Summary
एक उच्च throughput, प्रोटीन चिकित्सा के उत्पादन के लिए विनिर्माण सेल लाइन के विकास के लिए स्वचालित मंच वर्णित है. बी.डी. FACS Aria सेल सॉर्टर का कार्यान्वयन, CloneSelect Imager और TECAN स्वतंत्रता EVO तरल हैंडलिंग प्रणाली सेल लाइन के विकास में काफी वृद्धि हुई सुधार सेल लाइन गुणवत्ता और उच्च reproducibility के साथ प्रसंस्करण क्षमता का प्रदर्शन किया है.
Protocol
1. मेजबान सेल अभिकर्मक
- 2 बीज x 6 चो DXB11 T75 Corning सेल संस्कृति फ्लास्क 15 मिलीलीटर मध्यम विकास में (MEMa (Gibco, सूची संख्या 12571) के nucleotides और nucleosides के साथ 10% γ विकिरणित विशेषता भ्रूण गोजातीय सीरम (cFBS) (HyClone के साथ पूरक में कोशिकाओं 10, सूची SH30071.03 संख्या) और 10 एमएल / 45% ग्लूकोज समाधान (सिग्मा, सूची G8769 संख्या)) अभिकर्मक के एक दिन पहले के एल.
- अभिकर्मक के समय में, के रूप में अभिकर्मक परिसरों तैयार:
- मध्यम विकास की 800 μl में एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में सीरम के बिना 8 μg डीएनए पतला. धीरे मिश्रण.
- मध्यम विकास की 800 μl में एक polystyrene ट्यूब में सीरम के बिना 40 μl Lipofectamine ™ (18,324,012 Invitrogen) पतला.
- पतला पतला Lipofectamine ™ करने के लिए डीएनए जोड़ें. धीरे मिक्स और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
- कक्षों से T75 में मध्यम विकास और निकालें और सीरम के बिना मध्यम विकास के 6.4 मिलीलीटर के साथ की जगह. फ्लास्क अभिकर्मक परिसरों के 1.6 मिलीलीटर जोड़ें. थाली कमाल धीरे मिलाएं.
- सीओ 2 इनक्यूबेटर में 6 घंटे के लिए 37 कोशिकाओं ° सी सेते हैं.
- फ्लास्क और 37 पर सेते ° सी सीओ 2 रातोंरात इनक्यूबेटर में करने के लिए मध्यम विकास के 8 मिलीलीटर जोड़ें.
- आकांक्षा से मध्यम निकालें और कुप्पी ताजा मध्यम विकास को जोड़ने. सीओ 2 रातोंरात इनक्यूबेटर में 37 कोशिकाओं ° सी सेते हैं.
- चयन माध्यम से मध्यम विकास बदलें (nucleotides या nucleosides बिना MEMa मध्यम (Gibco, सूची संख्या 12561) 10% γ विकिरणित dialyzed भ्रूण गोजातीय सीरम (dFBS) (HyClone, कैटलॉग SH30079.03 संख्या) और 10 एमएल / एल 45 के साथ पूरक % ग्लूकोज समाधान (सिग्मा, सूची G8769 संख्या)).
- सीओ 2 इनक्यूबेटर में 2-3 सप्ताह के लिए 37 कोशिकाओं ° सी सेते हैं .
2. प्रवाह cytometry सक्रिय सेल छँटाई के द्वारा क्लोनिंग
- 5 मिनट के लिए 4 पर फ्लास्क और 800 rpm पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं से बेदखल डिग्री सेल्सियस
- चयन 2% गोजातीय सीरम albumin और fluorescently लेबल 1:20 कमजोर पड़ने पर विरोधी मानव आईजीजी एंटीबॉडी के साथ पूरक मध्यम में कोशिकाओं Resuspend.
- 15-30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते और तो ठंड पीबीएस के साथ दो बार धोने. एक polypropylene ट्यूब में पीबीएस 1x कोशिकाओं में Resuspend.
- एक बी.डी. FACSAria ™ पर सड़न रोकनेवाला तरह के लिए तैयार. 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति थाली है कि प्रत्येक कुएं में 200 μl चयन मध्यम तैयार.
- Aseptically कोशिकाओं के साथ ट्यूब लोड और बी.डी. FACSAria ™ पर विश्लेषण, दाग और बेदाग कोशिकाओं के लिए परिणामों का रिकॉर्ड, क्रमशः.
