Summary
Nous décrivons ici un ensemble d'essais sur la mutation d'ADN qui peuvent être combinés avec le modèle de la levure chronologique durée de vie à étudier les gènes / voies de régulation ou de contribuer à l'instabilité ADN génomique au cours du vieillissement.
Abstract
Les études utilisant le modèle Saccharomyces cerevisiae vieillissement ont découvert des voies durée de vie de régulation qui sont partiellement conservés chez les eucaryotes supérieurs 1-2. La simplicité et la puissance du modèle de la levure de vieillissement peuvent aussi être explorées pour étudier les dommages de l'ADN et la maintenance du génome ainsi que leurs contributions à des maladies au cours du vieillissement. Ici, nous décrivons un système à l'étude des mutations d'ADN dépendante de l'âge, y compris des substitutions de base, cadre-déplacement des mutations, des réarrangements chromosomiques brute, et homologue / homéologues recombinaison, ainsi que l'activité réparation de l'ADN nucléaire, en combinant la durée de vie de la levure chronologique avec l'ADN simples dommages et des essais de mutation. Les méthodes décrites ici devraient faciliter l'identification des gènes / voies qui régulent l'instabilité génomique et les mécanismes qui sous-tendent mutations de l'ADN dépendante de l'âge et le cancer chez les mammifères.
Protocol
Deux modèles ont la durée de vie étant utilisée pour étudier le vieillissement au S. cerevisiae: RLS et CLS. La durée de vie réplicative (bourgeonnement) (SJSR) est basée sur l'observation que les cellules de la levure mère subissent un nombre fini de divisions 3-6. Nous allons nous concentrer sur la chronologie durée de vie (CLS), un modèle basé sur la survie des non-chronologique, divisant la levure en culture ou sur des plaques 7-11. Levures de type sauvage croît de façon exponentielle pendant 10-12 heures dans du dextrose synthétique complet (DDC) moyenne . Lorsque la glycémie diminue, les commutateurs de la levure de fermentation à la respiration, un processus appelé déplacement diauxic. Les cellules continuent de se diviser lentement pendant la phase post-diauxic pendant environ 48 heures avant d'entrer dans G 0 arrestation. Le taux métabolique des cellules reste élevé jusqu'au jour 5-6 (jour 0 est le jour d'inoculation). La viabilité des cellules au cours du temps peut être consulté par le pourcentage de cellules chronologiquement vieillissement, échantillonnés tous les deux jours, ce qui peut sortir G 0 arrestation et former des colonies sur les plaques riches en YPED.
1. Chronologique, la durée de vie de levure (CLS) en culture liquide
- Inoculer une seule colonie dans 1 ml de glucose milieu synthétique complet (DDC, tableau 1) et incuber pendant la nuit avec agitation (220 rpm) à 30 ° C. Trois inoculums provenant de colonies indépendantes devraient être préparés pour chaque souche de fournir des répliques biologiques.
- Diluer la culture une nuit dans un milieu frais DDC (généralement 10 ml) à DO = 0,05 à 0,1 (~ dilution 1:100) et incuber sous agitation (220 rpm) à 30 ° C. Ce point est considéré comme du temps du jour 0 du vieillissement chronologique. Maintenir un ratio de 1:5 de la culture / flacon de volume (10 ml de culture dans 50 ml, ou pour des expériences plus / grande 25 ml de culture dans 125 ml) pour assurer une bonne aération.
- A partir de 3 jours, retirez deux aliquotes de 10 ul du ballon, diluer 10 000 fois à l'eau en autoclave, 10 ul de la culture diluée (soit 10 4 -10) sur YEPD (extrait de levure 1%, 2% bacto peptone, 2% de dextrose , 2% de gélose) plaques et incuber à 30 ° C pendant 48-72 heures avant formant colonies s'unissent (UFC) est compté.
- Jour 3 UFC est considéré comme la survie de 100%. Les facteurs de dilution de la culture du vieillissement dans les jours suivants devraient être ajustés en conséquence pour s'assurer ~ 20-100 colonies dans le dosage de CFU (par exemple, 10 4 -10, -30 10 4, 10 3 -10, etc.) Pour les cellules de type sauvage dans le fond DBY746, la CLS atteigne survie à 1% autour de 11 jours.
Variations du test de viabilité au situ comprennent:
- La restriction calorique (RC) par la limitation du glucose. La dilution de la culture une nuit dans du glucose limitée SC moyennes (comme 0,5 ou 0,05% au lieu de la glycémie standard de 2%) conduisent généralement à la densité de population inférieure de saturation sur trois jours, mais beaucoup étendu moyenne et maximale (10% de survie) la durée de vie 12.
