación viral 2,3. Mediada por Agrobacterium VIGS ha sido aplicado con éxito en una amplia gama de especies dicotiledóneas como Solanaceae, Arabidopsis y otras especies de leguminosas y especies monocotiledóneas como la cebada, el trigo y el maíz, por diversos estudios de genómica funcional 3,4. Como este método rápido y eficaz evita la transformación de plantas y supera la redundancia funcional, es particularmente atractiva y adecuada para el estudio de genómica funcional en las especies de cultivos como el algodón no es susceptible de transformación.
En este estudio, se presenta el protocolo detallado de Agrobacterium VIGS sistema en el algodón. Entre los varios vectores VIGS viral, el virus del cascabel del tabaco (TRV) invade una amplia gama de huéspedes y es capaz de propagarse con fuerza a lo largo de toda la planta sin embargo, producen síntomas leves en la hosts5. Para controlar la eficacia de silenciamiento, GrCLA1, un gen homólogo de Arabidopsis Cloroplastos Alterados un gen (AtCLA1) en el algodón, ha sido clonado y se inserta en el vector binario VIGS pYL156. CLA1 gen está involucrado en el desarrollo del cloroplasto 6, y estudios previos han demostrado que pérdida de función de AtCLA1 dio lugar a un fenotipo albino de 7 hojas verdaderas, proporcionando un excelente marcador visual para silenciar la eficiencia. En aproximadamente dos semanas después de la infiltración de Agrobacterium, el fenotipo albino comenzaron a aparecer en las hojas verdaderas, con una eficiencia del 100% en silenciar a todos los experimentos replicados. El silenciamiento de la expresión de genes endógenos también fue confirmado por RT-PCR análisis. Significativamente, el silenciamiento potente podría ocurrir en todas las variedades que hemos probado, incluyendo varias variedades cultivadas comercialmente en Texas. Esta rápida y eficiente mediada por Agrobacterium VIGS ensayo proporciona una herramienta muy poderosa para un rápido análisis a gran escala de las funciones de los genes en el genoma de nivel en el algodón.
Protocol
1. Crecer las plántulas de algodón
- Sembrar las semillas del algodón (Gossypium hirsutum) variedad FiberMax 832, Phytogen 425RF, 480WR Phytogen y Deltapine 90 en macetas (7 cm de diámetro) que contienen la mezcla Metro 700 (SunGR, Beavile, WA).
- Mantenga los recipientes en una bandeja cubierta con una cúpula de plástico a 23 ° C, 120 μE m -2 S -1 luz, con un fotoperíodo de 12 horas light/12 horas oscuras en una sala de crecimiento.
- Retire la terminal cuando dos cotiledones han surgido.
- Aproximadamente dos semanas después, el uso de las plantas con dos cotiledones completamente abiertos para el ensayo de VIGS. En esta etapa, las hojas verdaderas, no han salido a la luz (Figura 1).
2. Construir VIGS vector portador del gen GrCLA1
- Amplificar el gen de una Alterados Cloroplastos de algodón (GrCLA1) por PCR con cebadores GrCLA1-F, 5'-GCCCTTTGTGCATCTTC-3 'y GrCLA1 R-, 5'-CTCTAGGGGCATTGAAG-3' de una biblioteca de cDNA de G. raimondii hoja de tejidos.
- Digerir los productos PCR de GrCLA1 con EcoRI y KpnI y se insertan en pYL156 (pTRV-ARN2) vector de la ligadura.
- Pantalla de los clones en placas de agar LB que contenía 50 mg / ml de kanamicina. Verificar las construcciones por la digestión con enzimas de restricción y secuenciación.
- Transformar el plásmido en Agrobacterium tumefaciens GV3101 mediante electroporación y se recuperan en medio LB líquido a 28 ° C. Seleccionar los transformantes en placas con LB + kanamicina (50 mg / ml) + gentamicina (25 mg / mL). Las bacterias se pueden almacenar en un 25% de glicerol a -80 ° C para el uso a largo plazo.
3. VIGS realizar la inoculación
- Tres días antes de la inoculación, las acciones de glicerol racha de congelado de Agrobacterium tumefaciens llevar pYL192 (TRV): ARN1, pYL156 (TRV): ARN2 (vector por sí solo) y pYL156 (TRV): ARN2-GrCLA1 en placas de agar LB que contenía 50 mg / ml de kanamicina y 25 mg / ml de gentamicina. Las placas se incuban a 28 ° C durante 24 horas.
- Dos días antes de la infiltración VIGS, elegir una sola colonia para construir cada uno de los platos por encima y por inocular en 5 ml de medio LB suplementado con 50 mg / ml de kanamicina y 25 mg / ml de gentamicina; Mantener el cultivo de bacterias a 28 ° C para pasar la noche en un tambor a una velocidad de 50 rpm.
- La transferencia de la cultura por encima de un frasco con 50 ml de medio LB suplementado con 50 mg / ml de kanamicina y 25 mg / ml de gentamicina, además de 10 mM MES (2 - (4 morfolino)-etano sulfónico) y 20 acetosiringona M. Mantener el cultivo a 28 ° C durante la noche en una coctelera con una velocidad de 50 rpm.
- Al día siguiente, vuelta a las células agro-bacteriana a 4000 rpm durante 5 minutos, volver a suspender la cultura en el buffer de la infiltración que contiene 10 mM de MgCl2, 10 mM MES y 200 acetosiringona M. Ajuste el OD 600 de la cultura a 1,5.
- Salir de la cultura en el banquillo a temperatura ambiente durante 3 horas.
- Antes de la infiltración Agrobacterial, ponche de la parte inferior de los cotiledones de las plantas de algodón con una aguja de 25 G sin perforar a través de los cotiledones. Uno o dos agujeros (depende de la suavidad de los tejidos) fueron perforados en cada sección de los cotiledones (Figura 2).
