Summary
מסמך זה מדגים שיטות לטיהור בידוד וזיהוי של exosomes, כמו גם טכניקות לניתוח של התוכן המולקולרי שלהם. שיטות אלה להתאמה עבור בידוד exosome משני תרבות התקשורת התא נוזלים ביולוגיים, והוא יכול מעבר ניתוח של התוכן המולקולרי להיות שימושית גם במחקרים תפקודית.
Abstract
תחום המחקר exosome הוא המתרחב במהירות, עם גידול דרמטי הפרסומים בשנים האחרונות. בועיות אלו קטנות (3-10 ננומטר) ממוצא endocytic הוצעו הראשון לתפקד כדרך reticulocytes למגר את הקולטן transferrin תוך התבגרות לתוך אריתרוציטים 1, נקראו מאוחר יותר exosomes. Exosomes נוצרות על ידי ניצני פנימה של המנוח endosomes, ייצור גופי multivesicular (MVBs), והן מתפזרות בסביבה על ידי איחוי של MVBs עם קרום הפלזמה 2. מאז הגילוי הראשון של exosomes, מגוון רחב של תאים הוכחו לשחרר אלה שלפוחיות. Exosomes יש גם זוהה נוזלים ביולוגיים, ובהם רוק פלזמה, האף נוזל שטיפה ו חלב 3-6. יתר על כן, הוכח כי התוכן והתפקוד של exosomes תלוי בתא שמקורם ואת התנאים שבהם הם מיוצרים. מגוון פונקציות כבר שדיםtrated עבור exosomes, כגון אינדוקציה של סובלנות נגד 7,8 אלרגן, מיגור של גידולים הוקמה בשנת 9 עכברים, עיכוב והפעלה של תאים הרוצח הטבעי 10-12, קידום התמיינות לתאי T רגולטוריים 13, גירוי של התפשטות תאים T ו - 14 אינדוקציה של תא T אפופטוזיס 15. שנת 2007 הראינו כי exosomes שוחרר מתאי הפיטום מכילים RNA שליח (mRNA) ו microRNA (מירנה), וכי RNA יכול להיות דילג מתא אחד למשנהו באמצעות exosomes. בתוך התאים הנמען, mRNA דילג על ידי exosomes הוצגה להיות מתורגם לחלבון, דבר המצביע על תפקיד הרגולציה של ה-RNA להעביר 16. יתר על כן, אנו הראו גם כי exosomes מתאי צמח תחת סטרס חמצוני יכול לגרום ללחץ נוסף סובלנות נגד בתאים הנמען ובכך להציע הפונקציה הביולוגית של המעבורת exosomal RNA 17. תרבית תאים מדיה ביולוגית שיתוף נוזליםntain תערובת של שלפוחית ולשפוך שברים. באיכות גבוהה בידוד שיטה exosomes, ואחריו אפיון וזיהוי של exosomes ואת התוכן שלהם, לכן חיוני להבחין בין שלפוחית exosomes וחלקיקים אחרים. כאן, אנו מציגים שיטה הבידוד של exosomes ממדיום שני תאים תרבות נוזלי הגוף. שיטה זו מבוססת על בידוד צנטריפוגה חוזרות צעדים סינון, ואחריו צעד ultracentrifugation הסופית שבה exosomes הם pelleted. שיטות חשוב לזהות את exosomes ולאפיין את המורפולוגיה exosomal ואת תכולת החלבון מודגשים, לרבות במיקרוסקופ אלקטרונים, cytometry זרימה כתם המערבי. טיהור של RNA exosomal הכולל מבוסס על כרומטוגרפיה בעמודה ספין התשואה exosomal RNA והפצה גודל מנותח באמצעות Bioanalyzer.
Protocol
1. Exosome בידוד
- לגדל תאים בינוניים עם סרום exosome חינם. לפיכך, כל סרום נוסף בינוני התרבות התא צריך להיות מדולדל של exosomes ידי ultracentrifugation ב XG 000 120 מעל בלילה 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
- מעבירים את ההשעיה התא צינורות חרוטי.