- 96 अच्छी तरह से थाली (ओं) में वांछित प्रतिदीप्ति धुंधला प्रोफ़ाइल के एकल कक्षों तरह फाटकों और सेटिंग्स सेट.
- ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं पहले आगे तितर बितर बनाम ओर तितर बितर पर आधारित विश्लेषण कर रहे हैं. जीवित कोशिकाओं के लिए एक गेट आगे तितर बितर, जो एक कोशिका का आकार और ओर तितर बितर, जो एक सेल जटिलता या granularity के उपाय उपायों पर आधारित बनाया है.
- कोशिकाओं है कि इस फाटक के भीतर गिर जाते हैं तो पीई धुंधला के लिए जांच कर रहे हैं. पीई नकारात्मक फाटक बेदाग ट्रांसफ़ेक्ट कक्षों या दाग मेजबान कोशिकाओं के लिए सेट कर दिया जाता है. के रूप में दाग ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं FACS द्वारा जांच कर रहे हैं, "उच्च पीई" गेट तो सभी कोशिकाओं है कि पीई धुंधला के लिए सकारात्मक रहे हैं के शीर्ष 5% धरना चित्रित है.
- दो सप्ताह के लिए 37 ° सी इनक्यूबेटर में प्लेटें सेते हैं.
3. कॉलोनी के गठन के CloneSelect ™ Imager द्वारा प्रलेखन
दस्तावेज़ CloneSelect Imager ™ पर 0 दिन, 3 दिन, 7 छँटाई FACS के बाद और 13 दिन पर दिन में 96 अच्छी तरह प्लेटें में कॉलोनी गठन. छवि प्रलेखन किसी एकल कक्ष से प्राप्त क्लोन के चयन को सुनिश्चित करेगा. इस दस्तावेज में एक महत्वपूर्ण कदम नाभीय विमान दिन 0 माप के लिए सही ढंग से समायोजित हो रही है, क्योंकि वहाँ केवल उस बिंदु पर एक अच्छी तरह से में सेल है. यह बहुत महत्वपूर्ण है कि उन एकल कक्षों के छवियों को ध्यान में हैं और उन पर ध्यान केंद्रित समायोजित करने का प्रयास भ्रामक पर सबसे अच्छा किया जा सकता है. फोकल हवाई जहाज़ प्लेटों के ब्रांडों के बीच काफी भिन्न है और संभवतः बहुत से एक ही ब्रांड की बहुत भी कर सकते हैं. इस प्रकार एक पूर्व निर्धारित नाभीय विमान के लिए इस्तेमाल किया जा जरूरत है. यह परीक्षण सूक्ष्म मोती या उच्च घनत्व ही इस्तेमाल किया जा रहा है बहुत से प्लेटों पर जमा कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करके पूरा किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, एक ही बहुत से पूरी तरह से बड़े हो प्लेटें इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. FACS छँटाई के बाद, यह भी महत्वपूर्ण है कोशिकाओं को 2 घंटे की एक न्यूनतम के लिए इमेजिंग के लिए पहले बसने के लिए, ताकि वे 'तय' थाली पर स्थिति में हो जाएगा.
4. स्क्रीनिंग और अत्यधिक उत्पादक क्लोनों का चयन
- दस्तावेज़ प्राप्त 96 अच्छी तरह से परख प्लेटें में नमूना स्थिति.
- 20 96 अच्छी तरह से परख प्लेटें में μl (पतला यदि आवश्यक) द्वारा TECAN स्वतंत्रता EVO ® सतह पर तैरनेवाला तरल हैंडलिंग प्रणाली के स्थानांतरण aliquots. यह लचीला है और सक्षम रोबोटआईसी मंच इस और अन्य स्वचालित सेल संस्कृति का काम के लिए अनुकूलित किया गया है. विशेष कार्यक्रम के लिए सबसे अच्छा उपयोग और सेल लाइन के विकास के लिए स्वतंत्रता EVO रोबोट क्षमताओं को बढ़ाने के लिए लिखे गए थे. इस का एक उदाहरण TECAN सेटिंग है एकल कालोनियों के साथ कुओं के नमूने लिए CloneSelect ™ Imager डेटा की व्याख्या करने के लिए. अन्य कार्यक्रमों के लिए अतिरिक्त सेल संस्कृति जैसे कार्य करने के उपयुक्त dilutions ली गई नमूनों की, की व्याख्या करने के लिए, सूची और नमूना मैन्युअल रूप से चिह्नित प्लेटें बनाने के यदि आवश्यक हो, करने के लिए उच्च उत्पादन क्लोन पैमाने पर करने के लिए आवश्यक थे, आदि इन कार्यक्रमों के कई आसानी से किया जा सकता है है 384 अच्छी तरह के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मूल 96 अच्छी तरह प्रारूप प्लेटों के लिए लागू होता है.
