Summary
Diese Studie beschreibt eine Methode, die schnelle und eindeutige Diagnose von Pflanzenviren Krankheiten in etwa einen halben Tag ermöglicht durch eine Kombination von Mikrowellen-assistierte Anlage Probenvorbereitung für die Transmissionselektronenmikroskopie und negativen Färbemethoden.
Abstract
Untersuchungen der ultrastrukturellen Veränderungen, die durch Viren hervorgerufen sind oft notwendig, eindeutig zu identifizieren Viruserkrankungen bei Pflanzen. Bei herkömmlichen Probenvorbereitung für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) solche Untersuchungen kann mehrere Tage dauern 1,2 und sind daher nicht für eine schnelle Diagnose von Pflanzenviren Erkrankungen. Mikrowelle Fixierung kann verwendet werden, um drastisch zu reduzieren Probenvorbereitung Zeit für TEM-Untersuchungen mit ähnlichen ultrastrukturelle Ergebnisse beobachtet, nachdem konventionell Probenvorbereitung 3-5 werden. Viele verschiedene maßgeschneiderte Mikrowellen-Geräte sind derzeit verfügbar, die für die erfolgreiche Fixierung und Einbettung von biologischen Proben für die TEM-Untersuchungen 5-8 verwendet werden. In dieser Studie zeigen wir über Tabak-Mosaik-Virus (TMV) infiziert Nicotiana tabacum Pflanzen, dass es möglich ist, ultrastrukturelle Veränderungen in den Blättern in etwa einem halben Tag zu diagnostizieren, indem mikrowellenunterstützten Probenvorbereitung für TEM. Wir haben uns entschieden, diese Studie mit einem handelsüblichen Mikrowellen Gerät ausführen, wie es Probenvorbereitung führt fast vollautomatisch 5 im Gegensatz zu den anderen verfügbaren Geräte, bei denen viele Schritte noch manuell 6-8 durchgeführt werden und sind daher mehr Zeit und Arbeit in Anspruch. Als Probenvorbereitung vollautomatisch negative Färbung von Viruspartikeln in dem Saft der restlichen TMV-infizierten Blättern und der folgenden Untersuchung der Ultrastruktur und Größe durchgeführt wird, kann während der Fixierung und Einbettung durchgeführt werden.
Protocol
Mikrowelle Probenvorbereitung
- Vor Beginn der Probenvorbereitung muss man die automatischen Mikrowelle Gewebeprozessor für Elektronenmikroskopie (Leica EM AMW; Leica Microsystems, Wien, Österreich) Programm mit der folgenden Protokolle (Tabelle 1) für Mikrowellen unterstützte Probenvorbereitung für die TEM:
Tabelle 1. Protokoll zur Probenvorbereitung mit Mikrowellenbestrahlung. Die einzelnen Spalten zeigen (von links nach rechts):- Ampulle Reihe (Fläschchen nr.) Stellt die Reihenfolge, in der die Flasche in das Karussell von dem Prozessor geladen wird.
- Schritt des aktuellen Prozesses.
- Reagenzien in den Fläschchen.
- Dauer des aktuellen Schritt.
- Maximale Temperatur, die in dem Fläschchen erreicht wird, bevor der Mikrowellenbestrahlung wird ausgeschaltet.
- Mikrowellenbestrahlung Einstellung: Continuous = schnelle Temperaturwechsel Schrittenase, hält die eingestellte Temperatur; sanften Neigung = Temperaturanstieg, Endtemperatur am Ende erreicht; Pulsed = Rapid Temperaturerhöhung, Strom abgeschaltet, bis die Temperatur 5 ° C gesunken, Stromversorgungswiederherstellung um Temperatur zu erreichen.
- Maximale Leistung der Mikrowellenstrahlung.
- Frisch bereiten die Lösungen für die verschiedenen Schritte der Probenvorbereitung Protokoll (Agar 100 Epoxidharz siehe 1.7) beschrieben, füllen sie in die dafür vorgesehenen Flaschen gemäß der programmierten Protokoll (Tabelle 1), laden Sie die Fläschchen auf dem Karussell, dann legen Sie die Karussell in der Mikrowelle Gewebeprozessor und schließlich laden die erste Fläschchen in den Mono-Modus Kammer.