- צנטריפוגה ב XG 300 במשך 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים.
- מעבירים את supernatant כדי ultracentrifuge צינורות אם לא לגמרי מלא להוסיף PBS.
- צנטריפוגה מדגם XG ב 500 16 20 דקות ב 4 ° C כדי להמשיך להסיר תאים ופסולת התא.
- סינון supernatant דרך 0.2 מיקרומטר לסנן להסיר חלקיקים גדולים יותר מ -200 ננומטר.
- מעבירים את supernatant מסוננות צינורות ultracentrifuge חדשים לאטום את הצינורות לפני ultracentrifuge ב XG 000 120 עבור 70 דקות 4 ° C עד גלולה exosomes.
- בטל supernatant.
- לקבלת אחזור exosome מרבית, resuspend exosome להעשירעורך גלולה שוב ושוב בנפח קטן (~ 3 x 50 μl) של חיץ הולם. חיץ זה תלוי הניסויים במורד הזרם המתוכנן הבא הבידוד exosome. לדוגמה, חיץ תמוגה משמש חלבון בידוד RNA, PBS משמש במיקרוסקופ אלקטרונים ו cytometry הזרימה ועל תפקודי בינוני מחקרים עשויה להיות מועדפת.
הערה: exosomes יכול גם להיות מבודד נוזלי גוף שונים, כגון פלזמה, באמצעות ההליך זהה עבור מדיה תרבית תאים. עבור נוזלים צמיג ייתכן שיהיה צורך לדלל את המדגם עם PBS לפני צנטריפוגה ואת שלב הסינון. ביחס למהירות צנטריפוגה עבור נקודה 5 לעיל, ניתן להגדיל XG 29 500, ואת ultracentrifugation בנקודה 7 יכול להתארך עד 90 דקות 18.
אם המדגם צריך להיות מטוהרים עוד גלולה exosome ניתן צף על שיפוע סוכרוז exosomes יהיה בעיקר ניתן למצוא את השבר representing צפיפות של 1.13-1.19 גר '/ מ"ל 2.
2. זיהוי Exosome על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים
- כדי להמשיך לחסל חלבונים מזהם, resuspend exosome מועשר גלולה ב PBS ו ultracentrifuge ב XG 000 120 עבור 70 דקות 4 ° C מחדש גלולה exosomes.
- קחו aliquot קטן של המדגם עבור בידוד החלבון ומדידה החלבון הכולל. ודא כי רק חלק קטן מתוך המדגם הוא lysed ומשמש למדידת חלבון ולשמור את exosomes שלם, לפתור PBS, נפרד על הקרח או -80 ° C עבור ניסויים נוספים.
- המקום טיפה, כ -10 מיקרוגרם של חלבון exosomal של exosomes שלם resuspended ב-PBS, על Parafilm. ואז, עם מלקחיים, בעדינות עמדה פחמן מצופה ניקל formvar רשת על גבי כל טיפה של 30-60 דקות. להבטיח את הרשת ממוקם בצד ציפוי מול ירידה המכיל exosomes.
- מניחים שלוש טיפות, כל 30 μl, של PBS על tהוא Parafilm ולשטוף את הרשת על ידי ברצף מיצוב הרשת על גבי טיפות של PBS, ולהשתמש בנייר סופג בין. השתמש בנייר סופג בעדינות רק על ידי מחזיק אותו צמוד אל הצד של הרשת, מבלי ליצור קשר עם השטח מצופה.
- תקן את המדגם על ידי הפקדת ירידה של 2% על paraformaldehyde Parafilm והמקום רשת על גבי ירידה במשך 10 דקות.
- חזור על השלב כביסה בנקודה 4, לפני immunostaining עם נוגדן המתאים. נוגדנים הנמצאים בשימוש נפוץ, אנטי CD63 ואנטי MHC Class II. מיקרוסקופ אלקטרונים יכול גם להתבצע ללא immunostaining כמו exosomes ניתן לזהות רק על סמך גודל ומורפולוגיה. עם זאת, אנו ממליצים להעריך את גודל, מורפולוגיה ואת הנוכחות של חלבון קרום עבור אימות חותכת יותר.