- Pour une extrême CR / famine, lavez le jour 3 culture en phase stationnaire (généralement 10 ml, comme dans l'étape 3 ci-dessus) avec de l'eau autoclavés (remettre les cellules à volume égal d'eau et de spin-down à 2500 rpm pendant 5 min, répéter 3 fois). Cellules Incubationof dans l'eau imite la condition de famine que la levure peut rencontrer dans la nature. Tous les deux jours par la suite, la culture du vieillissement doivent être lavés avec de l'eau à l'autoclave et remis en suspension dans un volume égal d'eau pour éliminer tous les nutriments libérés de lysées cellules mortes. Effectuer test de viabilité par échantillonnage de la culture vieillissement tel que décrit ci-dessus. Cette condition sera conduit à la famine presque un doublement du CLS dire dans le type DBY746 souche sauvage 12.
2. Dans le test de viabilité in situ
Dans la culture liquide, une petite fraction des cellules survivantes peut re-entré dans le cycle cellulaire et de croître en utilisant les nutriments qui restent ou ceux sous forme libérée lysées cellules mortes dans le milieu, un phénotype appelé repousse / haletant 13. Nous avons développé un système de viabilité-sur-une-plaque qui utilise l'auxotrophie de la souche DBY746 (trp1) pour contourner la repousse / haletant problème et permettent également de tester l'effet de l'exposition constante ou privation de nutriments différents stimuli externes ou sur la levure CLS 11. Cette analyse de viabilité de situ imite aussi le modèle réplicative durée de vie tels que les cellules sont constamment exposés à des nutriments en abondance pour toute la durée de l'analyse de cycle de vie.
- Inoculer une seule colonie dans 1 ml de glucose milieu synthétique complet (DDC) et incuber pendant la nuit avec agitation (220 rpm) à 30 ° C. Au moins trois inoculums provenant de colonies indépendantes devraient être préparés pour chaque souche de fournir des répliques biologiques.
- Laissez la culture de se développer à ~ 10 8 cellules / ml (DO 600 = ~ 10), diluer l'eau culturewith autoclave à 100-200 cell/10 ul (habituellement 10 4-dilution) et 1000 cellules/10 ul (10 3 -dilution).
- Plaque deux aliquotes de 10-30 ul de la culture diluée sur une plaque d'abandon tryptophane DDC. Pourr chaque souche, préparer un ensemble de 8 à 20 plaques et étiquetés selon la densité de placage (par exemple, 10 4 fois diluée, la plaque 10 pi ou 10 4 -10, -30 10 4, 10 3 -10, -30 10 3 , etc), qui assurent 10 à 100 colonies peuvent être comptées en prévision de la viabilité a diminué au cours du vieillissement.
- Incuber la plaque fixée à 30 ° C pendant la durée de l'analyse de cycle de vie.
- Le jour de placage et tous les 2 jours par la suite, enlever une plaque et goutte à goutte ajoutez 0,5 ml tryptophane (2 mg / ml) pour permettre aux cellules viables de croître. Incuber la plaque à 30 ° C pendant 48-72 heures supplémentaires. Comptez le nombre de CFU de viabilité sur le jour de l'addition de tryptophane. L'UFC, le jour de placage est considérée comme la survie de 100%.
Variations du test de viabilité au situ comprennent:
- Âge cellules sur gélose (état de famine extrême). Ajouter 1 ml 2x YPED lieu de tryptophane les jours suivants pour permettre la croissance et comptent UFC 14.
- Âge cellules sur des plaques d'abandon tryptophane milieu complet synthétique avec différentes sources de carbone, par exemple, différentes concentrations de glucose (restriction calorique par une limitation de glucose), différentes sources de carbone comme l'éthanol, le glycérol, l'acide acétique 14. Ajouter 1 ml de glucose / solution tryptophane (20% de glucose et de 1mg/ml tryptophane) pour permettre la croissance et le nombre de CFU.
- Autres manipulations des nutriments comme l'azote.
3. Dommages à l'ADN et la fréquence des mutations au cours du vieillissement chronologique
Résistance canavanine (Peut-r) et CAN1 séquençage
Fréquence de mutation spontanée peut être évaluée en mesurant la fréquence de la résistance canavanine (Peut-r) dans les cultures chronologiquement vieillissement. Des mutations dans le CAN1 (YEL063) du gène, qui code pour le plasma arginine permease, rendre les cellules résistantes à l'arginine analogue de L-canavanine.Can colonies r recueillis à différents moments peuvent également être sauvegardés pour l'extraction de l'ADN génomique et le séquençage ultérieur de la CAN1 gène, qui peut fournir des données de spectre de mutation (avec Mutation Surveyor, Softgenetics).