- Schneiden Sie kleine Abschnitte der Blätter (1mm 2) von Nicotiana tabacum mit Tabak-Mosaik-Virus (TMV) mit einer Rasierklinge auf einem Modellierwachs Platte in einem Rückgang von 3% Glutaraldehyd (Agar Scientific Ltd, Stansted, England) in 60 mM Sørensen infiziert Phosphatpuffer (pH 7,2) bei Raumtemperaturtur.
- Übertragen Sie die Abschnitte mit feinen Pinzette sofort in den dafür vorgesehenen Körbe mit einer Maschenweite von ca. 200 um. Stapeln Sie die Körbe auf der jeweils anderen und fügen Sie sie in den Mono-Modus Kammer. Es muss darauf geachtet, dass die Proben ständig mit Fixierlösung während des Ladens und Stapeln der Körbe so daß sie nicht austrocknen abgedeckt werden.
- Starten Sie die zuvor programmierten Mikrowelle Probenvorbereitung Protokoll zur Fixierung, Entwässerung und Infiltration.
- Während der Probenvorbereitung wird automatisch durch die Mikrowellen-Gewebe Prozessor durchgeführt mit negativer Färbung mit dem verbleibenden Pflanzenmaterial, wie in Abschnitt 3 (negative Färbung) beschrieben fort.
- Frisch zubereiten Agar 100 Epoxidharz durch Mischen der folgenden Komponenten beschrieben: fill 24g Agar 100, 16g Dodecenylbernsteinsäureanhydrid und 10 g Methyl-Nadinsäureanhydrid (für alle Komponenten zu sehen Agar Scientific Ltd, Stansted, England) in einem Plastikbecher, Wärme es40 ° C und gut mischen. Fügen Sie 1,2 g Benzyldimethylamin und gründlich mischen. Füllen Agar 100 Epoxidharz in die bezeichnete Polymerisation bildet kurz vor der Probenvorbereitung Protokoll endet (zB während des Schritts 22 in Tabelle 1).
- Nachdem das Protokoll beendet ist (nach Schritt 22 in Tabelle 1) freizugeben die gestapelten Körbe mit den Proben aus dem infiltrierten Mono-Modus-Kammer in den letzten Gefäß des Karussells. Entfernen Sie das Karussell aus dem Mikrowellengerät, entstapeln die Körbe und laden Sie sie mit feinen Pinzette in die vorgesehenen Polymerisation Formen. Es muss darauf geachtet, dass die Proben immer mit Agar 100 Epoxidharz beim Entstapeln und Laden so daß sie nicht austrocknen abgedeckt werden.
- Stapeln Sie die Polymerisation bildet sich auf der jeweils anderen. Es muss darauf geachtet, dass die Proben immer mit Agar 100 Epoxidharz beim Stapeln und Verladen so daß sie nicht austrocknen abgedeckt werden.
- Entfernen Sie zuvor verwendeten Fläschchen aus dem Karussell der Mikrowelle tissue Prozessor, laden Sie es mit den gestapelten Körbe und legen das Karussell in die Mikrowelle Gewebe Prozessor.
- Starten Sie die zuvor programmierten Polymerisation Protokoll (Tabelle 1).
- Während der Polymerisation wird automatisch durch die Mikrowelle Gewebeprozessor durchgeführt, untersuchen negativ gefärbten Netzen mit einem Transmissionselektronenmikroskop [zB Philips CM10 TEM, FEI (vormals Philips), Eindhoven, Niederlande] und führen Bildanalyse, wie in Abschnitt 3 und 4 (beschrieben negative Färbung und Bildanalyse).
- Nachdem das Protokoll abgeschlossen entfernen Sie die Polymerisation bildet sich aus dem Mono-Modus Kammer unstack die Polymerisation Formen und entfernen Sie die polymerisierten Blöcken mit den Proben. Sie sind nun bereit, geschnitten werden mit einem Mikrotom.
2. Trimmen und Schneiden
- Legen Sie einen oder mehrere Blöcke in separate Probenhalter für ultradünne Schnitte mit der Probe auf Kleben ca. 1cm aus der Halterung.