- מעבירים את רשת לירידה של 30 μl הנוגדן העיקרי של בחירה דגירה במשך 40 דקות. שטפי ידי חזרה לנקודת 4, אבל להשתמש בסרום שור 0.1% אלבומין PBS במקום PBS לבד.
- חזור על נקודה 7, אבל עם הנוגדן ננומטר זהב 10 משנית שכותרתו ולשטוף עם PBS לבד.
- פוסט לתקן את המדגם על ידי הוספת ירידה של 2.5% ל glutaraldehyde Parafilm ועל דגירה את הרשת על גבי ירידה במשך 10 דקות. חזור על לשטוף בנקודה 4, אבל להשתמש five טיפות של מים deionized במקום שלוש טיפות של PBS.
- ניגודיות המדגם על ידי הוספת ירידה של אצטט uranyl 2% Parafilm ועל דגירה את הרשת על גבי ירידה במשך 15 דקות.
- הטמע את המדגם על ידי הוספת ירידה של מתיל תאית 0.13% ו אצטט uranyl 0.4% ל Parafilm ועל דגירה את הרשת על גבי ירידה במשך 10 דקות.
- הסרת נוזל עודף ידי בעדינות בעזרת נייר סופג, לפני מיצוב הרשת על הנייר עם הצד המצופה כלפי מעלה ולתת לו להתייבש באוויר במשך 5 דקות.
- בדוק את ההכנות עם מיקרוסקופ אלקטרוני או לאחסן את רשתות בתיבת רשת לעבודה בעתיד.
3.אפיון Exosome על ידי זרימת cytometry
כפי exosomes הם קטנים מדי כדי להיות מזוהים על ידי ציוד cytometry זרימת הנוכחי, יש צורך קודם כל לאגד את exosomes כדי חרוזים מצופים נוגדן (איור 1). חרוזים אלה יכולים לרכוש כמוצר מוכנות או עשה במעבדה עם הנוגדן של בחירה. בהתאם למקור הסלולר exosomal, נוגדנים שונים יכולים להיות מצמידים את החרוזים שיכולה להיות בעלי אופי מגנטי או לטקס. בשלב זה אנו משתמשים אנטי MHC Class II או אנטי CD63 חרוזים מצופים בניתוח זה.
- לשימוש של חרוזים "תוצרת בית" נוגדן מצופה, אנו משתמשים 4 חרוזים מצופים גומי מיקרומטר נוגדן נגד CD63. שטפי 25 μl 4 לטקס מיקרומטר חרוזים (30 x 10 6 חרוזים) פעמיים 100 μl MES חיץ, 3 000 XG במשך 15-20 דקות ו redissolve את הכדור בתוך חיץ 100 μl MES. מכינים את תערובת נוגדן המכיל נפח שווה של הנוגדן 12.5 מיקרוגרם עם נפח זהה של חיץ MES. מוסיפים אתחרוזים לתערובת נוגדנים ואת דגירה תחת תסיסה במשך הלילה בטמפרטורת החדר. שוטפים את הנוגדנים חרוזים מצופים שלוש פעמים עם PBS (3 000 XG 20 דקות) ו לפזר את גלולה ב 100 μl של חיץ אחסון (עם ריכוז סופי של 300 000 חרוזים / μl).
- עבור כל דגימה (כל נוגדן), להמשיך עם נפח שווה מינימום של 30 מיקרוגרם של חלבון exosomal (של exosomes שלם לפתור PBS) לכל 100 ~ 000 חרוזים מצופים נוגדן.
- דגירה exosomes וחרוזים, בנפח כולל של 300 μl PBS, מעל בלילה 4 מעלות צלזיוס מתחת תנועה עדינה.