- नमूनों में एंटीबॉडी का उत्पादन एक सैंडविच मानव TECAN स्वतंत्रता EVO पर एलिसा (पियर्स, रॉकफोर्ड, आईएल) का पता लगाने के आईजीजी ® तरल हैंडलिंग प्रणाली से विश्लेषण किया है.
- नमूने और मानक (मानव myeloma के IgG1, रूई) (सिग्मा, सेंट लुइस, MO) पूर्व - लेपित जैव विरोधी मानव कोट आईजीजी परख प्लेट्स (बी.डी. बायोसाइंसेज, सैन जोस, CA) पर भरी हुई थी.
- प्लेटें दो तीन पीबीएस washes के द्वारा पीछा किया घंटे के लिए कमरे के तापमान पर incubated रहे थे.
- ImmunoPure विरोधी मानव आईजीजी (एफसी गामा) एचआरपी (पियर्स, रॉकफोर्ड, आईएल) बकरी 1:2000 कमजोर पड़ने पर थाली करने के लिए जोड़ा गया है और कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए incubated.
- प्लेटों पीबीएस के साथ तीन बार धोया ABTS सब्सट्रेट (पियर्स, रॉकफोर्ड, आईएल) जोड़ने से पहले और पता लगाने के लिए 405 एनएम पर absorbance का उपयोग कर एक थाली पाठक पर पढ़ा गया.
- अत्यधिक उत्पादक क्लोनों का चयन करें और निलंबन संस्कृति में उत्पादकता का मूल्यांकन. खिलाया बैच संस्कृति के लिए, कोशिकाओं 0.3X106 प्रोटीन मुक्त मध्यम JRH तत्काल लाभ में कोशिकाओं / एमएल inoculated थे 65,578 (SAFC बायोसाइंसेज, लीनेक्सा, के एस) के साथ पूरक 5 छ / एल सोया hydrolyzate (DMV इंटरनेशनल, सूची संख्या SE50MAF-UF, बहुत ) नंबर और 37 में incubated ° सी 7.5% सीओ 2 के साथ . संस्कृति जारी रखा और 2 ग्राम / एल ग्लूकोज (सिग्मा, कैटलॉग G8769 संख्या बहुत 098K2329 संख्या) जब ग्लूकोज प्लस संस्कृति में लैक्टेट एकाग्रता 2 जी / एल से नीचे पहुँच गए, और खिलाया 2 मिमी glutamine (Gibco, सूची संख्या 25030 के साथ पूरक थे, बहुत संख्या 568177) जब glutamine के स्तर 200 से नीचे पहुँच गए मिलीग्राम / एल (चयापचयों YSI Bioanalyzer द्वारा मापा). फेड - बैच संस्कृतियों 14 दिन और एंटीबॉडी के उत्पादन पर समाप्त किया गया रिवर्स चरण HPLC द्वारा मापा गया था.