Substitutions de base (Trp + réversions)
Souches avec trp1-289 contiennent une mutation ambre (C403T) dans la séquence de codage TRP1. Mesure de la fréquence des trp1-289 à trp + 15 permet l'estimation des taux de substitution de base au cours du vieillissement chronologique, de la levure.
Cadre de fortune mutations
Le Lys - souche EH150 (MATa, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200, ura3-52, ade2-1o) les ports d'une mutation lys2ΔBgl II qui a été construit en insérant quatre nucléotides de créer un site BglII enzyme de restriction dans le gène de LYS2 . Le résultat 4 changement dans les résultats dans le cadre de lecture ouvert auxotrophie pour la lysine qui peut être renversée par les petits insertion / délétion mutations 16-17.
Brut des réarrangements chromosomiques (RME)
Pour détecter les réarrangements chromosomiques brute (RME), nous avons généré une souche mutante, dans lequel HXT13 (YEL069), codant pour un transporteur d'hexoses hautement redondante, a été perturbée par une cassette URA3 18. HXT13 est situé à 7,5 kb télomérique aux CAN1 sur le chromosome V. Mutations dans les deux CAN1 et URA3 gènes rendent la résistance des cellules à la L-canavanine et 5-fluoro-acide (5FOA), respectivement. Compte tenu de la faible fréquence des mutations ponctuelles qui se produisent dans les deux gènes, l'analyse de la Can r 5FOA fréquence r fournit une estimation de RME qui se traduisent par la perte des deux gènes.
Recombinaison homologue et homéologues
Pour surveiller le niveau d'homologues (100%) et la recombinaison homéologues (91%) au cours du vieillissement chronologique, nous avons généré des mutants dans lesquels plasmides linéarisés (HIS3:: intron-IR-URA3) portant soit 100% répète homologue inversé (RI) (pSR406 ) ou 91% homéologues IRS (pSR407) au niveau du locus HIS3 19. La recombinaison entre l'IRS permet l'expression de la protéine fonctionnelle His3.
- En parallèle à la normale test de viabilité (comme décrit ci-dessus), enlever une quantité appropriée de cellules de la culture du vieillissement,
- pour Can r mutation, commencer par ~ 2x10 7 cellules (200 pi 3 jours de culture);
- pour les trp +, commencez avec ~ 10 8 cellules (500-1000 ul du jour 3 de culture);
- pour Lys + cadre de fortune mutation, commencer avec ~ 10 8 cellules (500-1000 ul du jour 3 de culture);
- pour les RME, commencez avec 2-3x10 8 cellules (2-3 ml de 3 jours de culture);
- pour la recombinaison homologue et homéologues, commencez par & tilde; 5x10 7 cellules (200-500 ul du jour 3 de culture);
- Pellet les cellules avec paillasse centrifugeuse (6000 rpm pendant 5 min).
- Resuspendre les cellules dans 1 ml d'eau autoclavés, et un culot cellulaire nouveau.
- Resuspendre le culot cellulaire dans 100 pl d'eau. Cellules de la plaque,
- pour Can mutation r, sur l'arginine-abandon de synthèse des plaques de milieu complet (DDC-Arg, complété avec 60 ug / ml L-canavanine de sulfate);
- pour Trp + de réversion, le tryptophane abandon plaques (DDC-Trp);
- pour Lys + cadre de fortune mutation, sur la lysine-abandon plaques (DDC-Lys);
- pour les RME, à l'arginine-abandon plaques (DDC-Arg) complété avec 5FOA (1 mg / ml) et la L-canavanine sulfate (60 pg / ml);
- pour la recombinaison homologue et homéologues, sur l'histidine-abandon plaques complété avec du galactose (2%).
- Comptez UFC après une incubation de 3-4 jours à 30 ° C. La fréquence de mutation est normalisée au nombre de cellules viables.
En complément du test de viabilité au situ, dépendant de l'âge Trp + reversion, Lys + cadre de fortune mutation, la recombinaison, ou peut-R peut également être étudiée dans les cellules ans sur une assiette.
- Cellules de la plaque (~ 10 8 cellules / plaque) à Trp-, Lys-, Sa-décrochage, ou L-canavanine synthèse des plaques de milieu complet (tel que décrit ci-dessus).
- Tous les deux jours (ou au point de temps d'intérêt), le score des colonies naissantes.
- Fréquence de mutation est estimé par la normalisation des colonies naissantes au nombre total de cellules viables de la journée spécifique.
