Summary
electroporation في الرحم تسمح للتسليم في الجين سريعا مكانيا وزمانيا الطريقة التي تسيطر عليها في النظام العصبي المركزي النامية (CNS). نحن هنا وصف للتكيف كبيرة في بروتوكول electroporation الرحم التي يمكن استخدامها لتوفير بنيات التعبير في عدة مجالات CNS الجنينية ، بما في ذلك الدماغ البيني ، telencephalon والشبكية.
Abstract
القدرة على التعامل مع التعبير الجيني هو حجر الزاوية في علم الأجنة التجريبية الحديثة اليوم ، مما أدى إلى الكشف عن مسارات تنموية متعددة. العديد من التقنيات المعدلة وراثيا قوية وراسخة متاحة لمعالجة مستويات التعبير الجيني في الفأر ، مما يسمح للجيل كل من الخسارة وكسب نماذج من بين وظيفة. ومع ذلك ، وتوليد الجينات الماوس على حد سواء مكلفة وتستغرق وقتا. طرق بديلة لمعالجة الجينات وبالتالي كان مطلوبا على نطاق واسع. electroporation في الرحم هو وسيلة لتوصيل الجينات في الأجنة الحية الماوس 1،2 أننا تكيفت بنجاح 3،4. ويستند إلى حد كبير على نجاح في مجال تكنولوجيات electroporation البيضة التي يشيع استخدامها في الفرخ 5. باختصار ، يتم حقن الحمض النووي في البطينين مفتوحة من الدماغ النامية وتطبيق التيار الكهربائي يؤدي تشكيل مسام عابرة في أغشية الخلايا ، مما يسمح لامتصاص الحمض النووي في الخلية. في أيدينا ، يمكن electroporated بكفاءة الأجنة في وقت مبكر اليوم الجنينية (E) 11.5 ، في حين أن استهداف الشباب الأجنة تتطلب الموجات فوق الصوتية الموجهة microinjection البروتوكول ، كما هو موضح سابقا 6. على العكس ، E15.5 هو آخر مرحلة يمكننا electroporate بسهولة ، ويرجع ذلك إلى ظهور تمايز الجبهي الجداري والعظام ، مما يعوق microinjection في الدماغ. في المقابل ، يمكن الوصول إليها من خلال شبكية العين نهاية مرحلة التطور الجنيني. ويمكن جمع الأجنة في أي نقطة زمنية طوال فترة ما بعد الولادة أو الجنينية المبكرة. حقن بناء مراسل يسهل التعرف على الخلايا transfected.
حتى الآن ، في الرحم وقد electroporation الأكثر استخداما لتحليل تطور القشرة المخية الحديثة 1،2،3،4. واستهدفت المزيد من الدراسات الأخيرة الجنينية 7،8،9 الشبكية والمهاد 10،11،12. هنا ، فإننا نقدم في تعديل بروتوكول electroporation الرحم التي يمكن تكييفها بسهولة لاستهداف مجالات مختلفة من الجهاز العصبي المركزي الجنينية. ونحن نقدم أدلة على أن باستخدام هذه التقنية ، فإننا يمكن أن تستهدف telencephalon الجنينية ، والدماغ البيني الشبكية. وتعرض نتائج ممثلة ، والتي تبين لأول مرة استخدام هذا الأسلوب لإدخال الحمض النووي في بنيات التعبير البطينين الوحشي ، مما يسمح لنا لرصد نضوج السلف ، والتمايز والهجرة في telencephalon الجنينية. نعرض أيضا أنه يمكن استخدام هذه التقنية لاستهداف الحمض النووي إلى الأراضي المحيطة الدماغ البيني البطين الثالث 3 ، والسماح للطرق الهجرة من الخلايا العصبية في التفريق نوى الدماغ البيني ليتم رصدها. أخيرا ، وتبين لنا أن استخدام micromanipulators يسمح لنا أن نقدم بدقة يبني الحمض النووي في المناطق المستهدفة الصغيرة ، بما في ذلك الفضاء تحت الشبكية ، مما يسمح لنا لتحليل آثار التلاعب الجيني على التنمية في شبكية العين.