- חסום על ידי הוספת 300 μl של 200 mM גליצין ו דגירה במשך 30 דקות.
- שטפו את exosome-חרוז מתחמי פעמיים חיץ לשטוף (נסיוב 1-3% ב PBS), 600 XG במשך 10 דקות.
- דגירה exosome-חרוז קומפלקסים עם נוגדנים IgG 50 μl בשעה 4 ° C. שטפו את exosome-חרוז מתחמי פעמיים חיץ לשטוף כמתואר בשלב 5.
- הוסף 90 μl חיץ לשטוף ו 10 μlנוגדן הבחירה (רצוי אנטי CD9, אנטי CD63 או אנטי CD81) על exosome-חרוז תסביכים דגירה במשך 40 דקות תחת תנועה עדינה. שטפו את exosome-חרוז מתחמי פעמיים במאגר לשטוף כמתואר בשלב 5.
- הוסף 300 μl חיץ לשטוף ולרכוש נתונים באמצעות cytometry הזרימה.
כפי שנאמר לעיל, חרוזים שונים ניתן להשתמש, כגון חרוזים לטקס כמתואר בפרוטוקול או חרוזים מגנטיים. אם חרוזים מגנטיים משמשים במקום זאת, יש לציין, כי הפרוטוקול שונה במקצת. צעד חסימה (נקודה 4) אין צורך לשטוף את מבוצע על ידי הנחת צינור לעמוד מגנטי במקום צנטריפוגה.
מאגר האחסון המשמש את החרוזים "תוצרת בית" נוגדן מצופים, המכילים 0.1% גליצין ונתרן 0.1% azid ב-PBS, עם pH של 7.2.
חשוב לציין, הקפד להשתמש בסרום מדולדל exosome עבור החיץ cytometry לשטוף לזרום (1-3% בסרום PBS), כדי למנועexosomes בסרום לזהם את הניתוח.
הערה: בעת ביצוע אפיון exosome באמצעות נוגדנים בשילוב חרוזים חשוב להכיר בכך שזה רק subpopulation ספציפי, ספציפי עבור נוגדן המשמש, כי הוא מבודד מאופיין.
4. איתור Exosome על ידי המערב כתם
כתם המערבי היא שיטה מבוססת היטב ואנחנו לא אכנס לפרטים לגבי השיטה עצמה, אלא להתמקד בחשיבות של בידוד חלבון מתאים לפני כתם המערבי נוגדנים שונים בשימוש.
- ממיסים את גלולה exosome במאגר חלבון תמוגה הבחירה pipetting ביסודיות, ואחריו מערבולת-ערבוב. כדי להמשיך lyse exosomes, sonicate המדגם באמבט מים 3 x 5 דקות עם מערבולת, ערבוב בין. לבסוף צנטריפוגות מדגם, 13 000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהעביר את supernatant לצינור Eppendorf חדש.
- Measuמחדש את החלבון הכולל לפי שיטה של בחירה לטעון 20-50 מיקרוגרם חלבון לכל טוב.
- הפרד ולהעביר את החלבונים על ידי אלקטרופורזה בג'ל electroblotting.
- חסום לשטוף את הממברנה לפני ביצוע immunostaining נגד חלבונים מועשר exosomes.
- זיהוי חלבונים ספציפיים על ידי מערכת chemiluminescence הדמיה דיגיטלית ותוכנה ניתוח.
כאשר אין סמנים ספציפיים exosome, חלבונים, כי הם מועשרים ב exosomes, מכל המקורות סלולריים שונים, משמשים בדרך כלל לאיתור exosome. אלה הם חלבונים כגון tetraspanins (למשל CD9, CD63 ו CD81), חלבון cytoskeleton קשור (למשל ezrin) וחלבונים המעורבים multivesicular biogenesis (למשל Tsg101 ואליקס). חלבונים אחרים שהם גם מזוהה בדרך כלל הם exosomes Flotillin, Hsc70 וחלבונים שונים וכו 'ראב עם זאת, ישנם גם חלבונים ספציפיים התא נמצא exosomes כגון A33 (בתאי אפיתל במעי), CD3(ותאי T) ו - MHC Class II (תאים המציגים אנטיגן). לכן, תלוי איזה סוג של תא exosomes משתחררים סמנים לגילוי עשוי להשתנות.