- Schneiden Sie den Block mit einer Probe Trimmer für TEM (zB Leica Reichert Ultratrim; Leica Microsystems), so dass ein Block Gesicht max. 1mm in der Länge und in der Breite 200 um was soviel Blattmaterial wie möglich erreicht (Block Gesichtsgröße möglicherweise an der Größe des Diamantmesser eingestellt werden) enthält.
- Abschnitt den Block mit einem Ultramikrotom (z. B. Reichert Leica Ultracut S; Leica Microsystems) mit einem Diamant-Messer an einem Messer Winkel von 45 ° (zB Diatome Ultra 45, Gröpl, Tulln, Österreich). Schnittdicke sollte etwa 70 bis 90 nm eingestellt werden und die Schnittgeschwindigkeit sollten etwa 1mm / s sein. Pick-up mehrere Abschnitte mit einer Formvar (Agar Scientific Ltd) beschichteten Kupfer oder Nickel 200 Quadratmeter Polygonnetz.
- Post-Flecken auf den Abschnitten auf dem Gitter mit Bleicitrat (Agar Scientific Ltd; 1.1g Bleicitrat in 42ml doppelt destilliertem Wasser und 8 ml 1N NaOH gelöst) für 5 Minuten in einer Petrischale teilweise mit NaOH gefüllt, um einen CO 2-freie erstellen Umwelt und für 15 kmnuten mit 1% Uranylacetat (Agar Scientific Ltd) in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gelöst. Waschen Sie die Gitter mit destilliertem Wasser für 1 Minute zwischen jeder post-Färbung Schritt. An der Luft trocknen Gittern in einer Gitterbox.
- Untersuchen Abschnitte mit einem Transmissionselektronenmikroskop (zB Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Niederlande).
3. Negative Färbung
- Ernte etwa 100 mg TMV-infizierten Blattmaterial und vorbereiten Rohsaft durch Homogenisierung des Materials für 2 Minuten mit einer Rasierklinge auf einem Objektträger in 100 &mgr; l 60 mM Søfrensen Phosphatpuffer (pH 7,2).
- 20 ul Übertragen des resultierenden Homogenats auf die erste Vertiefung einer Teflon beschichteten Objektträger mit vier oder mehr Vertiefungen (alternativ ist es auch möglich, das Homogenat auf einem Stück Parafilm übertragen).
- Legen Sie eine Formvar beschichtete Gitter auf der Oberseite des Homogenat mit dem Formvar (Agar Scientific Ltd) beschichtet zugewandten Seite des Tropfens und incubate es für 5 Minuten.
- Waschen Sie die Gitter 2 mal für jeweils 2 Minuten, indem Sie das Gitter auf der Oberseite zwei Tropfen 200 ul 60 mM Sørensen Phosphatpuffer (pH 7,2).
- Inkubieren des Rasters für 1 Minute mit einer frisch hergestellten 2% Phosphorwolframsäure (Agar Scientific Ltd)-Lösung in 60 mM Sörensen-Phosphatpuffer (pH 6,5).
- Entfernen Sie das Gitter und lassen Sie es trocken in einer Gitterbox Luft.
- Untersuchen Sie das Gitter mit einem Transmissionselektronenmikroskop (zB Philips CM10 TEM; FEI, Eindhoven, Niederlande). Nehmen mindestens 10 Bilder zufällig ausgewählt negativ gefärbten Virionen (mindestens 10 oder mehr Virionen sollte auf jedem Bild sichtbar) mit dem Transmissions-Elektronen-Mikroskop bei einer Vergrößerung von primären 21000X oder höher. Es muss darauf geachtet, dass alle Bilder die gleiche Vergrößerung haben.
4. Bildanalyse
- Messung der Länge und Breite von mindestens 100 zufällig ausgewählten einzelnen Viruspartikel zu den Aufnahmen entnommen ausdie negativ gefärbten Proben mit einem beliebigen Bildanalyse Software [z. B. Cell D (Olympus, Leben und Material Science Europa GmbH, Hamburg, Deutschland) mit dem Partikel-Analyse-Tool oder Optimas 6.5.1-(Media Cybernetics Inc., Bethesda, Maryland, USA)].
- Berechnen Mittelwerten und Standardabweichungen, um eine durchschnittliche Länge und Breite der Viruspartikel visualisiert durch negative Färbemethoden und TEM erreichen.