Protocol
1. انشاء
- انشاء منطقة العمليات الجراحية كما هو مبين في الشكل. 1A ، أ ". المكونات الرئيسية لمجموعة المتابعة تتضمن Femtojet إيبندورف microinjector ، Narishige micromanipulator مع حامل الإبرة ، steromicroscope ايكا ، ونظام الألياف البصرية الإضاءة ، ECM 830 Electroporation الموجة ساحة النظام مع أقطاب كهربائية ، وسادة التدفئة والمرذاذ مخدر لisoflurane.
- تنظيف جميع الأدوات مع نظافة بالموجات فوق الصوتية باستخدام Bransonic Metriclean2 قليلة حل لرغوة sonicating الأدوات الجراحية. تعقيم أدوات التعقيم من قبل. ثم يتم الاحتفاظ أدوات معقمة في Germex.
- إعداد المحاقن المعقمة مع المالحة الدافئة والعقيمة Lactated حل رينغر.
2. خدر
- حيوان صغير داخل المكان (12cm س 20cm) غرفة التخدير. استخدام المرذاذ ، وتقديم مخدر isoflurane 5 ٪ والأكسجين في 1L/min (الشكل 1A ، أ "). على وجه الخصوص ، من المهم جمع العادم isoflurane باستخدام نظام المسح.
- إزالة الحيوان من الغرفة عندما يصبح التنفس العميق والمنتظم. وتستخدم معسر إصبع والاختبارات وميض العين منعكس لضمان التخدير الكامل.
- مكان الماوس حاملا على ظهره فوق لوحة التدفئة (37 درجة مئوية). لأول مرة يتم تعقيمها سادة التدفئة بواسطة المسح مع الايثانول 70 ٪ ، وتتناول ثم مع تعقيمها ، شاش lintless. استخدام أنبوب التنفس الاصطناعي وجهاز قناع لتسليم isoflurane (2.25 ٪) خلال عملية جراحية.
- حقن البوبرينورفين (0.1mg/kg وزن الجسم) تحت الجلد تحت الجلد في مؤخر العنق.
- مراقبة الحيوانات في جميع أنحاء جراحة للتنفس العميق ومنتظمة. وينبغي أن الحيوان لا يلهث ، أو بسطحية التنفس بسرعة. قد الضحلة ، وسرعة التنفس قد يكون علامة على تخدير الضوء ، وينبغي زيادة تدفق isoflurane. إذا كان الحيوان يبدأ اللحظات ، والحد من تدفق isoflurane. في حالة توقف التنفس ، إيقاف isoflurane ، وزيادة تدفق الأوكسجين حتى تتعافى الحيوانات. إعادة تشغيل isoflurane بتكلفة أقل تركيز.
3. التحضير لجراحة الحيوان
- الشريط الأمامية من الحيوان الى منصة التدفئة والاختيار مرة أخرى للرد من قبل التراجع معسر القدم الخلفية مع ملقط حادة.
- به مسحة القطن المعقمة ذات الرؤوس ، وانتشار طبقة سميكة من كريم مزيل الشعر (أي ناير) على البطن. السكتات الدماغية في الشركة ، وضمان مغلفة تماما underfur. يغادر يوم لمدة متوسطها ثلاث دقائق ، والتحقق بشكل متقطع مع مسحة معقمة نظيفة لإزالة الشعر. الرطب وسادة شاش معقم مع الماء المعقم ومسح البطن حتى تختفي كل آثار. كرر بالكلورهيكسيدين (أي Stanhexidine) الجلد أنظف والمزيد من المياه. الجافة في البطن مع شاش نظيفة ومعقمة.
- موقع تعقيم الجرح مع الكلورهيكسيدين (أي Stanhexidine) ، يليه المزيد من المياه المعقمة. الجافة في البطن مع شاش نظيفة ومعقمة. كرر هذه الخطوة باستخدام الايثانول 70 ٪ والعذبة ، ومسحة القطن المعقمة.