- Mezcla de cultivo en suspensión de Agrobacterial pYL192 (TRV): ARN1 y pYL156 (TRV): ARN2 o pYL156 (TRV): ARN2-GrCLA1 en una proporción de 1:1; mano infiltrarse en la mezcla de la parte inferior de los cotiledones a través de los sitios de heridas con un 1 ml jeringa sin aguja (Figura 3).
- Cubrir las plantas con una cúpula de plástico y dejar que las plantas se infiltraron a temperatura ambiente bajo condiciones de luz tenue de la noche.
- Transferencia de las plantas a una sala de crecimiento con la temperatura de 23 ° C, 120 μE m -2 S -1 luz con un ciclo de 12 horas horas de luz / oscuridad 12.
Nota: VIGS funciona cuando las plantas están ya sea 23 ° C o en un invernadero (25-28 ° C). Cuando la temperatura es relativamente baja (23 a 25 ° C), es más fácil para la inoculación y el fenotipo es más uniforme en comparación con los más altos (28-30 ° C) o la temperatura fluctuó. Cubriendo las plantas con una cúpula también hace VIGS más eficiente.
- Examine el fenotipo de silenciar a las 7 ~ 8 días después de la infiltración. Las hojas de las plantas de verdad silenciada por pYL156 (TRV): ARN2-GrCLA1 comenzó a mostrar el fenotipo albino (Figura 4). Las plantas se infiltraron con la realización de agrobacterias pYL156 (TRV): ARN2 servir como un control.
- Verificar la eficiencia de silenciamiento de genes mediante el examen de nivel de expresión de genes endógenos usando la polimerasa de transcripción inversa reacción en cadena (RT-PCR) con ARN aislado de control y silenció las plantas de algodón.
Nota: Las plantas VIGS de opinión deben mantenerse bajo condiciones de cuarentena contenidos y las plantas deben estar debidamente esterilizado en autoclave y desecharse después de los ensayos como TRV cuenta con una amplia gama de huéspedes y es un patógeno de declaración obligatoria.
4.Los resultados representativos:
Aproximadamente dos semanas después de la mano con la mezcla de infiltración Agrobacterial, el fenotipo albino causada por GrCLA1 silenciamiento se observó claramente en las hojas verdaderas. La eficiencia de silenciamiento alcanza casi el 100% en varios experimentos con más de 50 plantas. Las plantas presentan un fenotipo silenciado uniformemente distribuidos y muy fuerte albino en el desarrollo de nuevas hojas con un mosaico en las hojas mayores (Figura 4).
Figura 1. Un brote de algodón alrededor de la etapa de dos semanas de edad con dos cotiledones completamente abiertos utilizados para la infiltración Agrobacterial.
Figura 2. Perforación de pequeños agujeros en la parte inferior de los cotiledones de las plantas de algodón con una aguja G 25 para facilitar la infiltración Agrobacterial.
Figura 3. Infiltración de la mano de la mezcla de Agrobacterial en los cotiledones de algodón a través de los sitios de heridas con una jeringa sin aguja
Figura 4. Fenotipo Albino apareció en VIGS silenciado las plantas de algodón. Cuatro cultivares se muestran. A) FiberMax 832, B) Phytogen 480WR; C) Phytogen 425RF; D) Deltapine 90.
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Discussion
VIGS ha demostrado ser una poderosa herramienta en el análisis de la genómica funcional de forma transitoria derribar la expresión de genes endógenos. En este estudio, hemos desarrollado un VIGS mediada por Agrobacterium mediante la utilización de un vector binario TRV-basado. El algodón CLA1 (GrCLA1) gen fue desarrollado como una marca visual para monitorear la eficiencia de silenciamiento. Siempre hemos obtenido el 100% de eficiencia de silenciamiento génico, como lo demuestra el fenotipo albino que aparecen en las hojas verdaderas en todas las variedades probadas, a partir de unas dos semanas después de la infiltración. Sin embargo, CLA1-silenciado las plantas de algodón muy poco desarrolladas en la fibra o la etapa inicial, el cual probablemente se deba a defectos importantes en el desarrollo del cloroplasto. El desarrollo exitoso de VIGS algodón es una alternativa para silenciar rápidamente los genes de interés para los ensayos de la pérdida de función y sienta las bases para la genética de algodón funcional / genómica en la acercando rápidamente post-genoma era de los 8.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos a los Dres. SP Dinesh-Kumar y Liu Yule para TRV-VIGS vectores, y los Dres. Chuck Kenerley, Wheeler Terry, Starr y Jim Bayer CropScience para el suministro de semillas de algodón. Este trabajo fue financiado por la NSF para LS y los NIH para PH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Roller drum | Glas-Col | 099A TC108 | Agro-bacterium culture |
| Incubator | Sheldon Manufacturing, Inc. | 01046209 | Agro-bacterium culture |
| UV/Vis spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Model: DU530 | Measuring OD |
| Gene Pulser | Bio-Rad | Model: 1652076; Serial: 154BR3880 | Electroporation |
| Pulser Controller | Bio-Rad | Model: 1652098; Serial: 232BR4833 | Electroporation |
| Micropulser Electroporation cuvette | Bio-Rad | 165-2081 | Electroporation |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 30962 | Inoculation of agro-bacterium |
| Metro Mix 700 | SUNGR | SKU# 553001 | Growing seedling |
| Terra Cotta pot | T.O.Plastics | GPS 3001B2 | Growing seedling |
| MES monohydrate | USB Corp., Affymetrix | 18886 | Infiltration buffer |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Infiltration buffer |
References
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- Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. Virus-induced gene silencing. Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).
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