4. Synthèse trans (TLS)
L'augmentation âge-dépendante fréquence de mutation peut impliquer une augmentation des dégâts macromolécule, diminuée protection cellulaire / réparation, et l'augmentation réparation de l'ADN erronée (comme Polζ dépendant synthèse trans, TLS) au cours du vieillissement. Par exemple, la longue durée de vie sch9 mutants Δ présentent une expression élevée de la SOD2, et diminution de l'expression de l'enzyme erreurs réparation de l'ADN Rev1 20. Nous décrivons ici un test combinant la matrice d'ADN endommagé et tout extrait nucléaire pour évaluer le TLS in vitro.
- Préparer extrait nucléaire tel que décrit par Wang et al 21;. Quantifier la concentration de protéine par dosage BCA (Pierce).
- Ajouter mg 0, 5, 10 ou 20 d'extraits nucléaires à 50 pi (volume final) contenant des réactions TLS tampon (20 mM HEPES, 7 mM de MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM de NaCl, pH 7,8), 200 et 100 nM μMdNTPs 5'-32 P-12-mère étiqueté amorce (5'-CGA TGG TAC GGA-3 ') recuit à un modèle 48-mer contenant dommages à l'ADN d'intérêt (5'-CTG TCG ATA GTA CTA ATG TCA AAC GAC TXA AGC ACG GTA TCC CCA TCG-3 ', dans lequel X est le site endommagé, par exemple, site abasique, 8-oxo-G, etc.)
- Incuber le mélange à 30 ° C pendant 30 min, arrêter la réaction avec l'ajout de 2,5 ul EDTA (20 mM) et 2 ul de la protéinase K (10 mg / ml).
- Purifier l'ADN avec extraction au phénol et précipitation à l'éthanol.
- Remettre en suspension dans l'ADN 50 pi de tampon de chargement de gel (98% de formamide, 20 mM EDTA, et teinture).
- Résoudre les produits synthèse trans sur des gels de polyacrylamide 19%.
- Quantifier le TLS en utilisant phosphorimaging (figure 1).
5. Les résultats représentatifs
Nous typiquement utilisé l'UFC au jour 3 de 100 pour cent de survie dans l'analyse standard CLS liquide. Le pourcentage de survie dans les jours suivants peuvent être équipés pour calculer la moyenne (50% de survie) et maximum (10% de survie) la vie s'étend sur 12. Les résultats obtenus à partir de la durée de vie de l'au test de viabilité in situ sont généralement cohérents avec ceux utilisant le test de liquide CLS, mais avec réduction de la durée de vie moyenne, qui est dû en partie au fait que les cellules sont constamment exposés aux substances nutritives. Présence de glucose inhibe l'activité de protection cellulaire comme le montre l'transactivation réduite du facteur de transcription de réponse au stress tels que MSN2 / 4 et Gis1 12.
Fréquence de mutation liée à l'âge varie considérablement selon le contexte de contrainte, la manipulation génétique, les conditions de culture, et l'âge. Le tableau 2 montre les résultats typiques obtenus dans la souche de type sauvage (DBY746).
| Composante | g / L |
|---|---|
| D-glucose | 20 |
| Le sulfate d'ammonium | 5 |
| L'azote de base (-AS/-AA) | 1.8 |
| NaH2PO4 | 1.4 |
| mg / L | |
| Adénine | 80 |
| L-arginine | 40 |
| Acide L-aspartique | 100 |
| L-acide glutamique | 100 |
| L-histidine | 80 |
| L-Isoleucine | 60 |
| L-Leucine | 120 |
| L-Lysine | 60 |
| L-Méthionine | 80 |
| L-phénylalanine | 60 |
| L-sérine | 400 |
| L-Thréonine | 200 |
| L-tryptophane | 80 |
| La L-Tyrosine | 40 |
| L-Valine | 150 |
| Uracile | 80 |
Tableau 1. Synthétique milieu glucose complète, la DDC (ajuster à pH 6,0 avec NaOH). 4 fois supérieure de l'histidine, la leucine, le tryptophane, et l'uracile sont inclus afin de compenser l'auxotrophie de la souche DBY746.
| Jour 3 (moyenne ± SEM) | Jusqu'à (au cours du vieillissement) | |
|---|---|---|
| Peut-r | 1,76 ± 0,12 x10 -6 | 6-8 x10 -6 |
| Trp + | 6,60 ± 1,70 x10 -8 | 1,60 x10 -6 |
| Lys + cadre de fortune mutation | 3,00 ± 0,78 x10 -8 | 0,70 x10 -6 |
| RME | 0,62 ± 0,10 x10 -8 | 0,30 x10 -6 |
| La recombinaison homologue | 5,55 ± 2,74 x10 -6 | 27,00 x10 -6 |
| Recombinaison homéologues | 0,12 ± 0,04 x10 -6 | 0,48 x10 -6 |
Tableau 2. Fréquences de mutation typique de cellules de type sauvage (DBY746) au cours du vieillissement chronologique.