- प्रतिदीप्ति स्वस्थानी (मछली) संकरण 5 में उम्मीदवार द्वारा क्लोन के आनुवंशिक लक्षण वर्णन.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
एंटीबॉडी विकसित करने का एक उदाहरण है उच्च throughput विधि के साथ क्लोन के उत्पादन चित्रा 1 और चित्रा 2 में दिखाया गया है. ट्रांसफ़ेक्ट सेल पूल fluorescently लेबल विरोधी मानव आईजीजी एंटीबॉडी (चित्रा 1 ए) के साथ दाग था, विश्लेषण और बी.डी. FACSAria ™ (चित्रा 1 बी) पर हल. 96 अच्छी तरह से थाली में कॉलोनी गठन CloneSelect Imager ™ (चित्रा 1C) पर imaged किया गया था. सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला कि एकल कॉलोनी होते कुओं से नमूना था और TECAN स्वतंत्रता EVO ® तरल से निपटने प्रणाली (चित्रा 1D) पर एलिसा द्वारा assayed. अत्यधिक उत्पादक क्लोन कोशिकाओं है कि उच्च सतह एंटीबॉडी फ्लोरोसेंट लेबल विरोधी मानव आईजीजी के साथ धुंधला हो जाना द्वारा परिलक्षित स्तर प्रदर्शन से पाए गए. जब प्रारंभिक ट्रांसफ़ेक्ट सेल पूल के दो आबादियों, खिलाया बैच में एक उत्पादकता में एक विशाल अंतर संस्कृति (चित्रा 2) मनाया गया से उत्पन्न क्लोन की तुलना. शीर्ष दो क्लोन उच्च सतह एंटीबॉडी अभिव्यक्ति (पीई उच्च) के साथ सेल की आबादी से उत्पन्न के लिए विशिष्ट उत्पादकता 50-70 से लेकर स्नातकोत्तर / / सेल दिन. जबकि एंटीबॉडी उत्पादकता था ~ 20 / स्नातकोत्तर / दो शीर्ष कम सतह एंटीबॉडी अभिव्यक्ति (पीई कम) के साथ सेल की आबादी से उत्पन्न क्लोन के लिए सेल और दिन. इसके अलावा, FACS छँटाई द्वारा विकसित सेल लाइनों उन है कि पुस्तिका चूना कमजोर पड़ने (चित्रा 3A) के माध्यम से क्लोन किया गया तुलना में एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए सम्मान के साथ और अधिक स्थिर हैं. शीर्ष क्लोन के विशिष्ट उत्पादकता "1 क्लोन", पुस्तिका चूना कमजोर पड़ने द्वारा उत्पन्न से 30 ~ ~ 10 80 सेल दोहरीकरण के लिए संवर्धन के बाद pcd pcd गिरा दिया. दूसरी ओर, शीर्ष सॉर्टिंग, "2 क्लोन" FACS द्वारा उत्पन्न subclone कम से कम 100 कक्ष दोहरीकरण के लिए 20 pcd आसपास विशिष्ट उत्पादकता को बनाए रखने में सक्षम था. स्वस्थानी संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट करके, हम प्रदर्शन एक क्लोन phenotype के एक मिश्रित आबादी के रूप में (85%) एक और phenotype बी (15%). दिखाया इसके विपरीत, FACS क्लोन सॉर्ट किया गया (2 क्लोन) के लिए एक अधिक सजातीय जनसंख्या दिखाया, कोशिकाओं के 99.5% के साथ phenotype साबित (3B चित्रा).
चित्रा 1 चो कोशिकाओं से मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए विनिर्माण सेल लाइनों का विकास . ए) प्रारंभिक ट्रांसफ़ेक्ट सेल पूल के fluorescently लेबल विरोधी मानव आईजीजी एंटीबॉडी के साथ भूतल धुंधला हो जाना. बी) उच्च प्रतिदीप्ति (पीई उच्च) तीव्रता और कम प्रतिदीप्ति तीव्रता (पीई कम) के साथ सेल की आबादी का 96 अच्छी तरह से थाली में छंटनी. सी) कॉलोनी दस्तावेजीकरणदिन से गठन 0 दिन 13 CloneSelect Imager ™ पर पोस्ट बोने. डी) एलिसा द्वारा स्क्रीनिंग क्लोन.
चित्रा 2. भूतल जुड़े एंटीबॉडी स्तर सेल के एंटीबॉडी उत्पादकता के साथ संबद्ध है . उच्च और निम्न फ्लोरोसेंट धुंधला के साथ क्लोन दोनों सेल लाइनों के रूप में विकसित किया गया और खिलाया बैच संस्कृति में मूल्यांकन. बड़ा अनुमापांक और विशिष्ट उत्पादकता प्रत्येक आबादी के ऊपर 2 क्लोन के बीच तुलना की गई.
चित्रा 3 FACS छँटाई उच्च आनुवंशिक एकरूपता और स्थिरता क्लोन प्रदर्शन से उत्पन्न क्लोन. ~ संस्कृति बीतना समय के 80 सेल दोहरीकरण के लिए एंटीबॉडी) एक बैच संस्कृति में उत्पादन और स्थिरता. Δ, क्लोन सीमित कमजोर पड़ने, जहां 2000 कोशिकाओं में कोशिकाओं वरीयता प्राप्त / अच्छी तरह से थे, 1000 अच्छी तरह / कोशिकाओं और 500 / अच्छी तरह से कोशिकाओं के माध्यम से उत्पन्न किया गया था. 