כמו תאים אחרים של התא גם יכול לייצר שלפוחיות, מומלץ נוסף כדי לקבוע את נוכחותם של חלבונים אלו תאים כגון reticulum endoplasmic (למשל calnexin ו Grp78) ואת מנגנוני Golgi (למשל GM130). לפיכך, חוסר חלבונים אלה עולה לא מעט או זיהום של שלפוחית של תאים אחרים במדגם למד.
5. בידוד של RNA ו-RNA exosomal ניתוח
- ממיסים את גלולה exosome במאגר תמוגה RNA של בחירה לבצע מיצוי רנ"א. ערכות שונות RNA בידוד ניתן להשתמש בהתאם הניסויים במורד הזרם, אבל שיטות הטור מבוסס מספק דוגמאות עם ספקטרום רחב יותר של רנ"א. כרגע אנחנו משתמשים miRCURY ערכת בידוד RNA על ידי Exiqon, אבל ערכות אחרים עשויים להיות מתאימים בהתאם scהשאלה ientific בהישג יד.
- בעת ביצוע בידוד RNA חשוב לעבוד בסביבה RNase חופשי. לכן השימוש חומצות גרעין nuclease חינם טיפים פיפטה ולנגב הן הספסל וציוד ללא מזהמים RNases.
- עבור בידוד RNA, באמצעות miRCURY ערכת בידוד RNA, לפזר את גלולה exosome ב 350 μl של פתרון תמוגה ולבצע מערבולת, ערבוב למשך 15 שניות.
- הוסף 200 μl של אתנול 95% ו-מערבולת ערבוב למשך 10 שניות.
- המקום עמודה צינור איסוף והעברת exosomes lysed לעמודה ו צנטריפוגות 1 דקות ב 14 x 000 גרם
- לשטוף שלוש פעמים על ידי הוספת 400 μl של פתרון לשטוף לעמודה המכיל את הרנ"א ואת exosomal צנטריפוגות במשך דקה 1 ב 14 x 000 גרם
- צנטריפוגה העמודה למשך 2 דקות ב 14 000 XG לוודא כי הטור יבש במקום טור יבש בצינור Eppendorf RNase חינם.
- הוסף 50 μl הצפת elution לעמודה ו צנטריפוגות עבור 2 דקות XG 200, ואחריו דקה 1 ב 14 x 000 גרם
- המשך עם RNA בודד או לאחסן אותו -80 ° C.
לאיתור וניתוח של RNA חילוץ exosomal מוחלט, להשתמש 2100 Agilent Bioanalyzer עם Nano 6000 RNA או RNA קיט פיקו 6000. ניתוח הממצאים מראה את התשואה exosomal RNA והפצה גודל.
6. נציג תוצאות
Exosomes הם קטנים מדי כדי להיות מזוהים על ידי שיטות cytometry זמין הזרימה, מחוברים ולכן נוגדן מצופים חרוזים בטרם נותחו (איור 1). כפי exosome-חרוז מתחמי יכול לצבור את cytometry זרימת העלילה יכולה להכיל פיזור של אוכלוסיות שונות, חרוזים יחיד כפול, משולש (איור 2A). החץ מצביע על חרוזים יחיד כי הם ניתחו יותר. CD63 חיובי האוכלוסייה אחד חרוז exosome לעומת שליטה אלוטיפ שלה מוצג איור 2B.