- Vergleichen Länge und ultrastrukturelle Eigenschaften (erhalten in 2,5) mit einer Größe von Viren und ultrastrukturelle Veränderungen durch Viruserkrankungen in der Literatur, um bekannt eindeutig zu identifizieren das Virus induzierten Krankheiten.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Nach mikrowellenunterstützten Probenvorbereitung typischen TMV-induzierte ultrastrukturelle Veränderungen wie große Flächen enthaltenden Virionen in paralleler Form ausgerichtet könnte mit dem Transmissionselektronenmikroskop im Cytosol von infizierten Nicotian beachtenein tabacum-Zellen (Abb. 1A). Zusätzlich ist in dem Roh-Saft von TMV-infizierten Blätter TMV-Partikel könnten als flexuous, stabförmigen Strukturen nach Negativfärbung (Abb. 1B) beobachtet werden. Bildanalyse von 100 Viruspartikel ergab eine durchschnittliche Größe für TMV von 280nm in der Länge und 17 nm in der Breite (Abb. 2). Die Ultrastruktur in TMV-infizierten Zellen und der Größe von Virionen in dieser Studie beobachtet wurde gefunden, in Übereinstimmung mit TMV-induzierte ultrastrukturelle Eigenschaften in Tabak und dem Größenbereich von TMV-Partikel bereits berichtet in der Literatur 9-15 sein.
Abbildung 1. Transmissionselektronenmikroskopaufnahmen der TMV-infizierten Blatt Zellen und Virionen. A) Das Bild zeigt die Ultrastruktur der TMV-infizierten Mesophyll Blattzellen Nicotiana tabacum nach Mikrowellen-assistierte Anlage Probenvorbereitung. Man beachte die große Fläche von parallel ausgerichteten Virionen, die im Cytosol akkumuliert.C = Chloroplasten mit Stärke (St.), M = Mitochondrium, N = Zellkern, V = Vakuole, Balken = 2 um. B) Das Bild zeigt Virionen, die durch negative Färbung in den Saft des infizierten Blättern nachgewiesen wurden.
Abbildung 2. Relative Größe der Virionen. Relative Verteilung der Länge und Breite des TMV-Partikel nach negative Färbung der Saft von infizierten Blättern, wenn sie in dem Elektronenmikroskop erschienen. Mittelwerte (mittlere Länge / Breite ± Standardabweichung) wurden aus 100 Virionen berechnet.
Discussion
Mikrowellenunterstützten Anlage Probenvorbereitung für die TEM ist nachgewiesen worden, eine schnelle und zuverlässige ultrastrukturellen Daten innerhalb von ein paar Stunden 3,4,16 liefern. Die feine strukturelle Erhaltung Organellen und Membranen mit dem in dieser Studie verwendeten erreicht war ähnlich zu konventionellen und cryofixed Proben 5,15 mit dem Vorteil einer massiven Reduktion der Probe Fixierung und Einbetten Zeit von 3 Tagen oder länger auf etwa 2 Stunden. Dies ist die schnellste Probenvorbereitung Protokoll für TEM derzeit in der Literatur. Das Verfahren in dieser Studie beschrieben, kombiniert mikrowellenunterstützten Anlage Probenvorbereitung für die TEM mit negativer Färbung Methoden, die eine eindeutige und schnelle Identifikation von TMV-induzierte ultrastrukturelle Veränderungen und der viralen Agens selbst erlaubt. TMV induzierten ultrastrukturelle Veränderungen könnten nach dem Trimmen, Schneiden und post-Färbung innerhalb von etwa 4 Stunden nach dem Beginn der Fixierung im Getriebe elek untersuchendentron Mikroskop. Verwendung des voll automatisch Probenpräparation Modus befreite den Forscher negative Färbung in der Zwischenzeit führen, um die Größe und Breite des viralen Agens zu bestimmen. So können wir feststellen, dass diese Methode eine klare und schnelle Diagnose von Pflanzenviren Krankheiten in etwa einen halben Tag, die von großer Bedeutung für die zukünftige Verwendung in der Landwirtschaft und wissenschaftliche Experimente im Anlagenbau Phytopathologie ist erlaubt. Da diese Methode könnte auch für die schnelle Diagnose von tierischen und menschlichen Erkrankungen eingesetzt werden hat es ein großes Potenzial für zukünftige Anwendungen in der medizinischen und veterinärmedizinischen Pathologie.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom österreichischen Wissenschaftsfonds (FWF, P20619 und P22988 zur BZ) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1312 | |
| Osmium tetroxide | Agar Scientific | R1022 | |
| Agar 100 resin | Agar Scientific | R1043 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Agar Scientific | R1051 | |
| Methyl nadic anhydride | Agar Scientific | R1081 | |
| Benzyl dimethylamine | Agar Scientific | R1060 | |
| Lead citrate | Agar Scientific | R1210 | |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | R1260A | |
| Phosphotungstic acid | Agar Scientific | R1213 | |
| Formvar | Agar Scientific | R1202 | |
| Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
| Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | Newer model is available | |
| Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
| Philips CM10 TEM | FEI | Newer model is available | |
| Cell D | Olympus Corporation | ||
| Optimas 6.5.1 | Media Cybernetics Inc. | Newer version is available |
References
- Bozzola, J. J., Russell, D. Electron Microscopy. , Jones and Barlett Publishers. Boston. (1999).