क्लोन 1 / सेल अच्छी तरह से FACS के माध्यम से उत्पन्न किया गया था. बी) transgene एकीकरण साइट चो सेल गुणसूत्र में स्वस्थानी संकरण में प्रतिदीप्त द्वारा की पहचान की है.
Discussion
हम एक स्वचालित विनिर्माण सेल लाइन विकास मंच है कि अत्यधिक उत्पादक क्लोन के अलगाव के लिए सक्षम बनाता है, और मतलब में जबकि clonality और क्लोन स्थिरता सुनिश्चित करता है प्रस्तुत किया. सतह एंटीबॉडी धुंधला की सगाई FACSAria ™ सेल छँटाई के द्वारा पीछा उच्च एंटीबॉडी उत्पादकता के साथ एक क्लोन प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. हमारे परिणाम और अन्य रिपोर्टों 2-4 बताते हैं कि एंटीबॉडी transiently कोशिका की सतह पर प्रदर्शित स्तर सेल की उत्पादकता के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध है. इस प्रकार, एक fluorescein संयुग्मित एंटीबॉडी झिल्ली जुड़े उत्पाद पहचान और उच्च उत्पादकों के अलगाव सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, रिपोर्टर जीन और जेल microdrop प्रौद्योगिकी के coexpression 6-8 FACS द्वारा उच्च उत्पादन क्लोन के चयन की सुविधा इस्तेमाल किया गया है . FACS के माध्यम से उच्च उत्पादन क्लोन अलग करने के अलावा, अन्य प्रौद्योगिकियों के लिए एक ही लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए विकसित किया है. ये सलाखें बायोसाइंस CellSpot तकनीक है कि microspere एंटीबॉडी का पता लगाने प्रणालियों और लेजर स्क्रीनिंग तकनीक का उपयोग करता है के लिए अत्यधिक उत्पादक क्लोन की पहचान के लिए और अवांछित कोशिकाओं, Genetix ClonePix FL और StemCell टेक्नोलॉजीज ClonaCell EasyPick मंच है कि एक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी पहचान प्रणाली का उपयोग कर उत्पादन सेल लाइनों के उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रदर्शन को खत्म करने में शामिल . हम FACS क्लोनिंग विधि सतह जुड़े एंटीबॉडी के स्तर के आधार पर लागू चुना क्योंकि यह आपरेशन के आराम, उत्पादकता और clonality पर चयनात्मकता को जोड़ती है.
TECAN स्वतंत्रता EVO ® तरल हैंडलिंग प्रणाली के रोजगार में काफी स्क्रीनिंग throughput, जो एक बहुत बड़ा सेल पूल से उच्च उपज क्लोन के लिए चयन करने का अवसर प्रदान करते हैं वृद्धि हुई है. HTRF, BioForte ऑक्टेट, HPLC, आदि, जैसे परख के लिए अन्य इंस्ट्रूमेंटेशन उच्च उत्पादकों का चयन और बाहर कम उत्पादकों स्क्रीनिंग के सभी संभव साधन हैं. CloneSelect Imager ™ के साथ क्लोन गठन पर नज़र रखने से, हम आवश्यक दस्तावेज उत्पन्न डिजीटल सेल लाइन के इतिहास के साथ clonality साबित. Clonality आगे आनुवंशिक गुणसूत्र पर एकल transgene एकीकरण साइट विशेषताएँ पुष्टि की है. एक subcloning कदम है, जो आमतौर पर करने के लिए clonality सुनिश्चित करने के लिए लिया जाता है इस तरह से समाप्त किया जा सकता है. यह सेल लाइन के विकास के लिए समय की 4-8 सप्ताह बचा लेगा. सारांश में, गुणवत्ता सेल लाइनों उच्च throughput स्वचालित मंच द्वारा उत्पन्न उच्च उत्पादकता, उत्पादन, स्थिरता और प्रलेखित सेल लाइन का इतिहास है कि बड़े पैमाने पर उत्पादन और वर्तमान नियामक आवश्यकताओं के लिए मांग को पूरा करना चाहिए दिखाया.
Disclosures
इस लेख के लेखक मर्क एंड कं, Inc के कर्मचारियों, जो स्तनधारी सेल लाइनों से प्रोटीन चिकित्सा विज्ञान के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए इस विधि का उपयोग कर रहे हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACS Aria™ Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| CloneSelect™ Imager | Genetix | ||
| TECAN Freedom EVO® liquid handling system | Tecan Group Ltd. |
References
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