- وضع شاش معقم على البطن مع فتحة في الوسط الذي يتم من خلاله سحب قرون الرحم أثناء الجراحة.
4. شق والتعرض لقرون الرحم
- لفضح أبواق الرحم ، أولا تحديد موقع ألبا الخط كخط باهتة تحت الجلد في خط الوسط. باستخدام الملقط ، وسحب الجلد بعيدا عن جدار البطن وقطع صغيرة ، شق مباشرة من أسفل منتصف البطن مع مقص الجلد (حوالي 1 سم في الطول).
- باستخدام الملقط المنحنية ومقص ، وتكرار هذه العملية مع البريتوني.
- مكان شاش معقم مع فتحة عمودية صغيرة على شق ويضعف مع حرارة المياه المالحة عقيمة.
- ملقط الشريحة في شق وحدد موقع الرحم. عقد شق مفتوحة مع ملقط حين إزالة قرون الرحم.
- فهم دقيق بين الأجنة في الرحم مرئية الأولى والثانية وسحب على الأجنة والشاش. إزالة كلا الجانبين من قرون الرحم ، مما يضع على وشاش معقم ، وحساب عدد الأجنة ، مشيرا إلى أي resorptions أو "غير صحية" الأجنة (على سبيل المثال أصغر حجم الجسم). الرطب القرون الرحم مع المياه المالحة وتعود بعناية نصف الرحم في البطن.
5. حقن الحمض النووي في البطينات
- تعد الإبر الجراحية مع بولير Micropipette سوتر يلهب به micropipettes البورسليكات مع الشعيرات الدموية (البرنامج : الحرارة = 750 ، سحب = 30 ، فيل = 90 ، الوقت = 150). باستخدام شفرة مشرط معقم ، وحلق رأس الإبرة برفق خارج بزاوية 45 درجة.
- لتحميل الإبرة ، يتم سحبها باستور ماصات إلى تضييق القطر تحت اللهب. ويعلق قطعة الفم ماصة للتحميل لوضع ~ 10 ميكرولتر من الحمض النووي الذيفان الداخلي خالية 3mg/ml مختلطة مع 0.01 ٪ الميثيل الخضراء (ملاحظة : صبغة خضراء الميثيل يسمح حقن حمض النووي للتصور). هي التي شنت ثم شغل الإبرة على الوقوف micromanipulator وتعلق على حاقن Femtojet.
- بدءا من جنين الأقرب إلى المبيض ، ملقط دائريةوتستخدم لتحويل بلطف الجنين داخل الساقط بحيث يتم وضعه "وجها إلى الأمام" ، والسماح لحقن تحدث في منقاري إلى الاتجاه الذيلية. وتستخدم الألياف الضوئية مصدر الضوء لإضاءة للمساعدة في تصور خط الوسط من المخ الجنينية ، وهو محاط البطينين الجانبي كبيرة في مناطق منقاري (الشكل 1B ، B ').
- يقام الجنين في موقف باستخدام الملقط دائرية. يتم وضع إبرة فوق الرحم بحيث زاوية الدخول في الدماغ هو ما يقرب من 45 درجة. باستخدام micromanipulator ، والحركة السريعة والمطردة ، يتم إدخال إبرة غيض من خلال جدار الرحم وإلى البطين الجانبي للجنين. وتوجه نحو حقن البطينين الوحشي ، البطين 3 أو في الفضاء تحت الشبكية لاستهداف telencephalon ، الدماغ البيني والشبكية ، على التوالي. علما بأن حويصلات المخ الجنينية مفتوحة في المراحل الجنينية المبكرة مثل الحمض النووي التي تحقن في البطينات الجانبية سوف تتدفق إلى البطين الثالث 3.