e_content "> בשל גודלו הקטן של exosomes, הם יכולים רק להיות דמיינו ישירות עם מיקרוסקופ אלקטרונים, ולא על ידי מיקרוסקופ אור. מאפיינים מורפולוגיים אופייניים של exosomes מעוצבים סביב 30-100 ננומטר שלפוחית בגודל הממברנה. איור 3 ב, מיקרוסקופית אלקטרונים הצילומים מראים exosomes immunostained (A) עם נוגדן זהב שכותרתו עבור CD63 (מסומן בחץ) ולא immunostained exosomes (B).כדי לקבוע כי הם אכן מבודד שלפוחית exosomes ולהמשיך לאפיין את החלבונים exosomal, כתם המערבי הוא נפוץ. איור 4 מראה היעדר calnexin, סמן reticulum endoplasmic. זה מצביע על זיהום קטן של שלפוחית מ reticulum endoplasmic. יתר על כן, איור 4 מראה את הנוכחות של CD81 ב exosomes, המהווה tetraspanin מועשר בדרך כלל exosomes.
נייד RNA מכילים בעיקרs-RNA ריבוזומלי (rRNA), כפי שניתן לראות שני שיאים בולטים של 18S ו -28 יחידות משנה rRNA בניתוח Bioanalyzer (איור 5A). עם זאת, RNA exosomal נבדלים הפרופיל שלהם כפי exosomes חוסר שתי פסגות rRNA (18S ו -28) והם מועשר ב-RNA קצר כמו mRNA ו מירנה (איור 5 ב).
באיור 1. בשל גודלו הקטן של exosomes (3-10 ננומטר), לא ניתן להבחין בין רעש רקע כאשר ניתח עם cytometry הזרימה. לכן, יש צורך לצרף אותם חרוזים מצופים נוגדנים לפני exosomes מנותחות, אשר לאחר מכן ניתן דמיינו ידי הלייזר.
באיור 2. Exosome-חרוזים מורכבים יכול לצבור עם חרוזים כפולים ומשולשים אחד את השני ויוצרים (A). החץ הוא מפגין את אחד חרוז-exo חלק מהאוכלוסייה אשר מגודרת ומשמש לניתוח נוסף. אוכלוסייה זו יושוו ישירות לשלוט אלוטיפ (מלא אפור שיא) כדי לקבוע נוכחות של מולקולות בממברנה של exosomes. Exosomes CD63 חיובי (שיא לפתוח שחור) מוצגים בתרשים ב.
באיור 3. Micrographs אלקטרונים של exosomes עם מורפולוגיה גודל טיפוסי (40-80 ננומטר) (A ו-B). החץ מצביע על דמות חלקיק הזהב של נוגדן המשני, כדי לוודא exosome זה יש CD63 על פני הקרום שלו.
איור 4. תוצאות המערבי כתם מראה היעדר calnexin reticulum endoplasmic חלבון אבל נוכחות של חלבון מועשר בדרך כלל exosomes, tetraspanin CD81.
איור 5. Bioanalyzer התוצאות מראה נוכחות RNA בתאים (א) ו exosomes (B). חצים מציין את 18S ו -28 יחידות משנה rRNA להציג בתאים. כפי exosomal RNA מכילים RNA גברי קטן rRNA או לא מעט מזוהה exosomes.
Discussion
כאשר לומדים את תוכן מולקולרית ו / או פונקציה של exosomes, חשוב להשתמש באיכות גבוהה בידוד שיטה המספק תשואה המתאים את מידת הנמוך ביותר האפשרי של זיהום. המתודולוגיה המתוארת במאמר זה היא גישה מבוססת היטב לבידוד exosomes וללמוד תוכן RNA שלהם פונקציה ביולוגית. יתר על כן, החשיבות של אפיון של exosomes מבודד, על ידי שילוב של שיטות שונות, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים, cytometry זרימה, ואת כתם המערבי, הוא הדגיש.