Figure 1. Résultat de synthèse trans (TLS) 20. Des extraits nucléaires de 3 jours, âgé de phase stationnaire de type sauvage (DBY746) et sch9 Δ cellules mutantes ont été incubées avec intacts ou abasiques matrices d'ADN contenant un site pendant 30 min à 30 ° C. TLS produits sont indiqués par solides (avec le modèle intact) ou en pointillés (avec gabarit endommagé) lignes. Il n'y avait aucune synthèse trans observée dans l'extrait nucléaire de mutants Δ sch9. Amorces gratuits sont indiqués par une flèche ouverte.
Discussion
Liquid cultures du vieillissement présentent parfois une repousse / phénotype haletant 13, ce qui complique l'analyse CLS. La repousse se produit généralement lorsque plus de 90-99% de la population a perdu sa viabilité. Ce phénotype est souvent associé au stress oxydatif accru et / ou de protection a diminué dans la cellule. Par exemple, la fréquence de ce phénotype fait plus que doubler dans les cellules dépourvues superoxyde dismutase cytosolique et réduit considérablement dans la longue durée de vie des mutants (par exemple, ou sch9 Δ Δ RAS2) ou des mutants surexprimant superoxyde dismutase 22. En pratique, nous définissons la repousse comme une augmentation de la viabilité ou la stabilisation de la viabilité pour les trois prélèvements consécutifs dans la phase de forte mortalité au cours du vieillissement chronologique.
Fonction de l'âge des fréquences des mutations d'ADN varient grandement en fonction du contexte de contrainte, la manipulation génétique, les conditions de culture, ainsi que la repousse / haletant et de survie extrêmement faible. Pré-essais devraient être effectués à des moments tels que la survie moyenne et maximale avec une densité de placage de divers essais sur la mutation de déterminer gamme de fréquence de mutation avant d'échelle d'analyse performingthe durée de vie complet. La souche de type sauvage doit toujours être inclus dans une durée de vie ou étudier la fréquence de mutation en parallèle à tout traitement ou mutants génétiques, telles que les inter-expérience-variations peuvent être comptabilisées. Plusieurs répliques biologiques devraient être inclus dans l'étude, et, à la fois liquide et in situ la viabilité / mutation essais devraient être effectués pour corroborer les résultats.
Au lieu de se concentrer sur un type particulier de mutation de l'ADN, profilage d'une instabilité génomique dépendant de l'âge en utilisant des dosages multiples en combinaison, peuvent faire la lumière sur les dommages d'ADN spécifiques et de système de réparation de l'ADN des dommages (s) qui contribuent à l'instabilité génomique âge-dépendante. Par exemple, une augmentation significative de la brute réarrangements chromosomiques (RME), comparés à ceux des mutations de l'ADN d'autres, est observé dans la levure de type sauvage suggérant une pause brin elevationof double et / ou une déficience des non-homologue fin (NHEJ) au cours de la levure vieillissement chronologique (tableau 2). Le spectre de la mutation CAN1 (séquençage du gène CAN1) obtenu dans la levure de vieillissement de type sauvage a suggéré une augmentation des dommages oxydatifs au cours du vieillissement chronologique et d'erreurs réparation de l'ADN, tandis que, à long vécu mutants Δ sch9, dommages à l'ADN moins oxydatif et beaucoup plus réduite synthèse trans erreurs ont été observées 20.
Les méthodes décrites ici peuvent être encore dépensés pour étudier l'instabilité génomique âge-dépendante. Par exemple, les cellules au repos et non de repos peut être isolé de la levure en phase stationnaire des cultures en utilisant la méthode du gradient de densité décrite par Allen et al. 23. Combiné avec le test de mutation décrit ici, nous avons signalé qu'une grande partie de la fonction de l'âge découle de mutations des cellules quiescentes, plutôt que les diviser, les cellules endommagées ou apoptotiques 20,24.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions S. Robertson Jinks et E. Heidenreich pour fournir des plasmides et des souches de levure; P. Pham et MF Goodman pour aider les withthe TLS dosage. Ce travail a été soutenu en partie par la Fédération américaine pour la recherche sur le vieillissement de subvention et par le NIH AG20642, AG025135.
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