- اضغط على دواسة القدم لحقن الذيفان الداخلي خال من الحمض النووي (1-3 ميكرولتر) باستخدام Femtojet إيبندورف microinjector. إن الحقن الناجح هو تصور بسهولة عن طريق نشر الصبغة الخضراء في جميع أنحاء الميثيل البطينين المخ الجنينية. ثم يتم إزالة الإبرة ببطء عن طريق الرسم احتياطية لتفادي الكسر.
6. Electroporation
- يتم وضع الجنين حقن (لا يزال داخل الرحم) على شاش معقم المغطي بطن الأم ورطبة تماما مع درجة حرارة المياه المالحة. يرجى ملاحظة ** إضافة المالحة إلى السطح غشاء أمر ضروري للسماح بمرور كفاءة تيار الكهربائي.
- يتم استخدام أقطاب GenePaddle إلى قبضة الرحم بعد حقن الحمض النووي. يتم تسليم خمسة نبضات كهربائية مربع من MS - 50V 40 و 50 بمعدل نبضة واحدة في الثانية باستخدام نظام ECM8300 electroporation BTX (الشكل 1C ، C ').
- تغطية حقن الجنين / electroporated مع الشاش الرطب واقية ويواصل الجنين المقبل.
- عند الانتهاء من الحقن / electroporation جميع الأجنة المرغوب فيه ، ودفع بعناية قرون الرحم مرة أخرى في البطن (الشكل 1D).
- إزالة بعناية القرن الأخرى الرحم وتبدأ مرة أخرى مع الجنين الأقرب إلى المبيض.
7. خياطة وتدبيس
- مرة واحدة كل الأجنة إلى داخل الرحم ، إضافة إلى تجويف البطن ~ مل 2-3 المالحة الدافئة.
- لإغلاق الجرح ، تبدأ من خلال ازالة الشاش على البطن ، وتحديد جوانب البريتوني. يبدأ خياطة البريتوني باستخدام خط الحرير الأسود مضفر. فمن غير المستحسن استخدام الخيط للامتصاص لهذا الإجراء كما هو الحال عادة أضعف وربما يؤدي إلى ما بعد العمليات الجراحية النزف والعدوى. مرساة على خط البريتوني الأقرب إلى القص ، والشروع في غرزة بعيدا عن الربط. ضمان أن جميع الخيوط هي ضيقة ، وأنه لم يكن هناك أجهزة الكامنة وراء الجلد أو عن غير قصد في مخيط البريتوني. مقطع خط الدرز المتبقية وتجاهل.
- مغلق سحب الجلد عبر خط الدرز بالملقط. 9 ملم باستخدام ريفلكس ™ الجلد الدبابيس الإغلاق ، مشبك الجلد فوق الجرح ، مع الحرص على عدم المحصول تحت خط الدرز ، أو سحب الجلد بشكل محكم جدا. الأسلوب المفضل للاحتفاظ الجلد وحتى بعيدا من الجسم مع ملقط ، ويأتي في بزاوية 90 درجة مع الأداة الأساسية. تستمر حتى يتم إغلاق الجرح (ما يقرب من ثلاثة من السلع الاساسية). الانتهاء مرة واحدة ، وضمان المواد الغذائية شحيحة بالضغط بلطف مع أداة خياطة (1D الشكل ').
8. العناية بعد الجراحة
- لرصد المخدر الانتعاش ، وتحويل الإناث على بطنها وبدوره قبالة isoflurane. حفظ مواجهة الحيوان داخل جهاز التنفس ، وبالتالي الأكسجين تصل إلى 3 ٪ للمساعدة في التعافي من التخدير. يجب وضع الحيوان على شاش جافة ونظيفة على الجزء العلوي من لوحة التدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم.
- في حين أن الحيوان هو يترنح ، وضخ 2 مل محلول رينغر تحت الجلد تحت الجلد رقبة الحيوان.
- تواصل عقد الحيواني في تدفق الأكسجين لعدة دقائق وقطع من الشاش في الاحتباس الحراري من أجل الحيوان حرض. ينبغي التقيد طفرات قصيرة من الحركة من الحيوان لأنه يعود إلى نمط التنفس الطبيعي. مراقبة لعدة دقائق حتى الحيوان يبدو واعيا ويقظا.