כאשר בידוד exosomes, צנטריפוגה בשלב הראשון (300 XG) משמש גלולה תאים שעלולים להיות נוכח ההשעיה תא או נוזל ביולוגי למד. צנטריפוגה השני 16 500 XG צריך להיות חזק מספיק כדי גלולה תאים מתים, פסולת גדולים, גופים אפופטוטיים, אברונים אחרים. לאחר צנטריפוגה זה, פרוטוקולים מסוימים כוללים צעד ננו סינון, אבל כמה Investigators יש נשלל על שלב זה. עם זאת, אנו מדגישים את החשיבות של שברי בביעור ועל שלפוחית גדול יותר מאשר 200 ננומטר, ולכן ממליצים כולל בשלב הסינון. אם בידוד מחמירים יותר יש צורך מסננים 100 ננומטר ניתן להשתמש, אבל שים לב כי אם נוזלי צמיג משמשים, מסננים אלה יכולים בקלות להיות חסום חומר exosomal אבוד. כמו כן, סינון 100 ננומטר עשוי להשפיע על המורפולוגיה של exosomes יתר על כן, אם exosomes הם בקנה מידה גדול יותר הם עלולים ללכת לאיבוד. לפיכך, 200 ננומטר מסננים נראה מתאים בידוד exosome. לאחר סינון, ultracentrifugation המנדט ב XG 120,000 משמש גלולה exosomes. Exosomes ניתן לכבס נוסף עם PBS, חייב חרוזים מצופים נוגדן ורחץ, או דגש על צבע סוכרוז להסיר חלבונים זיהום. עם זאת, זה יכול להיות תהליך מאוד משאב רב אנו טוענים כי לא יהיה צורך בכך, במיוחד אם היקף המדגם המוצא היא קטנה ו / או תוכן o-RNAf exosomes הוא נמוך, כמו צעדים נוספים באופן משמעותי להקטין את חומר נוסף. עם זאת, שוב, אופיו של שלפוחית מבודד צריך להיות מוכח על ידי נוכחות והיעדרות של חלבונים מסוימים.
עד כה, סמן לא חלבון ייחודי לחלוטין exosomes זוהתה כדי לוודא כי המדגם מכיל exosomes ולא שום דבר אחר. כתוצאה מכך, שילוב של שיטות נדרשים לאפיין את exosomes, כולל קביעת גודל ומורפולוגיה של exosomes על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים. כמו כן, טוהר המדגם ניתן לקבוע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, כמו שיטה זו יכולה לספק סקירה של רמת הזיהום של המדגם, למשל עם שלפוחיות גדולות יותר, כגון microparticles, גופים אפופטוטיים או פסולת התא. יתר על כן, התוכן של חלבון exosomes ניתן לקבוע על ידי cytometry זרימה כתם המערבי, ואת השילוב של שני אלה התוצאות שיטות ניתוח של הממברנה הן קשורות (למשל, CD63 וCD81) ו הפנימו חלבונים (למשל Tsg101 ואליקס) של exosomes. זיהוי של חלבונים מועשר exosomes, כגון CD63, Tsg101 ואליקס, והעדר של חלבונים, כגון חלבון endoplasmic reticulum calnexin, אינדיקציה כי exosome מועשר גלולה אכן exosomes ולא שלפוחית לזהם מתוך תאים אחרים של התא.
הפרופיל של RNA כי הוא זוהה exosomes הוא שונה במהותו לזה של RNA נמצא בתאים שלמים. לפיכך, RNA exosomal ונותחו על ידי Bioanalyzer או ג'ל מבוססי RNA גישות ניתוח חוסר שתי פסגות של 18S rRNA ו -28 יחידות משנה, אשר הבולטים בניתוח של רנ"א הסלולר. לפיכך, אנו טוענים כי גילוי של כל כמויות משמעותיות של rRNA במדגם מצביעה על כך RNA הכולל חילוץ הוא לא מוצא exosomal לבד, ולכן כי שיטת הבידוד צריך להיות שיפור איכות מובטחת.