- Kuo, J. Processing plant tissues for ultrastructural study. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Schroeder, J. A., Gelderblom, H. R., Hauroeder, B., Schmetz, C., Milios, J., Hofstaedter, F. Microwave-assisted tissue processing for sameday EM-diagnosis of potential bioterrorism and clinical samples. Micron. 37, 577-590 (2006).
- Webster, P. Microwave-assisted processing and embedding for transmission electron microscopy. Methods in Molecular Biology, Electron Microscopy, Methods and Protocols. Kuo, J. 369, Humana Press. 47-65 (2007).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Microwave assisted rapid plant sample preparation for transmission electron microscopy. J. Microsc. 233, 258-268 (2009).
- Lería, F., Marco, R., Medina, F. J. Structural and antigenic preservation of plant samples by microwave-enhanced fixation, using dedicated hardware, minimizing heat-related effects. Micr. Res. Techniq. 65, 86-100 (2004).
- Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. A. Microwave and digital imaging technology reduce turnaround times for diagnostic electron microscopy. Ultrastruct. Pathol. 27, 187-196 (2003).
- Cavusoglu, I., Minbay, F. Z., Temel, S. G., Noyan, S. Rapid polymerisation with microwave irradiation for transmission electron microscopy. Eur. J. Morph. 39, 313-317 (2001).
- Ermolina, I., Morgana, H., Greena, N. G., Milnerb, J. J., Feldmanc, Y. Dielectric spectroscopy of tobacco mosaic virus. Biochim. Biophys. Acta. 1622, 57-63 (2003).
- Maeda, H. An atomic force microscopy study for the assembly structures of tobacco mosaic virus and their size evaluation. Langmuir. 13, 4150-4161 (1997).
- Milne, R. G. Multiplication of tobacco mosaic virus in tobacco leaf palisade cells. Virology. 28, 527-532 (1966).
- Reunov, A. V., Gnutova, I. V., Lapshina, L. A. Effect of tobacco mosaic virus strains on the ultrastructure of tobacco leaf parenchymal cells. Biol. Bull. 33, 409-415 (2006).
- Sachse, C., Chen, J. Z., Coureux, P. D., Stroupe, M. E., Fändrich, M., Grigorieff, N. High-resolution electron microscopy of helical specimens: a fresh look at tobacco mosaic virus. J. Mol. Biol. 371, 812-835 (2007).
- Smith, M. L., Lindbo, J. A., Dillard-Telm, S., Brosio, P. M., Lasnik, A. B., McCormick, A. A., Nguyen, L. V., Palmer, K. E. Modified tobacco mosaic virus particles as scaffolds for display of protein antigens for vaccine applications. Virology. 348, 475-488 (2006).
- Zechmann, B., Zellnig, G. Rapid TEM diagnosis of plant virus diseases. J. Virol. Meth. 162, 163-169 (2009).
- Giberson, R. T., Demaree, R. S. Jr Microwave processing techniques for electron microscopy: a four-hour protocol. Meth. Molec. Biol. 117, 145-158 (1999).