- رذاذ بطن الأنثى برذاذ جنتاميسين والتفاف الحيوانية في شاش معقم.
- نقل الحيوانات في قفص العقيمة مع الفراش تعقيمها والإسكان من الورق المقوى.
- وينبغي تنظيفها زجاجات المياه ، وتعقيم مملوءة بالماء المعقم. إلى 500 مليلتر من الماء إضافة 2 مل من المضادات الحيوية سلفاميثازين (25 ٪ أسهم).
- إدارة 0.05 ملغم / كغم البوبرينورفين تحت الجلد صباح اليوم التالي للجراحة.
- رصد الإناث عن كثب في أول 24 ساعة بعد الجراحة. إذا كان يتم الاحتفاظ الحيوانات أطول من 24 ساعة ، يتم نقل الإناث إلى STER جديدةأقفاص إيل يوم 2.
9. ممثل النتائج
اللحاء الجديد
القشرة المخية الحديثة هي المنطقة في الجهاز العصبي المركزي هي المسؤولة عن معالجة الحسية والبصرية والأداء العالي والمعرفية. وهي تتألف من الخلايا العصبية والإسقاط glutamatergic interneurons GABAergic التي هي مستمدة من telencephalon الظهرية والبطنية ، على التوالي. للتصدي للأدوار جينات مختلفة في التنمية القشرة المخية الحديثة ، ونحن نستخدم في electroporation الرحم إما misexpress أو كتلة التعبير (أي ، من خلال استخدام البنى shRNA) من الجينات المختلفة في telencephalon الظهرية أو البطنية 1،3،4. لmisexpress الجينات في telencephalon الجنينية ، ونحن نستخدم التعبير متجه bicistronic (pCIG2) ، تحتوي على CMV - βactin المروج ، ومحسن داخلي دخول موقع الريبوسوم (IRES) محسنة ببروتين أخضر (EGFP ؛ في pCIG2) الكاسيت ، مما يتيح transfected ليتم الكشف عن الخلايا epifluorescence (الشكل 2A - C). استخدمنا هذه التكنولوجيا لإدخال بنيات التعبير في telencephalon من E11.5 لE15.5 (البيانات المعروضة في E12.5 ؛ الشكل رقم 2). عن طريق السماح للأجنة لتطوير عدة أيام بعد electroporation ، ونحن قادرون على تتبع التمايز وهجرة GFP المسمى الأسلاف. كعائدات التمايز ، 3 أيام بعد electroporation GFP + الخلايا تفرق وتهاجر من منطقة البطين (VZ) ، منطقة subventricular (svz) ومنطقة متوسطة (عز) والى لوحة القشرية (CP ؛ الشكل 2C). إذا تم تحليلها في أدمغة electroporated E12.5 بعد 24 ساعة ، ويمكننا رصد الأحداث في وقت سابق من النضج السلف والهجرة عن طريق وضع العلامات العصبية بالتعاون مع علامات الأسلاف القمي (أي Pax6 ؛ الشكل 2A) ، أسلاف القاعدية (أي Tbr2 ؛ . الشكل 2B) والخلايا العصبية تالية للتفتل القشرة المخية الحديثة (أي Tbr1 ؛ الشكل 2C).