Disclosures
JL היא הבעלים במשותף של פטנט הקשור לניצול exosomes כמו וקטורים להעברת RNA לתאים.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי המועצה למחקר השוודי (K2008-57X-20 676-01-3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 65670 | |
| Quick-seal ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | Depending on the rotor used different tubes are needed. Ti70 (342414), Ti45 (345776) | |
| Quick-Seal Cordless Tube Topper kit | Beckman Coulter Inc. | 358312 | |
| Filtropur Syringe Filter, 0.20μm | Sarstedt Ltd | 83.1826.001 | For viscose fluids and/or large volumes, a Vacuum filtration system, 0.2 μm, from VWR International can be used instead (514-0600). |
| Formvar/carbon coated nickel grids | Ted Pella, Inc. | 1GN200 | |
| Mouse-anti-human CD63 | BD Biosciences | 556019 | Final conc: 0.05μg/μl |
| Isotype control; IgG1κ (MOPC 21) | Sigma-Aldrich | M9269 | Final conc: 0.05μg/μl |
| Anti-Mouse IgG Gold Conjugate, 10 nm | Sigma-Aldrich | G7777 | Final conc: 1% |
| LEO 912AB Omega Electron microscope | Carl Zeiss, Inc. | Or equivalent equipment. | |
| 4μm aldehyd/sulphate latex beads | Interfacial Dynamics | 12-4000 | |
| Antibody for coating of the latex beads | For example anti-CD63 from BD Bioscience (556019) | ||
| Intelli-Mixer RM-2L | ELMI | Or equivalent equipment. | |
| IgG from human serum | Sigma-Aldrich | I4506 | |
| Antibodies for detection | BD Biosciences | For example: PE anti-CD63 (556020)PE anti-CD9 (555372)PE anti-CD81 (555676) Isotype control (555749) | |
| BD FACSAria | BD Biosciences | ||
| Transsonic T 490 DH | ELMA | Or equivalent equipment. | |
| miRCURY RNA Isolation Kit | Exiqon A/S | 300110 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939A |
References
- Pan, B. -T., Johnstone, R. M. Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: Selective externalization of the receptor. Cell. 33, 967-978 (1983).
- Chaput, N., Thery, C. Exosomes: immune properties and potential clinical implementations. Semin. Immunopathol. , 10-1007 (2010).
- Lässer, C. RNA-containing exosomes in human nasal secretions. Am. J. Rhinol. Allergy. 25, 89-93 (2011).
- Caby, M. -P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
- Palanisamy, V. Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes. PLoS ONE. 5, e8577-e8577 (2010).
- Admyre, C. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
- Almqvist, N., Lönnqvist, A., Hultkrantz, S., Rask, C., Telemo, E. Serum-derived exosomes from antigen-fed mice prevent allergic sensitization in a model of allergic asthma. Immunology. 125, 21-27 (2008).
- Prado, N. Exosomes from Bronchoalveolar Fluid of Tolerized Mice Prevent Allergic Reaction. J. Immunol. 181, 1519-1525 (2008).
- Zitvogel, L. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes. Nature. Medicine. 4, 594-600 (1998).
- Ashiru, O. Natural Killer Cell Cytotoxicity Is Suppressed by Exposure to the Human NKG2D Ligand MICA*008 That Is Shed by Tumor Cells in Exosomes. Cancer. Research. 70, 481-489 (2010).
- Liu, C. Murine Mammary Carcinoma Exosomes Promote Tumor Growth by Suppression of NK Cell Function. The Journal of Immunology. 176, 1375-1385 (2006).
- Viaud, S. Dendritic Cell-Derived Exosomes Promote Natural Killer Cell Activation and Proliferation: A Role for NKG2D Ligands and IL-15Rα. PLoS ONE. 4, e4942-e4942 (2009).
- Szajnik, M., Czystowska, M., Szczepanski, M. J., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Tumor-Derived Microvesicles Induce, Expand and Up-Regulate Biological Activities of Human Regulatory T Cells (Treg). PLoS ONE. 5, e11469-e11469 (2010).
- Raposo, G. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996).
- Abusamra, A. J. Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8+ T-cell apoptosis. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 35, 169-173 (2005).
- Valadi, H. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
- Eldh, M. Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA. PLoS One. 5, e15353-e15353 (2010).
- Lässer, C. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9-9 (2011).