الدماغ البيني
تحت المهاد يكمن في قاعدة البطنية من وظائف الجهاز العصبي المركزي كبوابة بين الغدد الصماء والجهاز العصبي المستقل. خلال التنمية ، والنوى المتعددة التي تشكل المهاد ناضجة يفرق من منطقة السلف المشترك الذي خطوط المنطقة البطنية ، أكثر من الدماغ البيني الجنينية. حاليا ، ولا يزال الغموض يكتنف المسارات الجزيئية التي تنظم السلف تكاثر الخلايا ، والتمايز العصبية وتشكيل نواة طائي. كنا في electroporation الرحم لاستهداف الصحفيين التعبير الجيني للأجنة من خلال حقن الدماغ البيني الحمض النووي في البطين الثالث 3 من embryos.We E12 ثم أعقب توزيع GFP في تمييز الخلايا العصبية في E14. مع هذه المنهجية ، واستهدفت نجحنا في التعبير GFP إلى المهاد ، قبل المهاد وتحت المهاد (الشكل 3A). تحليل المقاطع الاكليلية يكشف اننا استهدفنا بنجاح التعبير GFP إلى الخلايا التي تبطن السلف منطقة البطين للبطين الثالث (3) والخلايا العصبية التي تهاجر إلى منطقة الوشاح لتشكيل نواة (الشكل 3B)
شبكية العين
الشبكية هي الطبقة العصبية للعين ، وهو مسؤول عن تحويل فوتونات الضوء الى نبضات كهربائية تنتقل إلى الدماغ. يتطور بوصفه outpocketing من الدماغ البيني الجنينية ، وبالتالي ، مشتق من الأنبوب العصبي. العصبية في الشبكية يطور من المقصورة السلف قمية التي تقع بالقرب من الفضاء تحت الشبكية ، والذي يفصل تجويف العين من اللحمة المتوسطة الرأس. استهداف البنى أسلاف الحمض النووي لشبكية العين ويتطلب ذلك أن يتم إجراء الحقن في المنطقة المستهدفة الصغيرة. micromanipulators به ، فقد تمكنا من الهدف بنجاح في هذه المنطقة الصغيرة من الأجنة لE13.5 E15.5 (كما هو موضح هو E15.5 electroporations من pCIC مع الصحافي mCherry ؛ الشكل 4). إذا كان يتم فحص الشبكية electroporated 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن ، فإننا نلاحظ أن تقع معظم الخلايا + mCherry في طبقة neuroblast الخارجي (onbl) ، حيث يوجد تقسيم الأسلاف ، وليس في طبقة الخلايا العقدية للشبكية (GCL ؛ أقحم صورة) حيث الخلايا تالية للتفتل توطين.
الشكل 1. مقدمة في الرحم electroporation انشاء ومنهجية : (أ) المكونات الرئيسية لانشاء الجراحية تشمل Femtojet إيبندورف microinjector (1) ، Narishige micromanipulator مع حامل الإبرة (2) ، لايكا steromicroscope (3) ، والألياف البصرية الإضاءة نظام (4) ، 830 ECM Electroporation الموجة ساحة النظام مع أقطاب (5) وسادة التدفئة (6). (A ') والحيوان هو تخدير للاستخدام المرذاذ مخدر isoflurane. (B ، 'B) لفترة وجيزة ، وبعد التخدير ، ويتعرض أبواق الرحم ويتم حقن الحمض النووي مختلطة مع الاخضر سريعا الى الحويصلات المخ الجنينية. إن الحقن الناجح هو تصور من خلال تتبع من الصبغة الخضراء سريع (B '). (C ، C ') بعد أن يتم حقن الحمض النووي بنجاح ، يتم وضع الأقطاب مجداف على جانبي الرحم ، positioning الجنين بحيث يتم سحب الحمض النووي نحو القطب الموجب في المنطقة من المخ في الاختيار. (D ، D ') عندما يتم حقن جميع الأجنة المطلوب ، ويدفع الرحم مرة أخرى في البطن (D) ، وخياطة الغشاء البريتوني ، ويتم تدبيس الجلد (D'). وسمح للنساء الحوامل لاسترداد ويتم جمعها من الجراء electroporated عند نقاط الوقت المطلوب.
الشكل 2. المثال ممثل electroporation الدماغ الانتهائي الظهرية (AC) صورة مجهرية لمقطع الإكليلي خلال telencephalon E13.5 الظهرية electroporated في E12.5 مع pCIG2. ويتم تحليل Electroporated GFP + الخلايا التعبير عنها من علامات الأسلاف القمي (Pax6 + ، أحمر ، A) ، أسلاف القاعدية (Tbr2 + ، أحمر ، B) والخلايا العصبية تالية للتفتل (Tbr1 + ، أحمر ، C). حزب المحافظين ، لوحة القشرية ؛ svz ، منطقة subventricular ، VZ ؛ منطقة البطين.
الشكل 3. ممثل مثال electroporation الدماغ البيني (أ) عرض بطني من الدماغ E14 الذي تم في electroporated E12 مع pCIG2. GFP epifluorescence مرئيا في المهاد ، قبل المهاد وتحت المهاد ، مما يدل على انتشار pCIG2 microinjected البلازميد في جميع أنحاء البطين الثالث 3. (ب) صورة مجهرية من الباب الاكليلية من خلال الدماغ electroporated ، والتي تبين هجرة GFP + الخلايا خارج منطقة البطين والى منطقة الوشاح ، حيث ستشكل نواة طائي. 3V ، البطين الثالث ، T ، المهاد ، HY ، تحت المهاد ، MZ ، عباءة المنطقة ؛ أبيب ، telencephalon ؛ PreT ، prethalamus ؛ VZ ، منطقة البطين.
الشكل 4. المثال ممثل electroporation الشبكية. القسم الاكليل من خلال العين E16.5 electroporated مع pCIC في E15.5 تبين تراكم الخلايا + mCherry في طبقة neuroblast الخارجي وليس في الخلايا + Brn3b العقدة الشبكية في طبقة الخلايا العقدية. وأقحم هي صورة تضخم أعلى من منطقة محاصر. GCL ، خلية العقدة الشبكية طبقة ؛ جنيه ، العدسة ؛ onbl ، طبقة neuroblast الخارجي ؛ اعادة الشبكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن أن تستخدم في الرحم electroporation لتحليل مجموعة واسعة من العمليات التنموية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الجينات مراسل ترنسفكأيشن مثل GFP ، الفوسفاتيز القلوية mCherry أو لإجراء التجارب وتتبع نسب الهجرة العصبية. بدلا من ذلك ، يمكن لجنة المساواة العرقية recombinase أعرب عابر للقضاء انتقائي في أليل floxed / مكانيا وزمانيا أو الطريقة التي تسيطر عليها. وعلاوة على ذلك ، يمكن electroporated shRNA أو يبني السلبية المسيطرة على استهداف ضربة قاضية وظيفة الجين. أخيرا ، يمكن استخدام overexpression المستهدفة أو misexpression من الجينات الرئيسية في كل نوع البرية و / أو خطوط الماوس متحولة وراثيا لدراسة القرارات مصير الخلية. الإنتاجية العالية لهذا الفحص ضروري لأنها تسمح لاختبار العديد من العوامل معا في وقت قصير جدا. واحد من الحذر هو أن هذا الإجراء لا يسبب تغييرات في التعبير الجيني في الخلايا التي تبطن موقع دخول الإبرة (أي إصابة للاستجابة الجينات upregulated في الجرح ؛ كما لوحظ من قبلنا وغيرها 13). ينصح بالتالي للتركيز على الخلايا electroporated خارج موقع الجرح. بالإضافة إلى ذلك ، معدلات البقاء على قيد الحياة الجنينية منخفضة عندما تعلم الاولى من هذا الاسلوب ولكن بسرعة لارتفاع 95 ٪> مع الممارسة. حتى الآن ، وقد استخدمنا تقنيات electroporation بنجاح في الرحم لتحديد الجينات التي ينظمها عوامل النسخ proneural bHLH في telencephalon 4. ونحن ايضا التحقق من صحة استخدام هذه التقنية لتحليل عناصر التنظيم الدماغ الانتهائي رابطة الدول المستقلة 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر إيفا Hadzimova ، بيار مطر وكوفاش كريستوفر لعملهم في تأسيس الأولي في مجال تكنولوجيا electroporation الرحم في المختبر CS. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR) منحة (MOP 44094) وCIHR / مؤسسة مكافحة العمى (FFB) الناشئة فريق غرانت (00933-000) لخدمات العملاء والأطفال ألبرتا مستشفى بحوث المنحة لمؤسسة DMK. كان مدعوما من قبل RD الأمل CIHR المنح الدراسية وكندا ، ومعتمد من قبل الصليب الأحمر دراسية لFFB وكان مدعوما من قبل LML منحة تدريبية في علم الوراثة CIHR وتنمية الطفل.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine scissors | Surgical Tools | Fine Science Tools | 14078-10 | |
| Iris scissors, curved | Surgical Tools | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder | Surgical Tools | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Ring forceps, 9mm | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Eye dressing Forcep | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Dumont #7 DMX Forcep | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Dumont #5 DMX Forcep | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Tissue forcep-Adson | Surgical Tools | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Reflex Clip Applier | Surgical Tools | World Precision Instruments, Inc. | 500343 | |
| Perforated Spoon, 15 mm diameter | Surgical Tools | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Autoclip Remover | Surgical Tools | Mikron | 427637 | |
| Silk Black Braided Suture | Surgical Tools | Ethicon Inc. | K871 | |
| Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips | Surgical Tools | World Precision Instruments, Inc. | 500346 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation System | Instruments | VWR international | 58018-004 | |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode | Instruments | Protech International, Inc. | CUY650P5 | |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode | Instruments | Protech International, Inc. | CUY650P7 | |
| Eppendorf Femtojet Microinjector | Instruments | VWR international | CA62111-488 | |
| Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector | Instruments | VWR international | CAACCESS (misc.) | |
| Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH | Instruments | VWR international | CA33995-534CPN-952-118 | |
| Sutter P97 Micropipet Puller | Instruments | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Micropipettes -– Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length | Instruments | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | |
| 3-Axis Coarse Manipulator | Instruments | Carl Zeiss, Inc. | M-152 | |
| Magnetic Holding Device for micromanipulator | Instruments | World Precision Instruments, Inc. | M1 | |
| Steel Base Plate for micromanipulator | Instruments | World Precision Instruments, Inc. | 5052 | |
| Micropipette Holder | Instruments | World Precision Instruments, Inc. | MPH3 | |
| Micropipette Handle | Instruments | World Precision Instruments, Inc. | 5444 | |
| Stereomicroscope | Instruments | Leica Microsystems | MZ6 | |
| Vaporizer for isoflurane anesthetic | Instruments | Porter Instruments Company | MODEL 100-F | |
| Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools | Surgical Reagents | Metrex Research Corporation | 10-8100 | |
| Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing | Surgical Reagents | Sigma-Aldrich | G1264 | |
| Germex for sterilizing surgical tools | Surgical Reagents | Vétoquinol | DIN# 00141569 | |
| BNP ophthalmic ointment | Surgical Reagents | Vétoquinol | DIN# 00516414 | |
| Nair® | Surgical Reagents | Church & Dwight Co. | commercially available | |
| Stanhexidine 4% w/v skin cleaner | Surgical Reagents | Omega Laboratories Inc. | 01938983 | |
| Buprenorphine (Temgesic) analgesic | Surgical Reagents | Merck & Co. | 531-535 | |
| Sulpha "25" sulphamethazine oral antibiotic | Surgical Reagents | Professional Veterinary Laboratories | DIN# 00308218 | |
| Lactated Ringer Solution | Surgical Reagents | Baxter Internationl Inc. | DIN# 0061085 | |
| Saline -– 0.9% sodium chloride | Surgical Reagents | B. Braun Medical | DIN# 01924303 | |
| Inhalation Anesthetic -– Isoflurane USP | Surgical Reagents | Pharmaceutical Partners of Canada | DIN# 02237518 | |
| Fast Green FCF | Surgical Reagents | Sigma-Aldrich | F7252 |
References
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Langevin, L. M. Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236. , 1273-1286 (2007).
- Mattar, P. Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity. Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Vue, T. Y. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
- Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).
- Buffo, A. Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).
